Name: PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Découvrez la fabrication d'échafaudages tubulaires poreux en élastomère biodégradable pour l'ingénierie tissulaire artérielle. Cette méthode combine le conditionnement mécanique dynamique en bioréacteur à flux pulsatile et la culture de cellules musculaires lisses vasculaires pour produire une matrice extracellulaire native fonctionnelle.

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L&#39;auteur remercie le Dr Gao Jin pour la synthèse des PGS, le Dr Peter Crapo pour la discussion fructueuse pour l&#39;installation bioréacteur, les Drs. Mohamed Ezzelarab et Wei Wu pour explantation babouin artères carotides. Cette étude a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health (R01 HL089658).

1. Tubulaire d'échafaudage de fabrication <ol><li> Préparer un tube de verre (longueur = 70 mm, diamètre extérieur = 9,0 mm, épaisseur = 1,0 mm; petites pièces, Miramar, Floride) comme un moule pour échafaud. </li><li> Préparer 1,0 pds / vol% d'acide hyaluronique (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en dissolvant 100 mg de HA dans 10 ml d'eau déminéralisée. Mélanger à l'aide d'un rotateur nuit jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de bulles d'air dans la solution. </li><li> Verser la solution HA 1,0% dans le haut du tube de verre. Laissez couler lentement le long de la paroi intérieure du moule. Retourner sur le tube lorsque la solution atteint le fond du moule en utilisant le rotateur et répétez cette étape jusqu'à ce que la paroi intérieure du moule est uniformément recouvert par la solution. </li><li> Après le revêtement, sec tous les tubes de verre dans l'étuve sous vide à 37 ° C pendant 24 h. </li><li> Broyer et des particules de sel tamis (taille = 25 à 32 um), utilisé comme porogènes. </li><li> Réunir un tube de verre (couché avec à l'intérieur HA solution à 1,0%), un mandrin (en acier inoxydable recouvert par un tube en PTFE), thermorétractable (SH) manche, et l'anneau de PTFE comme décrit précédemment 8. </li><li> Ajouter particules de sel de la taille souhaitée pour le moule en verre à l'aide d'une spatule à travers l'entonnoir en caoutchouc de silicium. Appuyez sur le moule doucement pour assurer une distribution uniforme des particules de sel. Gratter les particules excès de sel sur le dessus du moule en utilisant le côté de la spatule. </li><li> Allumez l'incubateur d'hybridation pour 30 min avant de transférer le moule sel emballé. Éteignez l'incubateur d'hybridation et le sel Mettez-emballés moule dans l'incubateur d'hybridation pour la fusion du sel. </li><li> Retirer les moules de l'incubateur d'hybridation et les sécher dans le four sous vide à 37 ° C pendant 24 h. </li><li> Retirer les moules sel emballé du four sous vide et laissez-les refroidir à température ambiante. Retirez le mandrin en acier inoxydable en le poussant vers le bas avec la tenue de l'anneau en PTFE. Si le mandrin est trop serré pour le moule, utilisez la pince à aiguille pour la retirer. Retirer la bague PTFE du fond du moule. </li><li> Mettez les moules dans le four à 120 ° C pendant 5 min à rétrécir manches SH. Vérifiez si le manchon HS est rétréci. Retirer le manchon HS à partir des moules sel emballé et les laisser refroidir à température ambiante. Gardez les moules dans le dessiccateur jusqu'à ce qu'ils soient utilisés. </li><li> Préparer la solution PGS en dissolvant 3 g de PGS dans 15 ml de tétrahydrofurane (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pour former une masse 20 / solution% vol. </li><li> Ajouter la solution PGS dans la lumière de sel-emballés moules en les déposant en utilisant un spoid dans la hotte Hume. Lean le moule en verre d'environ 45 ° et chute de la solution PGS dans la lumière intérieure avec rotation du moule lentement. Vérifier si la solution PGS descend le long du mur de moisissure. Si endroit sec est observé, ajouter plus de solution. </li><li> Après avoir ajouté la solution PGS, placer les moules dans la hotte Hume pendant au moins 30 min pour l'évaporation du THF. </li><li> Mettez les moules dans le four à vide pour temps de cuisson pré-déterminé (ex. 24 / 36 / 48 h) à 100 mTorr et 150 ° C pour PGS durcissement. </li><li> Après durcissement, enlever les moules et les placer à température ambiante pour refroidir. Tremper chaque moule dans l'eau déminéralisée avec la position verticale lentement. Ne pas les plonger dans l'eau rapidement, car les bulles d'air peut causer la déchirure de l'échafaud. </li><li> Transférer les moules au bain d'eau soigneusement et les placer à un angle de 1 h en utilisant le tube de silicone pour dissoudre HA facilement. Vérifiez si HA est dissous à partir du moule. Si aucun HA est libéré à partir du moule, poussez la fin l'un des échafaudages lentement en utilisant une spatule pour le démoulage. Répétez cette étape à l'autre bout de l'échafaud et secouer le moule avant et en arrière lentement dans l'eau du bain. Vérifiez si l'échafaudage est déplacé à l'intérieur du moule. </li><li> Transfert l'échafaud pour un autre bain d'eau avec agitateur attentivement. Ne pas saisir fermement l'échafaud, qui peut-être craquer l'échafaud. Placez l'échafaud dans le bain d'eau pendant au moins 3 jours à l'évolution de l'eau pour lessiver les particules de sel. </li><li> Après le lessivage des particules de sel, le transfert de chaque échafaudage pour le tube à centrifuger de 15 ml remplie de l'eau désionisée et placez-les dans la boîte de glace sèche pendant 1 h à geler. Mettez des tubes à centrifuger dans le lyophilisateur (toutes les cabines tube doit être ouvert) et de les lyophiliser pendant 2 jours. </li><li> Mettez tous les échafaudages dans le dessicateur avant jusqu'à ce qu'ils soient utilisés. </li></ol> 2. Préparation d'échafaudage pour l'ensemencement cellulaire <ol><li> Sortez échafaudages du dessiccateur et les couper en 25-30mm de longueur. </li><li> Préparer deux bouchons en caoutchouc de silicone (diamètre = 20 mm, épaisseur = 6,35 mm, diamètre du trou du milieu = 3 mm) et de connecter deux tubes en PTFE (diamètre extérieur = 3,97 mm, diamètre intérieur = 2,38 mm, épaisseur = 0,79 mm, longueur = 60 mm et 40 mm) à travers les trous au milieu de chaque bouchon. </li><li> Couper un anneau SH comme 1,5 mm de longueur et de le mettre sur le dessus d'une extrémité de l'échafaud. Poussez une tube PTFE (connecté bouchon de caoutchouc de silicone) dans l'une des extrémités de l'échafaudage comme portion qui se chevauchent plus petit possible. </li><li> Mettez les tubes d'échafaudage et de PTFE dans le four à 120 ° C pendant 10 min à rétrécir anneau de SH. Vérifiez si anneau de HS est rétréci et les échafaudages sont reliés à un tuyau en PTFE fermement. </li><li> Sortez les tubes d'échafaudage et le PTFE et les placer à température ambiante pour refroidir. Mettez l'assemblage tube échafaudage PTFE dans le tube en polycarbonate (diamètre extérieur = 15,5 mm, diamètre intérieur = 9 mm, longueur = 50 mm) comme une chambre de bioréacteur. </li><li> Connectez l'autre extrémité du tube PTFE à l'échafaud comme des étapes 2.3) et 2.4). </li><li> Ajuster deux bouchons en caoutchouc de silicone pour attacher leurs surfaces intérieures aux deux extrémités du tube en polycarbonate. Attachez les deux surfaces extérieures des bouchons en caoutchouc de silicone à deux plaques en alliage d'aluminium (haut et bas, largeur = 20 mm, longueur = 70 mm, épaisseur = 6,35 mm). Mettez deux tiges filetées dans les trous côté de la plaque et fixer le tube en polycarbonate (inclus à l'intérieur d'échafaudage) pour les plaques en serrant la vis écrou de pouce sur la plaque. </li><li> Mesurez la longueur de chaque seedable échafaudage (une longueur entre les anneaux SH deux) et de calculer la surface intérieure (π x diamètre interne x longueur seedable) de chaque échafaudage pour l'ensemencement des cellules. </li><li> Enroulez une unité de chambre bioréacteur avec feuille d'aluminium et stériliser à l'autoclave à 120 ° C pendant 30 min. Stériliser chaque partie (réservoir moyennes, les tubes de la pompe, l'échangeur de gaz, collecteurs, et le pointeau) du bioréacteur à l'autoclave à 120 ° C pendant 30 min et les assembler à l'intérieur du capot de la culture cellulaire. </li><li> Pré-traiter et rincer échafaudages avec une série de perfusions (70, 50 et 25% d'éthanol pendant 1 h, un tampon phosphate salin (PBS; Mediatech, Herndon, VA) pendant 2 h, et un milieu de culture pendant 24 h SMC en utilisant une pompe péristaltique à 1,0 ml / min dans le circuit d'écoulement. </li></ol> 3. Ensemencement de cellules et de la Culture <ol><li> Isoler primaires cellules musculaires lisses artérielles (SMC) de l'artère carotide de juvéniles mâles babouins (Papio anubis) et les caractériser en deux dimensions (2D) et de la culture avant repiquage de semis, comme décrit précédemment 9. </li><li> Développer SMC utilisant le milieu MCDB 131 (Mediatech, Herndon, VA) avec 10% sérum de veau fœtal (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamine (Mediatech), 50 pg / ml d'acide ascorbique (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), et une solution antibiotique-antimycosique (10 000 UI / ml de pénicilline, 10.000 pg / ml de streptomycine, et 25 pg / ml d'amphotéricine B; Mediatech). </li><li> Détachez chaque chambre bioréacteur à partir du circuit d'écoulement dans le bioréacteur. SMC semences (passage 4-6) à l'échafaud avec une densité de 2x10 6 cellules / cm 2 par l'injection de suspension avec seringue de 5 ml dans la lumière d'échafaudages après avoir coupé deux abluminal (entrée) et luminales (sortie) des flux. </li><li> Mettez toutes les chambres de bioréacteur dans l'incubateur d'hybridation à 37 ° C et les faire tourner à 2 tours pendant 4 h pour permettre aux cellules de manière uniforme se répandre dans l'échafaudage. </li><li> Sortez chambres bioréacteur de l'hybridation incubateur rattacher leur départ du circuit du bioréacteur dans la hotte. Transférez tous les système de bioréacteur en incubateur de culture cellulaire. </li><li> Raccordez le tuyau de la pompe (diamètre intérieur = 1,6 mm) pour le cartilage de la pompe péristaltique et charger milieu de culture frais dans le réservoir. Démarrer la perfusion à travers les murs (luminal au abluminal) à 1,0 ml / min pendant 15 min suivi par le flux luminal seulement. </li><li> Augmenter le débit et la pression graduellement de 1,0 ml / min (stress de cisaillement luminal: 1,1 dynes / cm 2) et 20 mmHg du jour 1 au 14,2 ml / min (15,3 dynes / cm 2) et 120 mmHg à 21 jours, respectivement. Changer le tuyau de la pompe (diamètre intérieur = 3,2 mm) au jour 4 et le support une fois par semaine. </li></ol> 4. La récolte de tissus et de préparation des échantillons pour l'analyse de <ol><li> Après culture de 21 jours, arrêter la pompe et les tuyaux de serrage (entrée et sortie) du réservoir à moyen terme. Détachez le tuyau de la pompe à partir du cartilage de pompe péristaltique et système de bioréacteur de transfert dans le capot. </li><li> Pince d'entrée et de sortie de tuyaux de chaque chambre bioréacteur et le détacher de la boucle d'écoulement. Ouvrez la tubulure d'entrée et de préparer une boîte de Petri à la tubulure de sortie pour recueillir milieu de culture à l'intérieur du tube en polycarbonate. Ouvrez le tube de sortie lentement et éliminer le milieu de la chambre. </li><li> Détachez une aiguille de calibre abluminal et silicone luminale de la chambre et détacher les plaques d'aluminium en libérant vis de pouce. Retirer le tube de polycarbonate et de détacher un bout de tissu construire à partir de la tubulure de PTFE. </li><li> Préparez une boîte de Petri remplie de 10 ml de PBS et de détacher l'autre extrémité de la construction du tube PTFE. Mettez de construire dans le PBS et rincer trois fois. </li><li> Couper le construire avec une lame de rasoir que de 5 mm de longueur. Congelez au congélateur à -80 ° C pour le dosage biochimique ou le transférer à 15 tube de centrifugeuse ml remplie avec 5 ml de milieu frais pour les tests mécaniques ou congeler s'enclenchent dans le Tissue-Tek composé température optimale de coupe (Sakura Finetek Inc, Torrance, CA ) pour l'histologie / immunoflucoloration orescence. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Les échafaudages tubulaires PGS ont été fabriqués en utilisant des élastomères biodégradables selon la méthode de fusion du sel (Fig. 1A). Chaque chambre de bioréacteur à condition d'échafaudages avec des flux à la fois luminale et abluminal et pourrait être détaché comme une unité distincte d'une boucle d'écoulement principal (Fig. 1B). Bioréacteur système a été conçu pour la culture des échafaudages quatre à la fois par le contrôle et la surveillance des flux ainsi que la pression (Fig. 1C et D). Schéma de la culture a été bioréacteur Fig. 2. Après le semis SMC, chaque chambre bioréacteur a été tourné à 37 ° C pendant 4 h pour distribuer des cellules de manière uniforme dans le lumen de l'échafaudage. Et puis, le flux pulsatile a été appliquée à des échafaudages jusqu'au jour 14 avec le débit en augmentant progressivement (figure 2A) et de pression (figure 2B). Après 14 jours, débit et la pression reste constante jusqu'à la fin de la culture (jour 21). Morphologie de la surface de l'échafaud PGS a été examinée par microscopie électronique à balayage (MEB). Microscopie électronique à balayage a montré que échafaudage avait murale compatibles épaisseurs (539 ± 18 um) (Fig. 3A) et répartis au hasard macro-et micro-pores sur la surface luminale (figure 3B). Paramètres morphométriques de l'échafaud a été mesuré à partir de microtomographie (micro-CT) et l'analyse d'imagerie. Taille moyenne des pores est de 23,3 ± 3,9 um et l'interconnectivité des pores est de 99,4 ± 0,62%, ce qui signifie que tous les pores sont totalement interconnectés dans échafaud. Porosité mesurée par le déplacement d'éthanol est de 75,6 ± 2,7%. La morphologie cellulaire de la construction PGS a été examinée par MEB (Fig. 4). SMC multicouches complètement recouvert la surface luminale et ils ont été orienté perpendiculairement à la direction du flux. Ces résultats montrent que le conditionnement mécanique de bioréacteur flux pulsatile soutient l'orientation SMC dans l'échafaud. La présence de la matrice extracellulaire (ECM) et de fibres élastiques ont été examinés par coloration H &amp; E et d'élastine autofluorescence (fig. 5). Coloration H &amp; E a démontré que les cellules et les protéines ECM complètement couvert de la lumière du PGS construire. L'élastine autofluorescence ont également montré circonférentiellement organisée fibres élastiques à la surface luminale de la construction. Production de protéines ECM dans les constructions PGS ont été mesurés à partir des dosages biochimiques. L'élastine insoluble et le contenu de collagène ont été de 20,2 ± 9,1 pg / mg de tissu et de 6,3 ± 1,9 pg / mg de tissu, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Échafaudage de fabrication et système de bioréacteur. (A) Schéma d'échafaudage tubulaire fabrication. (B) chambre de bioréacteur. Les échafaudages ont été connectés au tube PTFE, placé dans le tube en polycarbonate, et fixés par des bouchons en caoutchouc de silicone et des plaques en alliage d'aluminium. Chaque chambre dispose de deux voies d'écoulement: flux luminal (par un tube de silicone) et abluminal (par aiguille de la jauge). Système de bioréacteur (C) placé à l'intérieur de l'incubateur. Il comprend réservoir moyennes, le module de pompe péristaltique, l'échangeur de gaz, des capteurs de pression, deux collecteurs (haut et bas), et le pointeau. (D) système de bioréacteur placé à l'extérieur de l'incubateur. Il inclut de surveiller la pression, l'unité de contrôle de flux, système d'acquisition de données, et l'ordinateur. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma de la culture bioréacteur. (A) du protocole de la Culture. (B) appliquée profils de pression à chaque point de temps (jour 1, 4, 7 et 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Morphologie de la surface de l'échafaud PGS. (A) de la Croix-section. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. La morphologie cellulaire de l'ES construire. (A) Lumen. (B) Coupe transversale de 45 coupés °. Les flèches dans les deux chiffres représentent le sens d'écoulement. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Histologie et d'élastine autofluorescence des PGS construire. (A) coloration H &amp; E. (B) autofluorescence élastine correspondant. L: lumière. Grossissement: 40X. Barre d'échelle: 50 um.

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</ol>

La technique de fabrication en utilisant un élastomère biodégradable décrit ici a plusieurs caractéristiques. (1) Nous avons utilisé l&#39;acide hyaluronique (HA) comme un agent de démoulage. Depuis HA est soluble dans l&#39;eau, un échafaudage a été facilement libérée du moule en verre après le trempage dans l&#39;eau. Dans ce rapport, nous avons utilisé 1,0 pds / vol% de la solution HA parce que la concentration est faible (&lt;0,5 pds / vol%) de la solution n&#39;est pas visqueux et s&#39;écoule si vite quand nous la verser sur le dessus du tube de verre. Pour solution HA robe uniformément, nous avons renversé sur le tube de verre lorsque la solution a volé bas au fond du tube et répété cette étape. Ce revêtement HA est un essentiel à notre procédé de fabrication pour la libération des échafaudages finale. (2) Nous avons utilisé thermorétractable (SH) douille pour le maintien des sels dans les tubes de verre. Depuis sels ont été denses dans l&#39;espace entre la paroi interne du tube et le manchon de verre SH, SH manches conservé après le retrait des sels mandrin et anneau de PTFE dans le fond du tube. Nous pourrions supprimer manches HS facilement en mettant le moule dans un four à 120 ° C pendant 5 min, puis obtenir des modèles de sel tubulaire. (3) Nous avons utilisé la méthode de fusion du sel. Il est bien connu que la méthode de fusion du sel peut améliorer l&#39;interconnectivité des pores et les propriétés mécaniques en faisant varier le temps de fusion 10. Par ailleurs, depuis que nous avons utilisé PGS, les macro-pores ont été produits par les particules de sel pendant le processus de lixiviation, tandis que les micro-pores étaient probablement généré par la vapeur du glycérol formé lors de PGS guérir comme nous l&#39;avons décrit précédemment 11. Ainsi, cette méthode a un potentiel pour fabriquer des échafaudages tubulaires poreuses avec des macro-et micro-structures différentes en faisant varier des particules de sel ainsi que PGS guérir condition. Le conditionnement mécanique du bioréacteur a fourni perfusion flux pulsatile (moyenne maximale de débit = 14 ml / min, la contrainte de cisaillement maximale = 15,3 dynes / cm 2, fréquence = 0,5 à 1,7 Hz) et physiologiquement pertinents de pression avec l&#39;échafaudage PGS, qui a conduit à la croissance de SMC et de l&#39;orientation (Fig. 4). Ces résultats sont cohérents avec les études antérieures des rapports cycliques qui s&#39;étendent à cette fréquence et la contrainte de cisaillement augmente la prolifération SMC 12, et la production de protéines ECM 13,14. En plus de la croissance de SMC et de l&#39;orientation, de construire PGS a appuyé la production de protéines ECM, surtout circonférentiellement organisée fibres élastiques (fig. 5) dans les 3 semaines de culture dans le bioréacteur. Certaines études utilisant un échafaudage en élastomère comme une construction de faible diamètre artériel ont démontré une résistance mécanique et la pression d&#39;éclatement comparable à artères natives 15, et l&#39;intégration rapide de SMC dans les échafaudages conformes à l&#39;aide de spinner flacon 16,17, tandis qu&#39;aucune fibres élastiques ont été trouvés dans ces constructions. Nos résultats suggèrent que la distension radiale cyclique du bioréacteur améliorée transduction du signal mécanique plus efficacement à SMC de PGS échafaudage, qui a probablement contribué à l&#39;élastine synthèse et d&#39;organisation. Depuis SMC vasculaires ont été les seules cellules qui produit des protéines ECM dans notre approche, l&#39;endothélium quiescent et d&#39;améliorer la résistance mécanique sont nécessaires pour développer une clinique réussie de petit diamètre construit artérielle. Nous avons signalé que les cellules endothéliales co-cultivées avec SMC a généré une monocouche confluente et soutenu l&#39;expression des protéines phénotype dans nos conditions de culture et le conditionnement mécanique 9. Par conséquent, la base de notre approche décrite ici, la modification des conditions d&#39;expérimentation de co-culture serait une prochaine étape pour améliorer les fonctions de constructions et de générer résultante non thrombogène, robuste et conforme artérielle similaire à construire des artères natives.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Le sel de sodium d&#39;acide hyaluronique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tétrahydrofurane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15 à 100-CV </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Mediatech </td><td> 25 à 005-CV </td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiotiques antimycosiques solution </td><td> Mediatech </td><td> 30 à 004-CI </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21 à 031-CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek composé température optimale de coupe, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

pgs élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Les maladies cardiovasculaires sont l&#39;une des principales causes de mortalité aux Etats-Unis et surtout, de maladie coronarienne augmente avec une population vieillissante et une augmentation de l&#39;obésité. Actuellement, un pontage utilisant des navires autologues, des allogreffes, et greffons synthétiques sont connus en tant que couramment utilisé pour des substituts artériels 2. Toutefois, ces greffes ont des applications limitées lors d&#39;un diamètre intérieur des artères est inférieure à 6 mm en raison de la faible disponibilité, des complications thrombotiques, l&#39;inadéquation de conformité, et la fin de l&#39;hyperplasie intimale 3,4. Pour surmonter ces limitations, l&#39;ingénierie tissulaire a été appliquée avec succès comme une alternative prometteuse pour développer les constructions de petit diamètre qui sont des artères non thrombogène, robuste et conforme. Plusieurs études antérieures ont développé des constructions de faible diamètre artériel avec tri-lamellaire structure, d&#39;excellentes propriétés mécaniques et de la pression d&#39;éclatement comparables à 5,6 artères natives. Bien résistance à la traction élevée et une pression d&#39;éclatement en augmentant la production de collagène à partir d&#39;un matériau rigide ou une feuille de cellules échafaudage, ces constructions avaient encore la production d&#39;élastine et de faible conformité, qui est un problème majeur pour provoquer échec de la greffe après l&#39;implantation. Compte tenu de ces enjeux, nous avons supposé que l&#39;élastomère biomatériau combiné avec climatisation mécanique serait de fournir l&#39;élasticité et la conduite des signaux mécaniques plus efficacement aux cellules vasculaires, qui augmentent la production de matrice extracellulaire et de soutenir l&#39;orientation cellulaire. L&#39;objectif de ce rapport est de présenter une technique de fabrication d&#39;échafaudages poreux tubulaire et d&#39;une climatisation mécanique dynamique pour les appliquer à l&#39;ingénierie des tissus artériels. Nous avons utilisé un élastomère biodégradable, le poly (sébaçate de glycérol) (PGS) 7 pour la fabrication d&#39;échafaudages tubulaires poreuses de la méthode de fusion du sel. Adulte cellules primaires babouin musculaires lisses (SMC) ont été ensemencées sur la lumière d&#39;échafaudages, qui en culture dans notre bioréacteur de flux pulsatile conçus pour 3 semaines. Échafaudages PGS a une épaisseur uniforme et répartis au hasard macro-et micro-pores. Climatisation mécanique de bioréacteur flux pulsatile soutenue SMC orientation et améliorée ECM de production dans des échafaudages. Ces résultats suggèrent que des échafaudages en élastomère et le conditionnement mécanique de la culture bioréacteur peut être une méthode prometteuse pour l&#39;ingénierie tissulaire artérielle.

PGS élastomère échafaudages avec des cellules musculaires lisses vasculaires en culture dans un bioréacteur flux pulsatile peut conduire à prometteurs de petit diamètre artériel construit avec une production ECM natif dans une période relativement courte de la culture.

PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

Les maladies cardiovasculaires constituent l'une des principales causes de mortalité aux États-Unis et, plus particulièrement, la coronaropathie augmente avec le vieillissement de la population et...

Ce vidéo montre comment fabriquer des échafaudages tubulaires poreux et les soumettre à un conditionnement mécanique dynamique pour l'ingénierie tissulaire artérielle. Cette procédure est réalisée en fabriquant d'abord les échafaudages à l'aide d'un élastomère biodégradable et d'une méthode de fusion par assaut. Les échafaudages sont ensuite préparés pour la semence cellulaire et assemblés dans un système de bioréacteur.Dans le bioréacteur, des cellules musculaires lisses vasculaires sont ensemencées sur les supports et cultivées. Quelques semaines plus tard, le tissu est récolté et analysé par microscopie électronique à balayage, coloration hématoxyline-éosine et autofluorescence de l'élastine. Le muscle lisse obtenu est à la fois multicouche et orienté perpendiculairement.L'avantage principal de cette technique, similaire au blanchiment particulat, consiste à utiliser un moule en verre pour fabriquer une structure tubulaire poreuse à base d'acide hyaluronique. Une fois le moule retiré, le moule de support est préparé à partir d'un morceau de tube en verre. Placez le tube dans un support et versez la solution d'acide hyaluronique préparée la veille dans le tube.L'acide hyaluronique s'écoule lentement le long de la paroi intérieure. Lorsqu'il atteint le fond du moule, retournez le moule. Répétez cette étape jusqu'à ce que la paroi intérieure du moule soit uniformément recouverte par la solution.Après le revêtement, sécher tous les moules en verre préparés dans une étuve sous vide à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Habituellement, quatre moules sont préparés simultanément pendant que les moules en verre sèchent. Préparer les versements de particules de sel, broyer et tamiser les particules de sel à une taille de 25 à 32 micromètres.Le lendemain, assemblez le mandrin en verre préparé, le tube en PTFE, la gaine thermorétractable et l'anneau en PTFE. Commencez par insérer le mandrin dans des morceaux de tube en PTFE de 65 millimètres de longueur et faites-les cuire à 120 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant que le PTFE rétrécit, préchauffez un incubateur d'hybridation à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes.Une fois que le tube a entouré les mandrins, faites glisser le manchon thermorétractable sur le mandrin afin qu'il puisse se déplacer librement. Ensuite, placez le mandrin à l'intérieur du moule en verre et fixez l'anneau A-P-T-F-E au bas du mandrin. Vérifiez que l'anneau en PTFE est bien ajusté au fond du moule en verre.Ensuite, à l’aide d’une spatule et d’un entonnoir en caoutchouc de silicone, ajoutez les bouillies de particules de sel dans le moule en verre. Tapez ensuite doucement sur le moule avec la spatule pour assurer une répartition uniforme des particules et retirez l’excès de sel. Éteignez maintenant l’incubateur chauffé et chargez-le rapidement avec les moules remplis de sel ; la fusion du sel s’effectuera au cours des 30 minutes suivantes, après quoi séchez les moules dans une étuve sous vide à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, après refroidissement, retirez le mandrin en acier inoxydable des moules en le poussant vers l'extérieur tout en maintenant la bague en PTFE. Si nécessaire, utilisez une pince brucelles. Ensuite, retirez la bague en PTFE de la base du moule.Ensuite, faites chauffer les moules pour rétracter la gaine et retirez les gaines rétractées des moules. Laissez les moules refroidir jusqu'à leur utilisation et stockez-les dans un dessiccateur sous hotte. À l’aide d’une pipette, inclinez les moules en verre à 45 degrés et déposez goutte à goutte la solution de PGS dans leur lumière interne tout en tournant lentement le moule.Vérifiez si la solution de PGS s'écoule le long de la paroi du moule. S'il y a un endroit sec, ajoutez davantage de PGS. Laissez ensuite l'ÉT s'évaporer sous la hotte pendant au moins 30 minutes. Une fois l'ÉT évaporé, durcissez les moules dans une étuve sous vide.Après un durcissement de vingt-quatre heures, refroidir les moules à température ambiante et les plonger lentement, verticalement, dans de l'eau déionisée à 24 degrés Celsius. Les incliner trop rapidement crée des bulles d'air, qui déchirent la structure. Transférer soigneusement les moules dans le bain d'eau.Positionnez-les en biais à l'aide d'un tube en silicone et laissez l'acide hyaluronique se dissoudre pendant une heure. Si, après une heure, l'acide hyaluronique n'est pas libéré du moule, utilisez alors une spatule, le moule étant toujours immergé, pour repousser lentement l'acide hyaluronique depuis les deux extrémités, puis secouez doucement le moule. Vérifiez à présent que les supports n'ont pas bougé à l'intérieur du moule en verre ; le cas échéant, tirez lentement sur le support à l'aide de pinces pour le libérer du moule.Ensuite, éliminer les particules de sel en transférant soigneusement les échafaudages délicats dans un bain d'eau déionisée sous agitation douce. Cette étape prendra au moins trois jours et nécessite un changement d'eau quotidien. Une fois que tout le sel a été éliminé, transférer chaque échafaudage dans un tube centrifuge de 15 millilitres rempli d'eau déionisée et les congeler pendant une heure dans une boîte à glace sèche. Placer les tubes centrifuges congelés dans un lyophilisateur pendant trois jours, avec les bouchons ouverts.Une fois lyophilisés, conserver les échafaudages dans un dessiccateur jusqu'à leur utilisation. Commencer par découper les échafaudages en morceaux de 25 à 30 millimètres de longueur. Ensuite, préparer deux bouchons en caoutchouc de silicone en faisant passer un tube en téflon (PTFE) à travers les trous centraux de chaque bouchon.Ensuite, découpez des segments de 1,5 millimètre de longueur dans l'anneau HS et faites glisser un segment à une extrémité du support. Insérez un tube en PTFE fixé au bouchon dans la même extrémité du support, avec un recouvrement suffisant pour se situer sous l'anneau HS afin de relier fermement le support au tube, rétractez l'anneau HS dans un four, puis laissez l'ensemble refroidir à température ambiante. Ensuite, un tube en polycarbonate de 50 millimètres, qui sert de chambre de bioréacteur, est glissé par-dessus le support et fixé à la surface intérieure du bouchon en caoutchouc de silicone.Comme précédemment, un autre tube en PTFE et un bouchon sont fixés à l'autre extrémité du support à l'aide d'un anneau hs afin de compléter la chambre. Le second bouchon est attaché à l'autre extrémité du tube en polycarbonate. Ensuite, les surfaces extérieures des bouchons sont fixées à deux plaques en alliage d'aluminium.Insérez deux tiges filetées dans le trou latéral de chaque plaque et fixez les plaques avec des vis à bouton. Fixez l'échafaudage au bioréacteur. Mesurez ensuite la longueur visible de chaque échafaudage, correspondant à la distance entre les deux anneaux hs, puis calculez leurs surfaces internes.Pour la mise en place des cellules. Dans un autoclave, stériliser les chambres, chacune enveloppée individuellement dans du papier d’aluminium, ainsi que chaque composant de l’unité de bioréacteur. Une fois stérilisés, assembler le bioréacteur à l’intérieur d’une hotte de culture cellulaire.Prétraitez et rincez le support à l'aide d'une série de perfusions en utilisant une pompe péristaltique à un millimètre par minute dans le circuit de flux. Commencez par rincer avec de l'éthanol à 70 %, de l'éthanol à 50 %, puis de l'éthanol à 25 %, pendant une heure chacun. Après ces trois rinçages à l'éthanol, effectuez un rinçage au PBS pendant deux heures.Enfin, perfuser le bioréacteur avec le milieu de culture des CML pendant 24 heures, après quoi il est prêt pour l'ensemencement cellulaire et les expériences. Ensuite, suivre les instructions du manuscrit accompagnant pour ensemencer le bioréacteur avec 2 millions de cellules par centimètre carré et, au cours des 21 jours suivants, changer le milieu dans les tubulures et ajuster la vitesse de la pompe. Progressivement, la pression dans le constructus augmentera d'environ quatre millimètres de mercure le premier jour de culture à plus de 100 millimètres de mercure après deux semaines de culture ; après trois semaines de culture, récolter les cellules et les préparer pour analyse selon les indications du manuscrit accompagnant.Ces échafaudages tubulaires en PGS ont été fabriqués par la méthode de fusion du sel. Des micrographies électroniques par balayage ont démontré que tous les échafaudages présentaient des épaisseurs de paroi homogènes et qu'aucun défaut partiel n'était présent au niveau de leurs sections transversales. Des macropores et micropores répartis aléatoirement ont été observés sur la surface luminaire de tous les échafaudages.Après la culture cellulaire, les SMC multilaminaires se sont développés avec une orientation perpendiculaire à la direction du flux. En outre, les cellules et les protéines de DCM ont complètement recouvert la lumière de toutes les structures en PGS. L'autofluorescence de l'élastine a également révélé des fibres élastiques organisées de manière circonférentielle à la surface luminaire de la structure.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment fabriquer un échafaudage tubulaire poreux, observer les cellules et cultiver l'échafaudage à l'aide d'un bioréacteur préconçu.

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Bioengineering

Bioingénierie

Notre groupe a développé un système de culture bioréacteur qui imite les contraintes pulsatiles physiologiques du système cardiovasculaire pour régénérer implantables petit diamètre des greffons vasculaires.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Ce protocole met l'accent sur l'utilisation de la capacité inhérente de cellules souches de prendre exemple sur leur matrice extracellulaire environnante et être amené à se différencier en de multiples phénotypes. Ce manuscrit méthodes étend notre description et la caractérisation d'un modèle utilisant un hydrogel bicouche, composé de PEG-fibrine et le collagène, à la fois co-différencier les cellules souches...

Le façonnage d&#39;une bicouche Hydrogel de contrôler la différenciation ASC

Synthèse et la fabrication de fibres longues électrofilé couvrant une zone de plus grand dépôt par un collecteur nouvellement conçu à partir d'un polymère biodégradable roman nommé poly (glycérol-dodécanoate) (PGD) a été signalé. Les fibres sont capables de soutenir la croissance de cellules dérivées de cellules souches pluripotentes de souris.

Électrofilé Fort échafaudages de poly (glycérol-dodécanedioate) pour l&#39;ingénierie des tissus neuronaux De Souris cellules souches embryonnaires

Ici, nous présentons un protocole pour générer de l'ingénierie tissulaire greffes de vaisseaux qui sont fonctionnels pour le greffage dans des souris en double ensemencement partiellement induite sur les cellules souches pluripotentes (IPFPC) - dérivé des cellules musculaires lisses et l'IPFPC - cellules endothéliales dérivées sur une décellularisée navire échafaudage bioréacteur.

Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris

Les échafaudages pour l’ingénierie tissulaire doivent récapituler le microenvironnement biochimique et biophysique complexe de la niche cellulaire. Ici, nous montrons l’utilisation de fibres de complexation polyélectrolytiques interfaciales comme plate-forme pour créer des échafaudages polymères composites à plusieurs composants avec libération biochimique soutenue.

Les échafaudages composites de fibres interfaciale Polyelectrolyte pour sortie temporellement contrôlée des biomolécules

Un injectable échafaudage d'ingénierie tissulaire composé de poly (N-isopropylacrylamide) de sulfate -graft-chondroïtine (PNIPAAm-g-CS) contenant des microparticules d'alginate a été préparé. La force d'adhérence, des propriétés de gonflement et de biocompatibilité in vitro sont analysés dans cette étude. Les techniques de caractérisation développés ici peuvent être applicables à d'autres systèmes thermogélifiants.

Synthèse de thermogélifiant Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtine Composites Sulfate avec Alginate Microparticules pour le génie tissulaire

Dans ce travail, des échafaudages en poly(acide lactique)/polyéthylène glycol (PLA/PEG) ont été préparés en utilisant une combinaison de mélange à l’état fondu et de lixiviation sélective. La méthode décrite ici a permis de développer des échafaudages à trois couches en contrôlant fortement à la fois la porosité et la taille des pores. Les propriétés mécaniques ont également été évaluées dans un environnement physiologique.

A Facile et écologique Route pour fabriquer poly (acide lactique) Échafaudages avec Graded Pore Taille

Un protocole étape par étape pour les essais non destructifs et longue période suivi le processus de remodelage vasculaire et la dégradation de l’échafaudage en culture en temps réel de biodégradables polymériques axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins avec stimulation pulsatile à l’aide de la tomographie par cohérence optique est décrite ici.

Contrôles non destructifs suivi du développement de dégradable axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Présenté ici est un simple à utiliser, core / coquille, en trois dimensions bioimpression mise en place pour la fabrication en une étape d'échafaudages creux, adapté à l'ingénierie tissulaire de structures vasculaires et autres tubulaires.

Échafaudages d'impression de noyau/coquille pour l'ingénierie tissulaire des structures tubulaires

La reconstruction oesophagienne est une procédure difficile, et le développement d’un oesophage tissulaire qui permet la régénération de la muqueuse et du muscle oesophagiens et qui peut être implanté comme une greffe artificielle est nécessaire. Ici, nous présentons notre protocole pour générer un oesophage artificiel, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteurs, et diverses techniques chirurgicales.

Greffe tissulaire pour la reconstruction oesophagielle circonférence chez les rats

L’objectif de ce protocole est d’exécuter une co-culture dynamique de macrophages humains et de myofibroblastes dans des échafaudages tubulaires électrospunés pour étudier la régénération tissulaire entraînée par les matériaux, à l’aide d’un bioréacteur qui permet le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique.

Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

Découvrez la fabrication d'échafaudages tubulaires poreux en élastomère biodégradable pour l'ingénierie tissulaire artérielle. Cette méthode combine le conditionnement mécanique dynamique en bioréacteur à flux pulsatile et la culture de cellules musculaires lisses vasculaires pour produire une matrice extracellulaire native fonctionnelle.

PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

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