PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

Cette vidéo montre comment fabriquer des échafaudages tubulaires poreux et les soumettre à un conditionnement mécanique dynamique pour l’ingénierie des tissus artériels. Pour ce faire, les échafaudages sont d’abord fabriqués à l’aide d’un élastomère biodégradable et d’une méthode de fusion d’assaut. Les échafaudages sont ensuite préparés pour l’ensemencement cellulaire et assemblés dans un système de bioréacteur.

Dans le bioréacteur, les cellules musculaires lisses vasculaires ensemencent les échafaudages et sont cultivées. Des semaines plus tard, les tissus sont prélevés et analysés à l’aide de la microscopie électronique à balayage, de la coloration h et e et de l’autofluorescence de l’élastine. Le muscle lisse qui en résulte est à la fois multicouche et orienté perpendiculairement.

Le principal avantage de cette technique existant comme le blanchiment particulaire, est d’utiliser le moule en verre pour fabriquer un échafaudage tubulaire poreux et de l’acide hyaluronique. Au fur et à mesure qu’un moule s’efface, le moule d’échafaudage est préparé à partir d’un morceau de tube de verre. Mettez la tubulure dans un support et versez la solution d’acide hyaluronique préparée la veille dans la sonde.

L’acide hyaluronique s’écoule lentement le long de la paroi interne. Lorsqu’il atteint le fond du moule, retournez le moule. Répétez cette étape jusqu’à ce que la paroi intérieure du moule soit uniformément recouverte par la solution.

Après l’enrobage, séchez tous les moules en verre préparés dans un four sous vide à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. En règle générale, quatre moules sont préparés simultanément pendant que les moules en verre sèchent. Préparez les coulées de particules de sel, broyez et SVE les particules de sel à 25 à 32 micromètres.

Le lendemain, assemblez le mandrin de moule en verre préparé, le tube en PTFE, le manchon thermorétractable et l’anneau en PTFE. Tout d’abord, chargez le mandrin dans des tubes en PTFE de 65 millimètres et faites-les cuire à 120 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour rétrécir le PTFE en attendant l’avant-guerre, un incubateur d’hybridation à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes.

Une fois que le tube a enveloppé les mandrins, poussez le manchon thermorétractable sur le mandrin pour qu’il se déplace librement. Placez ensuite le mandrin à l’intérieur du moule en verre et fixez l’anneau A-P-T-F-E au bas du mandrin. Vérifiez que l’anneau en PTFE est bien ajusté au fond du moule en verre.

Ensuite, à l’aide d’une spatule et d’un entonnoir en caoutchouc de silicone, ajoutez des bouillies de particules de sel dans le moule en verre. Ensuite, tapotez doucement le moule avec la spatule pour une répartition uniforme des particules et grattez l’excès de sel. Éteignez maintenant l’incubateur chauffé et chargez-le rapidement Avec les moules remplis de sel, le sel fusionnera au cours des 30 prochaines minutes, après quoi séchez les moules dans un four à vide à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain après refroidissement, retirez le mandrin en acier inoxydable des moules en le poussant vers l’extérieur tout en fixant l’anneau en PTFE. Si nécessaire, utilisez une pince à bec effilé. Retirez ensuite l’anneau en PTFE du fond du moule.

Ensuite, faites cuire les moules pour rétrécir le manchon et retirez les manchons rétrécis des moules. Laissez refroidir les moules jusqu’à ce qu’ils soient utilisés et conservez-les dans une dessiccation dans une hotte. À l’aide d’un compte-gouttes, inclinez les moules en verre à 45 degrés et déposez la solution de PGS dans leur lumière interne tout en faisant pivoter lentement le moule.

Vérifiez si la solution de PGS s’écoule le long de la paroi du moule. S’il y a un endroit sec, ajoutez plus de PGS Laissez maintenant le THF s’évaporer dans la hotte pendant au moins 30 minutes. Une fois que le THF a disparu, faites durcir les moules dans un four sous vide.

Après un durcissement d’une journée, refroidissez les moules à température ambiante et plongez-les lentement et verticalement dans de l’eau déminéralisée à 24 degrés Celsius. Les renverser trop rapidement crée des bulles d’air, qui déchirent l’échafaudage. Transférez soigneusement les moules dans le bain-marie.

Positionnez-les en biais à l’aide d’un tube en silicone, et laissez l’acide hyaluronique se dissoudre pendant une heure. Si, après une heure, l’acide hyaluronique ne s’est pas libéré du moule, alors avec le moule toujours immergé, utilisez une spatule pour pousser lentement l’acide hyaluronique des deux extrémités, puis secouez lentement le moule. Maintenant, vérifiez que les échafaudages n’ont pas bougé à l’intérieur du moule en verre, et si c’est le cas, tirez lentement l’échafaudage avec une pince pour le libérer du moule.

Ensuite, lessivez les particules de sel en transférant soigneusement les échafaudages délicats dans un bain d’eau désionisée en remuant doucement. Cela prendra au moins trois jours et nécessitera que l’eau soit changée quotidiennement Une fois que tout le sel a été lessivé, transférez chaque échafaudage dans un tube à centrifuger de 15 millilitres rempli d’eau déminéralisée et congelez-les dans une boîte à glace sèche pendant une heure. Placez les tubes de centrifugation congelés dans un lyophilisateur pendant trois jours avec les bouchons ouverts.

Une fois lyophilisés, stockez les échafaudages dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Commencez par couper les échafaudages en longueurs de 25 à 30 millimètres. Ensuite, préparez deux bouchons en caoutchouc de silicone en introduisant des tubes en PTFE à travers les trous centraux de chaque bouchon.

Ensuite, coupez des longueurs d’un millimètre et demi d’anneau HS et glissez-les sur une longueur à une extrémité de l’échafaudage. Enfoncez un tube en PTFE fixé au bouchon dans la même extrémité de l’échafaudage avec juste assez de chevauchement pour être sous l’anneau HS afin de connecter fermement l’échafaudage au tube, rétrécissez l’anneau HS dans un four et laissez l’ensemble refroidir à température ambiante. Maintenant, un tube en polycarbonate de 50 millimètres, qui fonctionne comme la chambre du bioréacteur, est glissé sur l’échafaudage et fixé à la surface intérieure du bouchon en caoutchouc de silicone.

Comme auparavant, un autre tube et un bouchon en PTFE sont fixés à l’autre extrémité de l’échafaudage avec un anneau hs pour compléter la chambre. Le deuxième bouchon est fixé à l’autre extrémité du tube en polycarbonate. Ensuite, les surfaces extérieures des bouchons sont fixées à deux plaques en alliage d’aluminium.

Insérez deux tiges filetées dans le trou latéral de chaque plaque et fixez les plaques avec des vis à oreilles. Fixez l’échafaudage au bioréacteur. Mesurez maintenant la longueur visible de chaque échafaudage, qui est la distance entre deux anneaux hs, et calculez leurs surfaces intérieures.

Pour l’ensemencement cellulaire. Dans un autoclave, stérilisez les chambres, chacune enveloppée individuellement dans du papier d’aluminium, ainsi que chaque partie de l’unité du bioréacteur. Une fois stérilisé, assemblez le bioréacteur à l’intérieur d’une hotte de culture cellulaire.

Prétraiter et rincer l’échafaudage avec une série de perfusions à l’aide d’une pompe péristaltique à un millimètre par minute dans le circuit d’écoulement. Commencez par rincer avec 70 % d’éthanol, 50 % d’éthanol, puis 25 % d’éthanol pendant une heure chacun. Faites suivre les trois rinçages à l’éthanol d’un rinçage PBS de deux heures.

Enfin, perfuser le bioréacteur avec un milieu de culture SMC pendant 24 heures, après quoi il est prêt pour l’ensemencement cellulaire et l’expérimentation. Maintenant, en suivant les instructions du manuscrit ci-joint, ensemencez le bioréacteur avec 2 millions de cellules par centimètre carré et, au cours des 21 prochains jours, changez de support de tube et ajustez la vitesse de la pompe. Progressivement, la pression dans la construction augmentera d’environ quatre millimètres de mercure le premier jour de culture à plus de 100 millimètres de mercure après deux semaines de culture, après trois semaines de culture, récoltera les cellules et les préparera pour l’analyse comme spécifié dans le manuscrit d’accompagnement.

Ces échafaudages tubulaires PGS ont été fabriqués par la méthode de fusion au sel. La micrographie électronique à balayage a montré que tous les échafaudages avaient des épaisseurs de paroi homogènes et qu’il n’y avait pas de défauts partiels à leurs sections transversales. Des macropores et des micropores répartis de manière aléatoire ont été observés sur la surface luminale de tous les échafaudages.

Après la culture cellulaire, des CMS multicouches se sont développés avec une orientation perpendiculaire à la direction de l’écoulement. De plus, les cellules et les protéines DCM couvraient complètement la lumière de toutes les constructions PGS. L’autofluorescence de l’élastine a également montré des fibres élastiques organisées circonférentiellement à la surface luminale de la construction.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment fabriquer un échafaudage tubulaire poreux, voir les cellules et l’échafaudage de culture à l’aide d’un bioréacteur préconçu.