Préparation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides pour utilisation comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser, de purifier et de caractériser des complexes contenant des lanthanides qui peuvent être utilisés pour marquer des macromolécules biologiques. Pour ce faire, il suffit de mélanger d’abord le matériau de départ métallique et le ligand tout en contrôlant le pH de la solution. La deuxième étape de la procédure consiste à purifier le complexe résultant à l’aide de la dialyse.

Ensuite, l’absence de métal libre doit être vérifiée. La dernière étape de la procédure est la caractérisation des propriétés du complexe qui sont pertinentes pour l’imagerie. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que les complexes synthétisés se comporteront comme des agents de contraste grâce à des mesures d’activité de relaxation.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’imagerie, telles que la modification du nombre de coordination de l’eau d’un agent de contraste lors de la liaison à une protéine. En général, les personnes qui ont besoin de cette méthode auront du mal à le faire, car le contrôle minutieux du pH rendra le LI inutilisable pour l’éducation biologique. Buda et Sashi feront la démonstration de la dialyse et des mesures d’activité.

Pour commencer la méthanisation à l’aide de sels de lanthanides, il faut d’abord dissoudre un ligand équivalent dans l’eau pour produire une solution de 30 à 265 millimolaires. Le ligand Paraiso Benzyl DTPA est utilisé ici à une concentration de 73 millimolaires. Ensuite, ajustez le pH de la solution de ligand entre 5,5 et sept en ajoutant une molaire d’hydroxyde d’ammonium.

Dans cette vidéo, 0,2 millilitre de la solution molaire d’hydroxyde d’ammonium est utilisé pour dissoudre un à deux équivalents de chlorure de lanthanide dans l’eau pour produire une solution avec une concentration de cinq à 1000 millimolaires. Le chlorure d’eurobium ou le chlorure de gadolinium peuvent être utilisés à des concentrations de 111 millimolaires. Souvent, un excès de métal est utilisé pour mener la ventilation à son terme et par conséquent simplifier la purification.

Ensuite, ajoutez chaque solution de sels de lathan à la solution préparée de ligand tout en remuant. Ajustez maintenant le pH des mélanges réactionnels résultants entre 5,5 et sept en ajoutant 0,2 molaire d’hydroxyde d’ammonium. Ici, un total de 0,5 millilitre de la solution d’hydroxyde d’ammonium à 0,2 molaire est utilisé pour ajuster la solution.

Si le ligand utilisé contient des groupes fonctionnels sensibles à l’acide, ajustez le pH plusieurs fois au cours de cette étape. Assurez-vous de faire preuve de prudence lors de l’ajustement du pH, car si la solution devient trop basique, tous les groupes fonctionnels sensibles aux bases comme l’isothiocyanate seront rendus inutilisables. Pour la conjugaison, surveillez de près la réaction via des mesures de pH.

La réaction est complète lorsque le pH reste constant Pour les ligands sans groupes fonctionnels sensibles aux bases, un calcul qui implique une augmentation du pH peut également être utile. Pour commencer le bilan de dialyse, déterminez la longueur appropriée de la tubulure de dialyse pour contenir le volume de l’échantillon et la longueur supplémentaire pour contenir 10 % du volume de l’échantillon. Suivez ensuite les directives du fabricant pour couper le tube à cette longueur.

Dans cette vidéo, une membrane de coupure de poids moléculaire de 100 à 500 Dalton a été utilisée, mais un tube de coupure de poids moléculaire plus grand peut être utilisé si la conjugaison est effectuée avant la méthanisation, le cas échéant, selon les directives du fabricant, trempez le tube de dialyse coupé et arrosez pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, remplissez un réservoir de dialyse avec de l’eau, qui servira de dialysat. Un bécher d’un litre est utilisé ici.

Le volume du dialysat doit être environ 100 fois supérieur à celui de l’échantillon. Pliez maintenant deux fois une extrémité de la tubulure et fixez la partie pliée avec la pince de fermeture de dialyse. Enroulez l’extrémité de la fermeture avec un élastique pour vous assurer qu’elle reste fermée pendant la dialyse.

Filtrez le mélange réactionnel préalablement préparé à travers un filtre de 0,2 micron. Chargez ensuite le filtrat dans l’extrémité ouverte du tube. Veiller à ne pas déchirer le tube.

Assurez-vous de laisser suffisamment d’espace pour la tête pour fermer le tube. Pliez deux fois l’extrémité ouverte restante du tube, puis fixez-la avec une fermeture et enveloppez la fermeture avec un élastique. Ensuite, fixez un flacon en verre contenant de l’air à la pince à une extrémité du tube de dialyse à l’aide d’un autre élastique.

Fixez ensuite un flacon contenant du sable à l’autre pince. Ces flacons garantissent que la tubulure reste immergée dans le dialysat. Maintenant, placez le tube complet dans le réservoir de dialyse qui contient le dialysat.

Agitez le dialysat à l’aide d’une plaque d’agitation magnétique à une vitesse lente à température ambiante. Assurez-vous que la vitesse d’agitation reste lente et que la solution ne le fait pas. Tourbillon. Changez le dialate trois fois au cours d’une journée.

Dans cette vidéo, la dialation est modifiée à 2,5, 6,5 et 11,5 heures. Laissez la dialyse se poursuivre pendant la nuit pendant un total de 20 à 28 heures. Une fois la dialyse terminée, retirez la tubulure du dialate et ouvrez soigneusement un bouchon pour retirer l’échantillon.

Lavez la tubulure de dialyse trois fois avec de l’eau et combinez les lavages avec l’échantillon. Enfin, retirez l’eau de l’échantillon sous une pression réduite ici. Ceci est accompli par lyophilisation.

L’échantillon est congelé puis placé sur un appareil de lyophilisation. Pour évaluer la présence de métal libre dans l’échantillon, préparez d’abord un tampon d’acétate en dissolvant 1,4 millilitres d’acide acétique dans 400 millilitres d’eau, ajustez le pH à 5,8 avec une molaire d’hydroxyde d’ammonium, puis ajoutez de l’eau pour produire un volume total de 500 millilitres. Dissoudre ensuite 0,3 milligramme de chaque complexe dans 0,3 millilitre de tampon.

Préparez maintenant l’indicateur d’orange xol, qui doit être de 16 micromolaires dans le tampon de pH 5,8. Ajoutez trois millilitres de cette solution indicatrice aux complexes métalliques précédemment dissous. Détecter la présence de métal libre par l’observation d’un changement de couleur de l’indicateur du jaune au violet.

Si vous le souhaitez, la quantité de métal libre peut être quantifiée en créant une courbe d’étalonnage. S’il reste du métal libre, l’échantillon doit être purifié davantage par dialyse ou par chromatographie liquide à haute performance avant la caractérisation. Ensuite, pour déterminer l’indice de coordination de l’eau pour un échantillon d’opium, préparez une solution d’environ un millimolaire du complexe contenant de l’opium dans l’eau, puis une autre solution de la même concentration dans l’oxyde de deutérium.

Avant l’analyse, la solution d’oxyde de deutérium doit être évaporée et dissoute trois fois dans l’oxyde de deutérium pour éliminer l’eau résiduelle, allumer le spectrofluorimètre, ajouter la solution d’eau dans un vétérinaire propre et placer le vétérinaire dans le spectrofluorimètre. Effectuez maintenant l’excitation et les émissions pour déterminer les maxima pour chacun à environ 395 nanomètres, 595 nanomètres respectivement. Ensuite, effectuez une expérience de décroissance temporelle de la phosphorescence en utilisant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission qui viennent d’être déterminées et les paramètres affichés ici.

Répétez cette étape avec une solution d’oxyde de deutérium préparée à partir du graphique des données de désintégration de la luminescence qui viennent d’être obtenues, le logarithme naturel de l’intensité en fonction du temps. La pente de ces lignes est le taux de décomposition. Dans cette vidéo, Microsoft Excel 2007 a été utilisé pour générer les diagrammes logarithmiques naturels à partir des données brutes.

Utilisez les taux de décomposition dans l’équation développée par les hors et les collègues vus ici. Si votre ligand contient des groupes OH ou NH coordonnés au métal, alors l’équation doit être modifiée avant utilisation. Pour déterminer d’abord les mesures de relativité de l’échantillon, sélectionnez le mode d’application souhaité sur l’analyseur de temps de relaxation, soit T un ou T deux.

Ici, le réglage T one est sélectionné. Ensuite, préparez une série d’échantillons contenant différentes concentrations du complexe contenant des lanthanides dans un solvant d’acquiesce. Ici, l’eau est utilisée comme solvant et les solutions de dix, cinq, deux, 0,5, 1,25, 0,625 et zéro.

Les millimolaires sont préparés. D’autres solvants ou tampons peuvent être utilisés, mais il est important d’utiliser le solvant comme blanc. Le volume final de l’échantillon est spécifique à l’instrument utilisé.

Placez un échantillon dans l’instrument et laissez-le reposer pendant cinq minutes pour l’équilibrer avec la température de l’instrument, qui est de 37 degrés Celsius pour l’unité utilisée dans cette vidéo. Déterminez maintenant le temps de relaxation en unités de secondes en ajustant les paramètres du logiciel pour obtenir une courbe exponentielle lisse pour T un ou T deux. Répétez cette opération pour tous les échantillons, y compris le blanc.

Maintenant, calculez l’inverse des valeurs de relaxation T un ou T deux mesurées et tracez-le. Ces valeurs en fonction de la concentration de Lathan et des unités de millimolaires ajustent le graphique avec une ligne droite. La pente de la ligne ajustée est l’activité de détente qui est R un ou R deux pour T un et T deux respectivement.

Nous voyons ici le schéma général de la médiation et de la purification. Ce schéma décrit la procédure générale de méthanisation et les raisons du choix de différentes racines de purification. Ici, nous voyons un graphique représentatif de la décroissance de la luminescence dans lequel le logarithme naturel de la décomposition est tracé en fonction du temps, les pentes des droites générées à partir de courbes similaires requises pour l’eau et les solutions d’oxyde de deutérium sont utilisées avec l’équation un pour déterminer le nombre de coordination de l’eau des complexes contenant de l’opium.

Un exemple représentatif de mesures de livity peut être vu ici, avec une pente de la droite ajustée étant la livité T un de l’échantillon. En plus du nombre de coordination de l’eau et de la caractérisation de la livité décrits dans le protocole, il est également important de caractériser les produits finaux à l’aide de techniques chimiques standard. L’identité du composé peut être obtenue à l’aide de la spectrométrie de masse ; des spectres de masse représentatifs montrant les profils isotopiques diagnostiques des complexes contenant du gadolinium et de l’opium sont présentés ici.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la spectroscopie d’endr HPLC et l’analyse élémentaire peuvent être effectuées pour caractériser davantage les complexes résultants. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser, de purifier et de caractériser des complexes contenant des lanthanides qui peuvent être utilisés pour marquer des macromolécules biologiques.