Name: Préparation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides pour utilisation comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Découvrez la synthèse, la purification et la caractérisation de complexes de lanthanides utilisables comme agents de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique. Cette méthode permet d'étiqueter les macromolécules biologiques.

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Nous remercions les fonds de démarrage de la Wayne State University (MJA), une subvention de la Fondation américaine pour la recherche sur le vieillissement (SMV), et une voie à l&#39;attribution de transition de carrière Indépendance (R00EB007129) de l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et bio-ingénierie de l&#39;Institut national Santé des (MJA).

1. Métallation utilisant LnCl 3 sels <ol><li> Dissoudre le ligand dans l'eau pour produire une solution de 30 à 265 mM. Le ligand 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-diéthylènetriamine pentaacétique acide (p-SCN-Bn-DTPA) a été utilisé dans cette vidéo à une concentration de 73 mM. </li><li> Ajuster le pH de la solution de ligand à entre 5,5 et 7,0 en ajoutant 1 M NH 4 OH. Dans cette vidéo, 0,2 mL de la 1 M solution de NH 4 OH a été utilisé. </li><li> Dissoudre 1-2 équivalents d'LnCl 3 dans l'eau pour produire une solution avec une concentration de 5000-1000 mM. Dans cette vidéo, eucl 3 et GdCl 3 ont été utilisés dans des concentrations de 111 mM. Un excès de métal est souvent utilisé pour conduire la métallation d'achèvement et, par conséquent simplifier la purification. </li><li> Ajouter la solution de LnCl 3 à la solution de ligand tout en remuant. </li><li> Après l'ajout de LnCl 3, ajuster le pH du mélange réactionnel résultant à entre 5,5 et 7,0 par addition de 0,2 M NH 4 OH. Un total de 0,5 mL de l'0,2 M solution de NH 4 OH a été utilisé dans cette vidéo. Si votre ligand contient de l'acide-groupes fonctionnels sensibles, ajuster le pH de multiples reprises au cours de cette étape. ATTENTION - Si la solution devient trop basique, n'importe quelle base de groupes fonctionnels sensibles, comme l'isothiocyanate, sera rendu inutilisable pour la conjugaison. </li><li> Surveiller la réaction via les mesures de pH. La réaction est terminée lorsque le pH reste constant. </li></ol> 2. Bilan pH Raising (non inclus dans cette vidéo, mais bon pour les ligands sans base-groupes fonctionnels sensibles) <ol><li> Ajouter NH4OH concentré au mélange réactionnel pour ajuster le pH à une valeur ≥ 11. Cette étape va précipiter tout métal décomplexé que l'hydroxyde insoluble. </li><li> Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,2 um. Si le mélange réactionnel obstrue le filtre, la centrifugation et de décantation avant la filtration est recommandée. </li><li> Si la dialyse ne sera pas exécutée, éliminer le solvant sous pression réduite (évaporation rotatif ou lyophilisation est recommandé). </li><li> Étapes 2.1 à 2.3 peut être répétée si lanthanides libre reste. </li></ol> 3. Dialyse bilan <ol><li> Couper le tube à dialyse à une longueur appropriée (suivre les directives du fabricant) pour maintenir le volume de l'échantillon, tout en laissant une longueur supplémentaire (environ 10% du volume de l'échantillon). Dans cette vidéo, un 100-500 daltons de poids moléculaire de coupure (MWCO) membrane a été utilisée, mais plus grand tube MWCO peuvent être utilisées le cas échéant, si la conjugaison est effectuée avant métallation. Aussi, les cassettes de dialyse peut être utilisé comme une alternative au tube à dialyse, si désiré. </li><li> Si approprié basé sur les directives du fabricant, faire tremper le tube à dialyse coupées dans l'eau pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Remplir un réservoir de dialyse (un bécher de 1 L a été utilisée dans cette vidéo) avec de l'eau (dialysat). Le volume de dialysat doit être approximativement 100x celle de l'échantillon. </li><li> Pliez une extrémité du tube à deux reprises et sécuriser la partie pliée du tube avec une pince de fermeture de dialyse. Enveloppez la fin de la fermeture avec un élastique afin de s'assurer qu'il reste fermé pendant la dialyse. </li><li> Filtrer le mélange réactionnel à travers un filtre de 0,2 um, et de charger le filtrat dans l'extrémité ouverte du tube en faisant attention à ne pas déchirer le tube. Soyez sûr de laisser un espace suffisant pour la tête près du tuyau. </li><li> Replier l'autre extrémité ouverte du tube à deux reprises, sécurisée avec une fermeture, et envelopper la fermeture avec un élastique comme dans l'étape 3.4. </li><li> Attacher un flacon en verre contenant de l'air à la pince à une extrémité du tube de dialyse en utilisant une bande de caoutchouc. Attacher un flacon contenant du sable à l'autre pince. Ces flacons s'assurer que le tuyau reste immergé dans le dialysat. </li><li> Placez le tuyau dans le réservoir plein de dialyse qui contient dialysat. </li><li> Incorporer le dialysat en utilisant une plaque d'agitation magnétique à une vitesse lente (pas de vortex) à température ambiante. </li><li> Changer le dialysat 3x au cours d'une journée (dans cette vidéo, le dialysat a été changé à 2,5, 6,5 et 11,5 h), et ensuite permettre de poursuivre la dialyse pendant la nuit (pour un total de 20-28 h de dialyse). </li><li> Retirez le tube de dialyse du dialysat et ouvrir avec précaution une fermeture pour retirer l'échantillon. Laver le tube à dialyse 3x avec de l'eau et de combiner les lavages avec de l'échantillon. </li><li> Enlevez l'eau sous pression réduite. La lyophilisation est utilisée dans cette vidéo. </li></ol> 4. Évaluation de la présence de métal libre <ol><li> Dissoudre le complexe de métal dans du tampon acétate (préparation du tampon: dissoudre 1,4 ml d'acide acétique dans 400 ml d'eau, ajuster le pH à 5,8 avec 1 M de NH 4 OH, et ajouter de l'eau pour produire un volume total de 500 ml) et ajouter le xylénol Indicateur d'orange (16 uM dans un tampon pH 5,8). Dans cette vidéo, 0,3 mg de complexe a été dissous dans 0,3 ml de tampon et 3 ml de solution d'indicateur a été ajouté. </li><li>Détecter la présence de métal gratuitement via l'observation d'un changement de couleur de l'indicateur du jaune au violet. </li><li> Si désiré, la quantité de métal libre peut être quantifiée par la création d'une courbe d'étalonnage 1. Alternativement, le colorant arsenazo III peut être utilisé au lieu de xylénol orange 2. Si le métal libre reste, l'échantillon doit encore être purifié par dialyse, une colonne de dessalage, ou la chromatographie liquide haute performance (CLHP) avant de caractérisation. </li></ol> 5. Dosage de l'eau-de coordination nombre (q) <ol><li> Préparer une solution de l'Eu III complexe contenant (~ 1 mM) dans H 2 O et une autre solution de la même concentration dans D 2 O. Avant l'analyse, la D 2 O solution doit être évaporé et dissous dans D 2 O trois fois pour éliminer les résidus H 2 O. </li><li> Ajouter la solution d'eau dans une cuvette propre, et placer la cuvette dans un spectrofluorimètre. </li><li> Effectuer des analyses excitation et d'émission afin de déterminer les maxima pour chaque (~ 395 nm et 595 nm ~, respectivement). </li><li> Effectuer une phosphorescence temps carie expérience en utilisant les paramètres suivants: excitation et d'émission de longueurs d'onde déterminée à partir de l'étape 5.3, d'excitation et d'émission des largeurs de fente (5 nm), le flash de comptage (100), le retard initial (0,01 ms), le délai maximal (13 ms) , incrément de retard et de (0,1 ms). Ces conditions sont appropriées pour la plupart des complexes, mais le délai maximum et les valeurs incrément peut être augmenté ou diminué pour les espèces à temps de décroissance extrêmement longues ou très courtes. </li><li> Répétez l'étape 5.4 avec la solution D 2 O préparé à l'étape 5.1. </li><li> À partir des données de luminescence désintégration obtenu en 5.4 et 5.5, tracer le logarithme naturel de l'intensité en fonction du temps. La pente de ces lignes sont les taux de désintégration (τ -1) (figure 2). Dans cette vidéo, Microsoft Excel 2007 a été utilisé pour générer les parcelles logarithme naturel à partir des données brutes. Utilisez le taux de décomposition dans l'équation développée par Horrocks et ses collaborateurs (éq 1) 3. Si votre ligand contient des groupes OH ou NH coordonnée pour le métal, l'équation doit être modifié avant utilisation 3. </li></ol> EQ 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="Équation 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 1"> 6. Mesures relaxivité <ol><li> Sélectionnez le mode d'application désirée sur l'analyseur temps de relaxation: T 1 (temps de relaxation longitudinal) ou T 2 (temps de relaxation transversale). </li><li> Préparer une série d'échantillons qui contiennent différentes concentrations de Gd III contenant complexe dans un solvant aqueux. Dans cette vidéo, l'eau a été utilisé comme solvant et des solutions de 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625, et 0 mm ont été préparées. Autres solvants aqueux ou des tampons peuvent être utilisés, mais il est important d'utiliser le solvant comme le vide. Le dernier volume de l'échantillon est spécifique à l'instrument qui est utilisé. </li><li> Placer un échantillon dans l'instrument et laisser reposer pendant 5 min pour s'équilibrer à la température de l'instrument (37 ° C dans cette vidéo). </li><li> Déterminer le temps de relaxation (en unités de s) en ajustant les paramètres du logiciel pour obtenir une courbe lisse exponentielle pour T 1 ou T 2 (courbes représentatives de T 1 et T 2 sont présentés dans la figure 3). </li><li> Répétez les étapes 6.3 et 6.4 pour tous les échantillons, y compris le blanc. </li><li> Calculer l'inverse de la mesure T 1 ou T 2 valeurs en unités de s -1. </li><li> Terrain T 1 ou T 2 -1 -1 valeurs par rapport Gd III de concentration (en unités de mm). En raison de la nature hygroscopique du Gd III complexes contenant, confirme la concentration de Gd III en utilisant la spectrophotométrie d'absorption atomique ou spectrométrie de masse à couplage inductif plasma. Monter la parcelle avec une ligne droite. Un tracé représentatif est montré dans la figure 4. </li><li> La pente de la droite d'ajustement est la relaxivité (R 1 ou R 2 pour T 1 et T 2, respectivement) et possède des unités de mm -1 s -1. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Des données représentatives pour les étapes de ce protocole ont été inclus dans les tableaux et figures section. En plus du numéro de l'eau-de coordination et de la caractérisation relaxivité décrites dans le protocole, il est important de caractériser les produits finis en utilisant des techniques chimiques standard. L'identité du composé peut être obtenu en utilisant la spectrométrie de masse, et des spectres de masse représentatives montrant les tendances des isotopes de diagnostic pour D.ieu III - et Eu III complexes contenant sont montrés dans la Figure 5. Par ailleurs, pour les non-Gd III <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 Schéma général d'métallation et de purification:. Schéma illustrant la procédure générale de métallation et de raisons de choisir les routes de purification différent. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 Luminescence intensité intrigue:. Tracé représentatif de le logarithme naturel de l'intensité en fonction du temps de la section 5. Les pentes des lignes générées à partir des courbes similaires acquis pour les solutions d'eau et D 2 O sont utilisés avec une égalisation à caractériser le nombre d'eau-de coordination de l'Eu III complexes contenant. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 courbes de relaxation décroissance temporelle:. Données représentatives pour (à gauche) T 1 et (à droite) T 2 d'acquisition. Les écarts par rapport à ces formes de courbe serait de produire des données fiables. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 Détermination relaxivité:. Un tracé représentatif de 1 / T 1 versus la concentration de Gd III. La pente de la droite d'ajustement est relaxivité et possède des unités de mm -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 Les spectres de masse:. Spectres de masse représentant montrant les tendances des isotopes de diagnostic pour (à gauche) Gd III contenant les complexes et (à droite) Eu III complexes contenant. Les pics noirs représentent la répartition gaussienne isotopes théoriques et les lignes rouges sont les données réelles.

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</ol>

Vu le nombre croissant de publications qui comprennent des agents de contraste à base de lanthanides 4-14, il est important que l&#39;on prend soin dans la préparation, la purification et la caractérisation des produits pour assurer des résultats reproductibles et comparables. Ces complexes sont souvent considérés comme difficiles à purifier et de caractériser par rapport à des molécules organiques en raison de leur nature paramagnétique et la sensibilité d&#39;un groupe fonctionnel qui peut être utilisé pour...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs et appareillage </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Eucl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203 254-5G </td></tr><tr><td> p-SCN-Bn-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> hydroxyde d&#39;ammonium </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Membrane de dialyse Spectra / Por Biotech ester de cellulose (CE) - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG unités de filtration </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xylénol orange, sel tétrasodique </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> l&#39;acide acétique </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> purificateur d&#39;eau </td><td> ELGA </td><td> PURELAB Ultra </td></tr><tr><td> chromatographie liquide haute performance et spectrométrie de masse </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> analyseur temps de relaxation </td><td> Bruker </td><td> mq60 Minispec </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre UV-VIS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> lyophilisateur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pH-mètre </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> spectrofluorimètre </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Calculateur de poids moléculaire la version 6.46 par Matthew Monroe, téléchargé 17 Octobre, 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Calculatrice Poids Moléculaire </td></tr></tbody></table>

préparation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides pour utilisation comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate basée sur les ligands sont couramment utilisés pour chélater les ions lanthanides, et les complexes qui en résultent sont utiles comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique (IRM). Beaucoup de ligands disponibles dans le commerce sont particulièrement utiles car ils contiennent des groupes fonctionnels qui permettent de rapides et de haute pureté et à haut rendement conjugaison à des macromolécules et des biomolécules par des amines réactives esters activés et des groupes isothiocyanate ou thiol-réactive maléimides. Bien métallation de ces ligands est considérée comme connaissance commune dans le domaine de la chimie bioconjugaison, de subtiles différences dans les procédures de métallation doivent être prises en compte lors du choix des matériaux métalliques de départ. Par ailleurs, de multiples options pour la purification et la caractérisation existent, et la sélection de la procédure la plus efficace dépend en partie de la sélection des matières premières. Ces subtiles différences sont souvent négligés dans les protocoles publiés. Ici, notre but est de démontrer des méthodes communes de métallation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides qui peuvent être utilisés comme agents de contraste pour l&#39;IRM (figure 1). Nous espérons que cette publication permettra aux chercheurs en sciences biomédicales à intégrer les réactions de complexation de lanthanides dans leur répertoire de réactions couramment utilisé par l&#39;assouplissement de la sélection des matières premières et des méthodes de purification.

Nous démontrons la métallation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides. Les complexes décrites ici peuvent être conjugués à des macromolécules pour permettre le suivi de ces molécules en utilisant l&#39;imagerie par résonance magnétique.

Préparation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides pour utilisation comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique

Les ligands à base de polyaminopolycarboxylates sont couramment utilisés pour chélater les ions lanthanides, et les complexes ainsi obtenus sont utiles comme agents de contraste pour ...

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser, purifier et caractériser des complexes contenant des lanthanides pouvant être utilisés pour marquer des macromolécules biologiques. Cela est réalisé en mélangeant d'abord le matériau de départ métallique et le ligand tout en contrôlant le pH de la solution. La deuxième étape de la procédure consiste à purifier le complexe obtenu par dialyse.Ensuite, il convient de vérifier l'absence de métal libre. La dernière étape de la procédure consiste à caractériser les propriétés du complexe pertinentes pour l'imagerie. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que les complexes synthétisés se comporteront comme des agents de contraste grâce à des mesures d'activité de relaxation.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'imagerie, comme de savoir si le nombre de coordination de l'eau d'un agent de contraste change lors de sa liaison à une protéine. En général, les personnes ayant besoin de cette méthode éprouveront des difficultés, car un contrôle insuffisant du pH rendra l'IL inutilisable pour l'enseignement biologique. La démonstration de la dialyse et des mesures d'activité s

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Dans cette vidéo, nous montrons comment étiqueter cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec du chlorure de manganèse...

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Pour démontrer l'imagerie moléculaire du cancer MR avec un petit peptide agent de contraste IRM spécifique aux protéines de plasma coagulé dans le stroma de la tumeur dans un modèle de cancer de la prostate de la souris ciblé.

M. imagerie moléculaire du cancer de la prostate avec un agent de contraste ciblé Petit moléculaire CLT1 Peptide

Ce protocole décrit la synthèse de nanoparticules de bleu de Prusse biofonctionnalisées et leur utilisation en tant qu’agents d’imagerie moléculaire multimodale. Les nanoparticules ont une conception cœur-coquille où les ions gadolinium ou manganèse à l’intérieur du noyau de la nanoparticule génèrent un contraste IRM. La coquille biofonctionnelle contient des fluorophores pour l’imagerie de fluorescence et des ligands de ciblage pour le ciblage moléculaire.

Biofunctionalized bleu de Prusse nanoparticules pour l&#39;imagerie moléculaire multimodale Applications

Ce protocole décrit la préparation et la caractérisation d'une imagerie par résonance magnétique (IRM), l'agent de contraste dendrimère qui porte des chelates macrocycliques à base Cyclen coordinants des ions paramagnétiques de gadolinium. Dans une série d'expériences d' IRM in vitro, cet agent a produit un signal d' IRM amplifié par rapport à l'analogue monomère disponible dans le commerce.

Préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des agents de contraste à base de dendrimères pour imagerie par résonance magnétique

Ici, nous décrivons un protocole de radiomarquage et de test in vivo de dérivés tridentés de chélate-tétrazine de Tc(I) 99mpour le pré-ciblage et la chimie bioorthogonale.

Préparation et évaluation des<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marquée tridenté chélates de pré-ciblage utilisant Bioorthogonal Chemistry

L’utilisation de molécules polydésoxynucléotidiques (44-mères aptamères) pour détecter l’ion gadolinium(III) non chélaté dans une solution aqueuse est décrite. La présence de l’ion est détectée via une augmentation de l’émission de fluorescence du capteur.

Un capteur basé aptamère pour non chélaté Gadolinium (III)

Un protocole est présenté pour la synthèse de nanocristaux coeur-écorce dopé lanthanide upconversion (UCNs) et leurs applications cellulaires pour la régulation des protéines canaux à lumière éclairage de proche infrarouge (NIR).

Synthèse de noyau-enveloppe dopé Lanthanide Upconversion nanocristaux pour des Applications cellulaires

Des procédures de fabrication pour ion lanthanide hautement magnétiquement sensibles polymoléculaire assemblées de chélation sont présentés. La réponse magnétique est dictée par la taille de l’Assemblée, qui est adaptée par extrusion à travers des membranes nanopore. Assemblées alignability magnétique et changements structurels induits par la température sont surveillées par des mesures de la biréfringence, une technique gratuite à résonance magnétique nucléaire et de la diffusion des neutrons...

Des procédures de fabrication et des mesures de biréfringence pour concevoir Ion Lanthanide magnétiquement sensibles phospholipides assemblées de chélation

Nous présentons ici un protocole pour obtenir68Ga dopée à base d’oxyde de fer nanoparticles via rapide axée sur les micro-ondes synthèse. La méthode rend PET / (T1) MRI nanoparticules avec radiomarquage efficacité supérieure à 90 % et la pureté radiochimique de 99 % dans une synthèse de 20 min.

Synthèse de 68Ga dopée à base d’oxyde de fer nanoparticules pour tomographie par émission de double/imagerie de résonance magnétique (T1)

Pour l'évaluation de nouvelles thérapies de cellules souches, il est important de suivre de manière non invasive des cellules injectées in vivo. Cette vidéo va vous montrer comment étiqueter cellules souches mésenchymateuses humaines et embryonnaires avec des agents de contraste à base d'oxyde de fer in vivo pour subséquentes IRM in vivo.

Étiquetage CSEh et hMSCs d&#39;oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in ​​vivo avec IRM

Découvrez la synthèse, la purification et la caractérisation de complexes de lanthanides utilisables comme agents de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique. Cette méthode permet d'étiqueter les macromolécules biologiques.

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