Biofunctionalized bleu de Prusse nanoparticules pour l'imagerie moléculaire multimodale Applications

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser des nanoparticules de bleu de Prusse biofonctionnalisées pour l’utilisation d’agents d’imagerie moléculaire multimodaux. Ceci est accompli en synthétisant d’abord des nanoparticules de bleu de Prusse qui contiennent des ions gadolinium ou manganèse, qui améliorent le signal IRM. La deuxième étape consiste à fixer de l’avadon fluorescent à la surface des nanoparticules, ce qui confère une capacité d’imagerie fluorescente.

Ensuite, les nanoparticules enrobées d’avadon sont biofonctionnalisées avec la cellule souhaitée ciblant les anticorps biotinylés. Une dernière étape consiste à effectuer un contrôle de qualité sur les nanoparticules biofonctionnalisées en mesurant leur taille, leur potentiel zêta et leur stabilité temporelle. En fin de compte, les nanoparticules biofonctionnalisées sont utilisées dans des applications d’imagerie moléculaire multimodale pour visualiser une population ciblée spécifique de cellules au sein d’un mélange à l’aide de l’imagerie par fluorescence et de l’IRM.

Les agents d’imagerie commerciaux actuels sont généralement monomodes et n’offrent une résolution qu’au niveau anatomique. Les nanoparticules de bleu de Prusse combinent deux modes d’imagerie complémentaires, l’IRM et la fluorescence, et permettent l’imagerie moléculaire et les niveaux subcellulaires. Les applications des nanoparticules multimodales s’étendent au diagnostic du cancer et des maladies inflammatoires en plus du suivi de leurs réponses au traitement.

En effet, les nanoparticules biofonctionnalisées peuvent cibler et se lier à une population de cellules dans une région spécifiée du corps. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du diagnostic du cancer et des maladies inflammatoires et de la réponse au traitement, elle peut également être appliquée à d’autres conditions pathologiques qui bénéficieront de la sensibilité et de la spécificité de l’imagerie moléculaire. En utilisant la fluorescence et l’IRM, nous avons eu l’idée de produire ces nanoparticules pour la première fois lorsque nous avons déterminé que le bleu de Prusse et l’agent approuvé par la FDA pour la consommation orale humaine pouvaient être synthétisés de manière stable à l’aide d’un schéma de synthèse en une seule partie et robustement biofonctionnalisés à l’aide de techniques de bioconjuguation standard.

Pour commencer, préparez une solution de 5 millions molaires d’hexa sano ferrate de potassium deux dans cinq millilitres d’eau désionisée pour faire la solution A suivante solution de réparation B contenant 2,5 millimolaires de fer, trois chlorures et 2,5 millimolaires de manganèse. Deux chlorures dans 10 millilitres d’eau déminéralisée pour la synthèse de nanoparticules de manganèse bleu de Prusse. D’autres nanoparticules peuvent être synthétisées comme indiqué dans le protocole de texte : transférer la solution B vers A, fiole à fond rond et agiter la solution à 1000 tr/min à température ambiante.

À l’aide d’une pompe péristaltique, ajoutez la solution, A goutte à goutte dans le récipient à un taux de 10 millilitres par heure. Une fois l’ajout de la solution A terminé, remuez le mélange à 1000 tr/min pendant 30 minutes supplémentaires. Transférez ensuite un millilitre d’aliquotes du mélange dans des micro-tubes à centrifuger et ajoutez 0,2 millilitre de chlorure de sodium dans chaque tube.

Centrifugez les tubes à 20 000 fois G pendant au moins 10 minutes, puis retirez soigneusement le supinate, en laissant la pastille de nanoparticules. Ensuite, ajoutez un millilitre d’eau déminéralisée à chaque granulé. Utilisez un micro-embout pour suspendre les nanoparticules uniformément dans la solution par sonication.

Lavez les nanoparticules au moins trois fois de plus pour éliminer les composants de la réaction initiale de la suspension après le dernier essorage, suspendez à nouveau les nanoparticules dans un millilitre d’eau déminéralisée après avoir recouvert les nanoparticules d’une tanière fluorescente comme décrit dans le protocole de texte, retirez les stocks d’anticorps biotinylés du réfrigérateur. Ici. Utilisez l’antigène glial antineuronal deux et l’éotaxine 3 anti-humaine. Transférez l’anticorps biotinylé dans un filtre micro-fuge en nylon de 0,2 micro, puis centrifugez le tube à 14 000 fois G pendant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez moins de 0,05 milligramme d’anticorps par milligramme de nanoparticules enrobées d’Aden et couvrez les tubes d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la lumière. Incuber les tubes en secouant doucement pendant deux à quatre heures à quatre degrés Celsius. Après avoir fixé les anticorps, ajoutez 10 microlitres d’un milligramme par millilitre d’échantillon de nanoparticules à 990 microlitres d’eau déminéralisée dans un vete en plastique jetable, coiffez le vete et vez-le mélanger.

Ensuite, déterminez la taille moyenne des nanoparticules à l’aide d’un système de diffusion dynamique de la lumière avec un angle de mesure de 173 degrés. Commencez par préparer des suspensions de 10 millilitres de cellules dans du PBS à une concentration d’environ 100 000 cellules par millilitre pour les cultures mixtes, des tubes contenant des ratios variables de chaque lignée cellulaire doivent être préparés comme décrit dans le protocole textuel à raison de deux millilitres de 5 % BS, A pour chaque tube afin de bloquer les cellules et de minimiser la liaison non spécifique. Ajoutez ensuite un millilitre d’un milligramme par millilitre, biofonctionnalisez les nanoparticules dans chaque tube et incubez le mélange pendant une heure.

Ensuite, rincez les cellules pour les débarrasser des nanoparticules non liées en faisant tourner les tubes à 1000 fois G pendant cinq minutes et en pliant à nouveau les pastilles dans un millilitre de PBS. Répétez ce processus au moins deux fois de plus. Fixez les cellules à l’aide de 10 % de formaldéhyde dans le PBS, puis ajoutez 10 microgrammes par millilitre, sept amines à actine et la mycine D dans le PBS pour colorer les cellules, incubez le tube sur de la glace pendant 30 minutes, puis rincez les cellules avec du PBS.

Ensuite, chargez l’échantillon dans le cytomètre en flux et analysez 10 000 cellules fermées de chaque échantillon. Une procédure similaire pour imager des cellules liées à des nanoparticules fluorescentes à l’aide de la microscopie confocale laser est décrite dans le protocole texte. Pour commencer, portez les cellules dans des flacons T 75 à environ 80 % de confluence, puis rincez les cellules sans milieu avec cinq millilitres de PBS.

Ajoutez cinq millilitres de 1 % BSA dans du PBS et bloquez les cellules pendant une heure. Ajoutez ensuite cinq millilitres de nanoparticules enrobées d’anticorps de 0,5 milligramme par millilitre dans le flacon et incubez les cellules pendant une heure pour permettre aux nanoparticules de se lier. Ensuite, rincez les cellules trois fois avec cinq millilitres de PBS pour éliminer les nanoparticules non liées.

Ajoutez ensuite deux millilitres de 0,25 % de tripsdans une solution EDTA et incubez les cellules pendant cinq minutes pour détacher les cellules du ballon. Ajoutez huit millilitres de DMEM pour éteindre l’essai, puis transférez la suspension cellulaire dans des tubes à centrifuger. Faites-les tourner à 1000 fois G pendant cinq minutes pour granuler les cellules.

Ensuite, aspirez le supinate et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Ajoutez un millilitre de formaldéhyde à 10 % dans du PBS pour fixer les cellules, puis transférez 100 microlitres de chaque échantillon dans des puits séparés d’une plaque à fond plat de 96 puits. Ajouter 100 microlitres de 1 % d’aros fondus dans de l’eau déminéralisée dans chaque puits et mélanger par pipetage de haut en bas.

Laissez le gel se solidifier à quatre degrés Celsius pendant 12 heures pour produire un fantôme. Une fois que le gel s’est solidifié, placez le fantôme dans un aimant clinique horizontal à trois T à côté d’un bloc cube solide de 150 centimètres de gélose à 2 %. Ensuite, fixez le fantôme et le bloc de gélose au centre d’une bobine cérébrale HD à huit canaux pour mesurer les temps de relaxation, utilisez des coupes coronales de 0,5 millimètre d’épaisseur prises à mi-hauteur de la plaque de 96 puits, des tests de diffusion dynamique de la lumière ont été utilisés pour déterminer le diamètre hydrodynamique des nanoparticules générées stabilité Les études ont vérifié la stabilité à long terme des nanoparticules sont utilisées dans des expériences à base d’eau et de milieux cellulaires.

La microscopie confocale laser a montré que des nanoparticules fluorescentes chargées d’anticorps pour EOT 3 se trouvaient spécifiquement à la surface des cellules EOL 1. Lorsque des anticorps pour un NG 2 sont utilisés, ils se lient spécifiquement à la surface des neurosphères BSG. Les nanoparticules biofonctionnalisées ont réussi à marquer par fluorescence une population de cellules ciblées, mesurée par cytométrie en flux.

De plus, les nanoparticules ont été capables de cibler une sous-population spécifique de cellules dans un mélange, même à faible cellule cible, pour contrôler les ratios cellulaires. Enfin, des nanoparticules biofonctionnalisées ont augmenté le contraste IRM des cellules ciblées, cellules traitées avec des nanoparticules chargées d’un nng. Deux anticorps ont montré une hyperintensité dans les séquences pondérées T un par rapport aux cellules traitées avec des particules de contrôle.

En revanche, les deux nanoparticules A NNG ont conféré une hypo-intensité dans les séquences pondérées T deux par rapport aux particules témoins. Une fois maîtres. La synthèse de nanoparticules bleues biofonctionnalisées peut être achevée en deux jours si elle est effectuée correctement.

De la même manière que cette procédure, les nanoparticules peuvent être biofonctionnalisées avec différents biopolymères et ligands de ciblage pour étudier de nouvelles maladies et de nouvelles conditions. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser des nanoparticules de bleu de Prusse pour des applications de fluorescence et d’imagerie afin de marquer la population de cellules. N’oubliez pas de suivre scrupuleusement les directives de sécurité et les procédures opérationnelles standard pour mener les études dans l’aimant IRM clinique.