Biofunctionalized bleu de Prusse nanoparticules pour l'imagerie moléculaire multimodale Applications

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser des nanoparticules de bleu de Prusse fonctionnalisées de manière biologique pour une utilisation en tant qu'agents d'imagerie moléculaire multimodale. Cela est réalisé en premier lieu par la synthèse de nanoparticules de bleu de Prusse contenant soit des ions gadolinium, soit des ions manganèse, qui améliorent le signal en IRM. La deuxième étape consiste à fixer un fluorophore avadon à la surface des nanoparticules, ce qui leur confère une capacité d'imagerie fluorescente.

Ensuite, les nanoparticules revêtues d'avadon sont biofonctionnalisées avec les anticorps biotinylés souhaités pour le ciblage cellulaire. Une dernière étape consiste à effectuer un contrôle qualité des nanoparticules biofonctionnalisées en mesurant leur taille, leur potentiel zêta et leur stabilité temporelle. Enfin, les nanoparticules biofonctionnalisées sont utilisées dans des applications d'imagerie moléculaire multimodale afin de visualiser une population cellulaire ciblée spécifique au sein d'un mélange, grâce à l'imagerie par fluorescence et à l'IRM.

Les agents d'imagerie commerciaux actuels sont généralement unimodaux et offrent une résolution uniquement au niveau anatomique. Les nanoparticules de bleu de Prusse combinent deux modes d'imagerie complémentaires, l'IRM et la fluorescence, et permettent l'imagerie moléculaire et à l'échelle subcellulaire. Les applications des nanoparticules multimodales s'étendent au diagnostic du cancer et des maladies inflammatoires, ainsi qu'au suivi de la réponse à leur traitement.

Cela s'explique par le fait que les nanoparticules fonctionnalisées peuvent cibler et se lier à une population de cellules située dans une région précise du corps. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le diagnostic des cancers et des maladies inflammatoires ainsi que sur la réponse au traitement, elle peut également être appliquée à d'autres affections pathologiques qui bénéficieraient de la sensibilité et de la spécificité de l'imagerie moléculaire. En utilisant la fluorescence et l'IRM, nous avons eu pour la première fois l'idée de produire ces nanoparticules lorsque nous avons déterminé que le bleu de Prusse, un agent approuvé par la FDA pour la consommation orale humaine, pouvait être synthétisé de manière stable selon un schéma de synthèse en une seule étape et fonctionnalisé de façon robuste à l'aide de techniques standards de bioconjugaison.

Pour commencer, préparez une solution molaire de 5 millions de ferrate d'hexacyano de potassium deux dans cinq millilitres d'eau désionisée afin d'obtenir la solution A. Préparez ensuite la solution B contenant 2,5 millimolaire de chlorure de fer trois et 2,5 millimolaire de manganèse deux chlorure dans 10 millilitres d'eau désionisée pour la synthèse de nanoparticules de bleu de Prusse au manganèse. D'autres nanoparticules peuvent être synthétisées selon les indications du protocole écrit. Transférez la solution B dans un ballon à fond rond et agitez la solution à 1000 tr/min à température ambiante.

À l’aide d’une pompe péristaltique, ajouter la solution A goutte à goutte dans le récipient à raison de 10 millilitres par heure. Une fois l’ajout de la solution A terminé, agiter le mélange à 1000 tr/min pendant 30 minutes supplémentaires. Ensuite, transférer des aliquotes d’un millilitre du mélange dans des tubes de microcentrifugation et ajouter 0,2 millilitre de chlorure de sodium cinq milli à chaque tube.

Centrifuger les tubes à 20 000 ×g pendant au moins 10 minutes, puis retirer soigneusement le surnageant, en laissant le culot de nanoparticules. Ensuite, ajouter un millilitre d'eau déionisée à chaque culot. Utiliser une micro-pointe pour mettre en suspension les nanoparticules uniformément en solution par sonication.

Lavez les nanoparticules au moins trois fois supplémentaires pour éliminer les composants de la réaction initiale de la suspension après la dernière centrifugation, redispensez les nanoparticules dans un millilitre d’eau déionisée après les avoir recouvertes de fluorescent Dén, comme décrit dans le protocole écrit, retirez les stocks d’anticorps biotinylés du réfrigérateur. Ici, utilisez l’anticorps anti-antigène glial neuronal deux et l’anti-eotaxine humaine trois. Transférez l’anticorps biotinylé dans un filtre microfuge en nylon de 0,2 micromètre, puis centrifugez le tube à 14 000 ×g pendant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez moins de 0,05 milligramme d'anticorps par milligramme de nanoparticules revêtues d'Aden et recouvrez les tubes de papier d'aluminium pour les protéger de la lumière. Incubez les tubes avec agitation douce pendant deux à quatre heures à quatre degrés Celsius. Après l'attachement des anticorps, ajoutez 10 microlitres d'un échantillon de nanoparticules à 1 milligramme par millilitre à 990 microlitres d'eau déionisée dans un bouchon vete en plastique jetable, capuchonnez le vete et secouez-le pour mélanger.

Ensuite, déterminer la taille moyenne des nanoparticules à l’aide d’un système de diffusion dynamique de la lumière avec un angle de mesure de 173 degrés. Commencez par préparer des suspensions de 10 millilitres de cellules dans du PBS à une concentration d’environ 100 000 cellules par millilitre ; des tubes de cultures mixtes contenant des rapports variables de chaque lignée cellulaire doivent être préparés comme décrit dans le protocole textuel. Ajoutez deux millilitres de BSA à 5 % à chaque tube afin de bloquer les cellules et de minimiser les liaisons non spécifiques. Ajoutez ensuite un millilitre de nanoparticules biofonctionnalisées à un milligramme par millilitre à chaque tube, et incubez le mélange pendant une heure.

Ensuite, éliminer les nanoparticules non liées en centrifugeant les tubes à 1000 × g pendant cinq minutes et en redispersant les culots dans un millilitre de PBS. Répéter ce processus au moins deux fois supplémentaires. Fixer les cellules à l’aide de 10 % de formaldéhyde dans du PBS, puis ajouter 10 microgrammes par millilitre de 7-aminoactinomycine D dans du PBS pour colorer les cellules, incuber le tube sur de la glace pendant 30 minutes, puis rincer les cellules avec du PBS.

Ensuite, chargez l'échantillon dans le cytomètre en flux et analysez 10 000 cellules sélectionnées pour chaque échantillon. Une procédure similaire pour imager des cellules liées à des nanoparticules fluorescentes par microscopie confocale laser est décrite dans le protocole textuel. Pour commencer, cultivez les cellules dans des flacons T75 jusqu'à une confluence d'environ 80 %, puis rincez les cellules pour éliminer le milieu à l'aide de cinq millilitres de PBS.

Ajoutez cinq millilitres de BSA à 1 % dans du PBS et bloquez les cellules pendant une heure. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de nanoparticules revêtues d'anticorps à 0,5 milligramme par millilitre dans le flacon et incubez les cellules pendant une heure afin de permettre la liaison des nanoparticules. Puis, rincez les cellules trois fois avec cinq millilitres de PBS pour éliminer les nanoparticules non liées.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % et incubez les cellules pendant cinq minutes afin de les détacher du flacon. Ajoutez huit millilitres de DMEM pour inhiber la trypsine, puis transférez la suspension cellulaire dans des tubes de centrifugation. Faites-les centrifuger à 1000 ×g pendant cinq minutes pour former un culot cellulaire.

Ensuite, aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans un millilitre de PBS. Ajoutez un millilitre de formaldéhyde à 10 % dans du PBS pour fixer les cellules, puis transférez 100 microlitres de chaque échantillon dans des puits distincts d'une plaque de 96 puits à fond plat. Ajoutez 100 microlitres d'agarose fondue à 1 % dans de l'eau déionisée dans chaque puit et mélangez par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette.

Laisser le gel durcir à quatre degrés Celsius pendant 12 heures afin d'obtenir un fantôme. Une fois le gel solidifié, placer le fantôme à côté d'un bloc solide cubique de 150 centimètres de côté en agar à 2 %, à l'intérieur d'un aimant clinique horizontal de trois T. Ensuite, fixer le fantôme et le bloc d'agar au centre d'une bobine cérébrale HD à huit canaux afin de mesurer les temps de relaxation, en utilisant des coupes coronales de 0,5 millimètre d'épaisseur prises à mi-hauteur de la plaque à 96 puits. Des essais de diffusion dynamique de la lumière ont été utilisés pour déterminer le diamètre hydrodynamique des nanoparticules générées. Des études de stabilité ont confirmé la stabilité à long terme des nanoparticules utilisées dans des expériences en milieu aqueux et en milieu cellulaire.

La microscopie confocale laser a révélé des nanoparticules fluorescentes chargées d'anticorps dirigés contre EOT trois, fixés spécifiquement à la surface des cellules EOL un. Lorsque des anticorps dirigés contre NG deux sont utilisés, ils se lient spécifiquement à la surface des neurosphères BSG. Les nanoparticules fonctionnalisées ont permis d'étiqueter avec succès par fluorescence une population de cellules ciblées, comme mesuré par cytométrie en flux.

En outre, les nanoparticules ont été capables de cibler une sous-population spécifique de cellules dans un mélange, même à de faibles rapports de cellules cibles par rapport aux cellules témoins. Enfin, les nanoparticules fonctionnalisées ont accru le contraste en IRM des cellules ciblées, par rapport aux cellules traitées avec des nanoparticules chargées d'un nng. Deux anticorps ont montré une hyperintensité dans les séquences pondérées en T1 par rapport aux cellules traitées avec des particules témoins.

En revanche, les deux nanoparticules A NNG ont conféré une hypointensité dans les séquences pondérées en T deux par rapport aux particules témoins. Une fois maîtrisé. La synthèse de nanoparticules bleues biofonctionnalisées peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement.

De façon similaire à cette procédure, les nanoparticules peuvent être fonctionnalisées de manière biologique avec différents biopolymères et ligands ciblés afin d'étudier de nouvelles maladies et de nouvelles conditions. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse des nanoparticules de bleu de Prusse pour des applications de fluorescence et d'imagerie permettant le marquage de populations cellulaires. N'oubliez pas de suivre rigoureusement les consignes de sécurité et les procédures opérationnelles normalisées pour la réalisation des études dans l'aimant d'IRM clinique.