Préparation et In vitro Caractérisation des agents de contraste à base de dendrimères pour imagerie par résonance magnétique

L’objectif général de cette procédure est de montrer la préparation et la caractérisation d’un chélateur paramagnétique dendrimérique qui peut être utilisé comme agent de contraste pour l’imagerie par résonance magnétique et de démontrer ses performances dans une expérience d’imagerie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des agents de contraste IRM, telles que les propriétés et l’efficacité des agents de contraste dendrimériques. Le principal avantage de cette technique est la préparation pratique de l’agent de contraste IRM efficace à haute teneur en protéines, assurant ainsi sa caractérisation facile.

Cette méthode peut s’étendre à d’autres modifications structurelles et optimisations fonctionnelles des agents de contraste dendrimériques IRM, ce qui est d’une grande pertinence pour des applications in vivo potentielles. Les implications s’étendent à la recherche biomédicale et à l’imagerie diagnostique, car le taux moléculaire élevé des agents de contraste dendrimériques entraîne des temps de rétention tissulaire plus longs et améliore considérablement le signal IRM. Tout d’abord, dissolvez un gramme du précurseur macrocyclique DO3A tributyl ester dans cinq millilitres de DMF.

Ajouter 0,67 gramme de carbonate de potassium et remuer à température ambiante pendant 45 minutes. Ajoutez 0,87 gramme de tert-butyl-2-bromo-4 4-nitrophényl butatnoate par portions sur une heure et continuez à remuer le mélange réactionnel pendant 18 heures. Ensuite, retirez le DMF avec une distillation sous vide bulbe à bulbe à 40 à 60 degrés Celsius.

Purifier le résidu par chromatographie sur colonne de gel de silice pour obtenir un solide rond. Dissoudre un gramme de solide dans un mélange de 10 millilitres d’éthanol et de 150 microlitres d’une solution de sept ammoniacs normaux dans du méthanol. Ajoutez 150 milligrammes de palladium sur du charbon actif et installez le réacteur à bouteille dans l’hydrogénateur.

Agitez le mélange pendant 16 heures sous une atmosphère d’hydrogène de 2,5 bars. Versez une suspension de terre de diatomées dans de l’éthanol dans un entonnoir en verre fritté Filtrez le mélange réactionnel à travers la terre de diatomées pour éliminer le catalyseur au carbone de palladium. Éliminer le solvant du filtrat sur un évaporateur rotatif.

Dissoudre le solide obtenu dans 15 millilitres de dichlorométhane et quatre équivalents de triéthylamine. À cela, ajoutez 1,3 équivalent de thiophosgène et remuez le mélange à température ambiante pendant 16 heures. Retirer le solvant du mélange réactionnel sur un évaporateur rotatif et purifier le résidu par chromatographie sur colonne de gel de silice pour obtenir le monomère de type DOTA sous forme de solide brun clair.

Préparez 66,7 milligrammes de dendrimère G4 PAMAM à partir d’une solution à 10 % de méthanol en évaporant le solvant sur un évaporateur rotatif à 40 degrés Celsius. Dissoudre le dendrimère dans quatre millilitres de DMF. Ajoutez 0,105 millilitre de triéthylamine à la solution de dendrimère et remuez pendant 45 minutes à 60 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite 354 milligrammes de monomère en portions sur une heure. Continuez à remuer à 45 degrés Celsius pendant 48 heures. Retirez le solvant par distillation sous vide bulbe à bulbe.

Emballez une colonne de chromatographie d’exclusion stérique en faisant tourbillonner le milieu de filtration sur gel lipophile dans du méthanol pendant trois heures à température ambiante. Prélever des fractions d’un millilitre en utilisant du méthanol comme éluant. Analysez les fractions par TLC.

Éliminer le solvant des fractions contenant le chélateur dendrimérique protégé sur un évaporateur rotatif. Acquérir un spectre RMN des protons du composé et intégrer les régions aromatiques et aliphatiques. À l’aide de ces valeurs, déterminez le nombre de macrocycles protégés de type DOTA couplés au dendrimère G4 PAMAM.

Pour déprotéger le produit, dissolvez le solide dans cinq millilitres d’acide formique et remuez le mélange à 60 degrés Celsius pendant 36 heures. Retirez l’acide formique à l’aide d’un évaporateur rotatif. Lyophiliser le résidu retiré de l’évaporateur rotatif pour obtenir le chélateur dendrimérique.

À l’aide de la RMN des protons, déterminez le nombre d’unités macrocycliques couplées au dendrimère. Dissoudre le chélateur lyophilisé dans l’eau. Utilisez de l’hydroxyde de sodium à 0,1 molaire pour ajuster le pH de la solution à 7,0.

Ajoutez une solution de 113 milligrammes de chlorure de gadolinium III dans un millilitre d’eau goutte à goutte à la solution chélatrice sur une période de quatre heures. Ajustez périodiquement le pH à 7,0 avec de l’hydroxyde de sodium de 0,05 molaire. Remuez le mélange à température ambiante pendant 24 heures.

Ensuite, ajoutez 158 milligrammes d’EDTA par portions sur une période de quatre heures, en corrigeant le pH à 7,0 au besoin. Remuer pendant encore 24 heures à température ambiante. Emballez une colonne de chromatographie d’exclusion stérique avec un milieu de filtration sur gel hydrophile gonflé dans l’eau.

Concentrez le mélange réactionnel, chargez-le sur la colonne et éluez avec de l’eau désionisée. Centrifuger l’échantillon purifié dans une unité de centrifugation de trois kilodaltons pendant 30 minutes à 1 800 fois g. Répétez la filtration environ cinq fois pour éliminer l’excès de gadolinium et d’EDTA.

Confirmez l’absence d’ions gadolinium libres dans le filtrat avec un test à l’orange de xylénol. Éliminer les substances volatiles de l’échantillon filtré et lyophiliser le résidu pour obtenir l’agent de contraste dendrimérique. Préparez une solution mère de DCA dans de l’eau à une concentration comprise entre cinq et 10 millimolaires.

Pour déterminer la concentration précise de DCA, combinez d’abord 360 microlitres de solution mère avec 60 microlitres d’un étalon de D2O et de tert-butanol. Placez 400 microlitres de l’échantillon dans un tube RMN extérieur. Placez un tube d’insertion RMN coaxial contenant une solution de référence de tert-butanol et d’eau dans le tube d’échantillon.

Acquérir un spectre RMN de protons et mesurer le décalage de fréquence entre les signaux tert-butanol de la solution de référence et de la solution d’échantillon. Calculez la concentration de DCA à l’aide de la formule indiquée, en corrigeant le tert-butanol ajouté dans l’échantillon. Déterminez de la même manière la concentration d’une solution GdDOTA disponible dans le commerce.

Placez les solutions DCA et GdDOTA dans le tampon HEPES et les contrôles d’eau dans deux ensembles de flacons en plastique. Fermez les flacons avec des bouchons en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Dans une seringue de 60 millilitres, chargez horizontalement les échantillons de DCA de 0,01 et 0,02 millimolaire, l’un des échantillons de GdDOTA de 0,5 et 1,0 millimolaire et deux des témoins d’eau.

Répétez cette procédure en chargeant la deuxième série d’échantillons dans une deuxième seringue de 60 millilitres. Remplissez chaque seringue avec une solution GdDOTA millimolaire et bouchez les embouts de la seringue. Placez l’une des seringues horizontalement dans un scanner IRM de manière à ce que les échantillons soient verticaux par rapport au scanner.

Faites glisser les seringues au centre du scanner. Sélectionnez le balayage anatomique pour positionner la seringue à l’isocentre de l’aimant. Appuyez ensuite sur le bouton des feux de signalisation pour effectuer les réglages des paramètres de balayage initiaux et démarrer le balayage.

Choisissez la méthode de prise de vue à angle rapide/lent pour effectuer une imagerie pondérée T1 ou la méthode d’acquisition rapide avec amélioration de la relaxation pour effectuer une imagerie pondérée T2. Utilisez le balayage d’alignement de piste pour sélectionner la tranche coronale pour les échantillons alignés verticalement. Optimisez le contraste par rapport aux paramètres d’acquisition du bruit et acquérez l’image.

Utilisez un retour sur investissement circulaire pour déterminer l’amplitude moyenne du signal et l’écart-type pour l’arrière-plan et pour chaque échantillon. Calculez le rapport signal/bruit. La RMN, la spectrométrie maldi-tof et l’analyse élémentaire ont indiqué qu’une moyenne de 49 unités macrocycliques étaient conjuguées au dendrimère G4 PAMAM.

Les concentrations et les temps de relaxation longitudinaux et transversaux des solutions de DCA ont également été déterminés par RMN. Les valeurs de relaxivité obtenues ont été comparées à celles d’un monomère GdDOTA disponible dans le commerce et utilisé cliniquement. Les performances du DCA ont également été comparées à celles du monomère GdDOTA.

Deux ensembles de solutions avaient des concentrations de gadolinium similaires, déterminées par le nombre d’unités macrocycliques conjuguées, et les deux autres ensembles avaient des concentrations moléculaires similaires. Dans une expérience d’imagerie pondérée T1 avec des concentrations similaires de gadolinium, le rapport signal/bruit était légèrement plus élevé pour le DCA que pour le GdDOTA. Lorsque les solutions avaient des concentrations similaires par molécule, le rapport signal/bruit DCA était environ trois fois supérieur à celui de GdDOTA.

Dans une expérience d’imagerie pondérée T2, le rapport signal/bruit du DCA était significativement inférieur à celui du GdDOTA dans les deux paires de concentrations, en particulier à des concentrations de DCA plus élevées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’un agent de contraste IRM à base de dendrimères purifié et caractérisé. À la suite de cette procédure, différents types d’agents de contraste IRM dendrimériques et nanométriques peuvent être préparés en modifiant les unités de la molécule et analysés de manière pratique.

Après avoir maîtrisé cette technique, les chercheurs dans le domaine du développement d’agents de contraste IRM devraient être en mesure de préparer une gamme de sondes spécifiques pour réaliser diverses études fonctionnelles d’une importance critique pour l’imagerie moléculaire contemporaine.