Immobilisation bactérienne pour l'imagerie par microscopie à force atomique

La microscopie à force atomique ou une microscopie FM utilise le sondage mécanique d’une surface pour générer des images à haute résolution sans avoir besoin de traiter chimiquement l’échantillon. Dans cette vidéo, des bactéries sont immobilisées sur du mica enrobé de gélatine et imagées dans un environnement liquide par un FM. Tout d’abord, les carrés MICA sont découpés pour s’adapter à la plate-forme de microscope A FM. La couche supérieure du MICA est retirée et les carrés de mica sont recouverts de gélatine.

Ensuite, une gouttelette de suspension bactérienne est placée sur le mica enrobé de gélatine et étalée. À l’aide d’une pointe de pipette, les échantillons sont incubés pendant 10 minutes. Ensuite, les bactéries non liées sont lavées de la surface.

L’échantillon est placé dans la cellule humide A FM et imagé pour obtenir des images à haute résolution de bactéries vivantes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mobilisation par filtre poreux ISO, est que les bactéries en forme de bâtonnet et sphériques peuvent être immobilisées de manière fiable. De plus, un plus grand pourcentage de la surface cellulaire est accessible à la sonde A FM.

L’un des principaux avantages de la microscopie à force atomique par rapport aux autres microscopies est qu’il est possible de mener des études sur cellule unique, des investigations sur la morphologie cellulaire, la formation du septum et la cytokinèse. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal parce qu’elles ont tendance à utiliser de la gélatine dont il n’est pas prouvé qu’elle immobilise les bactéries ou les bactéries utilisées cultivées dans un milieu complexe où les composants entreront en compétition avec l’adhésion des bactéries à la surface de la gélatine. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois à partir d’expériences dans les années 1970 où des bactéries étaient immobilisées.

Lames de verre revêtues de gélatine pour des expériences utilisant la microscopie optique et l’autoradiographie. Dans cette démonstration, des bactéries à Gram négatif vivantes sont immobilisées pour une imagerie FM, mais la méthode est également applicable aux bactéries à Gram positif. Pour préparer le MICA, commencez par le couper avec des ciseaux pour l’adapter à la platine du microscope A FM et accueillir la cellule humide A FM.

Placez ensuite du scotch tape sur la surface MICA et retirez-le pour décoller la couche extérieure de MICA de la pièce coupée. Continuez à retirer la couche extérieure des deux côtés jusqu’à ce qu’il ne reste que des couches lisses et ininterrompues. Pour préparer la solution de gélatine, ajoutez 100 millilitres d’eau distillée dans une bouteille de laboratoire et chauffez-la au micro-ondes.

Lorsque l’eau commence à bouillir, retirez-la du micro-ondes, ajoutez 0,5 gramme de gélatine et gonflez doucement la bouteille jusqu’à ce que la gélatine se dissolve. Notez que les gélatines bovines ne fonctionnent pas bien pour cette procédure. Les gélatines porcines sont recommandées.

Placez la bouteille sur la paillasse et laissez-la refroidir à 60 à 70 degrés Celsius. Versez ensuite une quantité suffisante de la solution de gélatine dans un petit bécher pour que le MICA puisse être complètement immergé à l’aide d’une pince. Plongez un carré MICA dans la solution de gélatine chaude et retirez-le rapidement. Immédiatement.

Placez le MICA sur son bord sur une serviette en papier appuyée contre une grille de micro-centrifugeuse pour le faire sécher à l’air ambiant pendant la nuit. Le MICA enrobé de gélatine peut être utilisé pendant au moins deux semaines. Si le MICA enrobé de gélatine ne sera pas utilisé pendant quelques semaines.

Placez-le sur du papier filtre dans une boîte de Pétri couverte et conservez-le à température ambiante. L’excès de solution de gélatine peut être conservé au réfrigérateur et utilisé pendant environ un mois en réchauffant simplement la solution mère entre 60 et 70 degrés. Il faut veiller à ce que la gélatine ne soit pas bouillie pendant le réchauffage.

Avant de monter les bactéries sur du MICA enrobé de gélatine, assurez-vous que la concentration bactérienne est adéquate. À l’aide d’un spectrophotomètre, vous obtiendrez une lecture de la densité optique de l’échantillon bactérien à 600 nanomètres. Une DO de 0,5 pour un est optimale.

Ensuite, transférez un millilitre de la culture dans un microtube de centrifugation et centrifugez-le pour le granuler après la centrifugation. À l’aide d’une pipette, retirez le surnageant, puis lavez la pastille dans un millilitre d’eau déminéralisée filtrée ou de tampon. Pipetage doux de haut en bas pour ressusciter.

Suspendez la centrifugeuse à granulés à votre gain et remettez rapidement la pastille en suspension. Dans 500 microlitres d’eau nano pure désionisée, la suspension bactérienne doit être visiblement étron afin d’avoir une concentration adéquate de cellules. Pour une imagerie FM.

Si le choc osmotique est un problème, 0,25 molaire de saccharose peut être ajouté à la solution d’imagerie. J’ai remis cette bactérie en suspension dans l’eau, mais n’ayez pas peur d’essayer d’autres liquides. Par exemple, nous l’avons fait avec 0,25 % de saccharose, alors essayez d’autres liquides et voyez si cela fonctionnera également.

Préparez deux lames pour chaque échantillon. À l’aide d’un micro-pipeteur, ajoutez 10 à 20 microlitres de suspension cellulaire sur la surface recouverte de gélatine. Ensuite, pour obtenir une zone de couverture adéquate pour une imagerie FM, utilisez une pointe de micro-pipette pour répartir la gouttelette dans les directions X et Y.

En prenant soin de ne pas toucher physiquement la surface de la gélatine avec la pointe de la pipette, incubez l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, rincez avec un jet d’eau pour évacuer l’excès de liquide de l’échantillon en touchant le bord de l’échantillon à une serviette en papier ou à du papier filtre. Séchez rapidement l’une des lames à l’aide d’un jet d’azote gazeux.

Ensuite, inspectez visuellement la diapositive. Une tache opaque indique que les bactéries n’ont pas été éliminées lors de l’étape de lavage. L’autre lame, qui sera maintenant utilisée pour l’imagerie, ne doit pas sécher.

Placez-le dans l’étage humide A FM et fixez-le à l’aide des clips, à l’aide d’une micro-pipette ajoutez de l’eau à l’étage humide. C’est une bonne idée de préparer le microscope à force atomique avant l’imagerie dans un liquide. Assurez-vous que le porte-à-faux pour l’imagerie dans le liquide est placé dans l’A FM et qu’il est aligné avec le laser.

Procéder à l’imagerie par microscopie à force atomique à l’aide d’un microscope à force atomique pico plus, équipé d’une tête de balayage de 100 microns et de sondes en nitrure de silicium vico avec des constantes nominales de ressort allant de 0,01 à 0,1 nano newton par nanomètre. Une fois le microscope préparé, insérez le scanner FM et la platine dans le microscope. En règle générale, nous commençons à 0,5 ligne par seconde jusqu’à une ligne par seconde comme vitesse d’imagerie et la résolution sont définies de 1 28 points de données par ligne à 512.

Réglez l’instrument pour collecter des images en utilisant 128 à 512 pixels par ligne. Numérisez à une vitesse de balayage de 0,5 à une ligne par seconde. Ensuite, si nécessaire, ajustez le point de consigne et les gains sur l’A FM pour obtenir des images optimales.

Enfin, collectez les images. La bactérie E coli a été montée sur du MICA enrobé de gélatine comme décrit dans cette vidéo, puis imagée en PVS de 0,005 molaire. En utilisant cette méthode.

Les sceptres sont clairement visibles sur l’image collectée et les surfaces cellulaires sont lisses, ne montrant aucun signe de déshydratation. En comparaison, les images prises du même e coli dans l’air que celles montrées ici, montrent souvent des structures non observées dans un liquide. Dans ce cas, les cellules présentent un aspect ringueux dû à la déshydratation et des appendices bactériens tels que FIA peuvent être observés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’échantillons bactériens pour une imagerie FM dans un environnement liquide. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si les microsurfaces recouvertes de gélatine ont été préalablement préparées au lit. Lors de cette procédure, il est important de choisir la bonne gélatine et d’avoir une concentration appropriée de bactéries après cette procédure.

D’autres mesures, telles que l’utilisation du porte-à-faux FN comme outil de détection de force pour conserver les mesures de force sur les surfaces bactériennes, peuvent être effectuées. De plus, des molécules de sonde spécifiques peuvent être attachées à l’embout A FM pour interagir avec des cibles spécifiques à la surface de la bactérie afin d’identifier et de mesurer les forces d’interaction. En général, n’oubliez pas que si vous travaillez avec des bactéries pathogènes, des précautions doivent toujours être prises lorsque vous travaillez avec cette méthode.