Name: Immobilisation bactérienne pour limagerie par microscopie à force atomique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Apprenez à immobiliser des bactéries vivantes sur du mica recouvert de gélatine pour l'imagerie par microscopie à force atomique en milieu liquide. Cette méthode permet d'observer Gram-négatifs et Gram-positifs sans traitement chimique.

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Cette recherche est parrainée par le Bureau de recherche biologique et environnementale, ministère américain de l&#39;Energie et par l&#39;octroi de financement à partir du Commonwealth de la Virginie Conseil de recherche en santé. Oak Ridge National Laboratory est géré par UT-Battelle, LLC, pour le ministère américain de l&#39;Énergie et du contrat No. DE-AC05-00OR22725.

1. Préparation de Mica: <ol><li> Couper le mica (Sciences Electron Microscopy) avec des ciseaux à la taille nécessaire pour s'adapter au microscope AFM (env. 22 x 30 mm). </li><li> Enchaînement du mica, des deux côtés, généralement avec du ruban pour enlever la couche extérieure, jusqu'à ce que lisse couches ininterrompue demeurent. </li></ol> 2. Préparation de la solution de gélatine: <ol><li> Ajouter 100 ml d'eau distillée à une bouteille de laboratoire. </li><li> Faire chauffer le biberon au micro-ondes jusqu'à ce que l'eau commence à bouillir. (Si un micro-ondes n'est pas disponible, l'eau peut être chauffée dans un bécher sur une plaque chaude.) </li><li> Peser 0,5 g de gélatine (Sigma G-6144, G-2625 ou G-2500) et ajouter à l'eau chaude distillée. </li><li> Agiter doucement le flacon jusqu'à ce que la gélatine soit complètement dissoute. </li><li> Refroidir la solution de gélatine à 60-70 ° C. </li><li> Verser environ 15 ml dans un petit bécher (20 ml) dans lequel le mica clivé coupées peuvent être trempés. </li></ol> 3. Mica revêtement: <ol><li> Plonger les carrés de mica dans la solution chauffée de gélatine et de retirer rapidement de sorte que le mica est couché (fig. 1a). </li><li> Après le revêtement, le soutien du mica immédiatement, sur la pointe, sur une serviette en papier pour sécher à l'air ambiant (Fig. 1b). Le mica recouvert de gélatine peuvent être utilisés pendant au moins 2 semaines. L'excès de solution de gélatine peuvent être conservés au réfrigérateur et utilisé pendant environ un mois par un simple réchauffage de la solution stock à entre 60-70 ° C. Des précautions doivent être prises pour s'assurer que la gélatine n'est pas bouillie pendant le réchauffage. </li></ol> 4. Montage des bactéries sur le mica recouvert de gélatine: <ol><li> Pellet 1 ml d'une culture bactérienne (0,5 - 1,0 DO à 600 nm) de 800 à 4500 fcr. Selon les bactéries, l'utilisation du RCF minimum qui sera un culot cellulaire dans ~ 5 minutes. </li><li> Laver le culot dans le même volume d'eau déminéralisée filtrée ou un tampon. </li><li> Recueillir les cellules à nouveau par centrifugation. </li><li> Reprendre le culot rapidement dans 500 ul d'eau déminéralisée nanopure ou un tampon. (La suspension bactérienne doit être visiblement trouble afin d'avoir une concentration suffisante de cellules pour l'imagerie AFM). </li><li> Appliquer la suspension de cellules (10-20 uL) pour le mica recouvert de gélatine et la propagation sur la surface à l'aide d'une pipette (fig. 1c). Il faut prendre soin de ne pas toucher physiquement la surface de gélatine à la pointe de la pipette en appliquant ou la diffusion de la solution bactérienne. </li><li> Laisser la surface pour se reposer pendant 10 minutes et rincez avec un jet d'eau ou de tampon (figure 1 cd). Tout au long de la procédure, prendre soin de s'assurer que l'échantillon n'est pas autorisé à sec. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La figure 2 montre des images par exemple des cellules bactériennes qui ont été montés sur la gélatine-mica et imagée par l'AFM. Dans nos laboratoires, les échantillons sont généralement imagée en utilisant un microscope à force atomique PicoPlus (Agilent Technologies, le Temple, AZ) équipé d'une tête de balayage 100 um. L'instrument fonctionne à 128-512 pixels par ligne de balayage à une vitesse de balayage de 0,5-1,0 lignes / s. Les cantilevers qui sont typiquement utilisés sont des sondes Veeco nitrure de silicium (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) avec des constantes de printemps nominales allant de 0,01 à 0,1 nN / nm. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Gélatine à une température de 60-70 ° C est placé dans un bécher de 20 ml. En utilisant une paire de pinces de mica fraîchement clivées carrés sont totalement immergés dans la gélatine (a) retirée et placée debout sur une serviette en papier adossé à un support de micro centrifugeuse (b). Une goutte d'échantillon bactérien est mis sur le mica et étaler avec une pipette dans les deux directions X et Y (c). Après avoir laissé l'échantillon à incuber sur la surface du mica pour au moins 10 minutes, rincer l'échantillon dans un courant d'eau distillée. Si l'immobilisation a travaillé, vous serez capable de voir une tache opaque sur le mica comme indiqué dans le panneau de droite de (d). Si l'immobilisation n'a pas fonctionné, vous obtiendrez un morceau de mica clair que dans le panneau gauche. La tache opaque sur les échelles de mica à la concentration de la bactérie dans la gouttelette que vous placez sur le mica de gélatine traitée. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Images AFM de E. coli. Dans le graphique (a), les cellules sont montées sur la gélatine-mica et imagée de 0,005 M de PBS. A titre de comparaison, une image de cellules bactériennes monté sur la gélatine-mica et imagée dans l'air est montré dans le panneau (b). Bien septa sont clairement visibles dans l'image recueillie dans un liquide, une plus grande résolution, comme indiqué par la présence de pili (panneau en médaillon (b)), peut être obtenue dans l'air.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Différents facteurs peuvent affecter la cellule microbienne de montage et d&#39;imagerie par AFM. La gélatine qui est utilisée pour le revêtement du mica est important. Commerce de gélatine est isolé à partir d&#39;un certain nombre de vertébrés, y compris les poissons, les vaches et les cochons. L&#39;origine et la méthode de traitement de déterminer la pertinence de la gélatine pour immobilisation bactérienne. De nombreuses sources et les types de gélatine ont été évalués pour leur efficacité dans les bactéries immobi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> G6144, G2625 G2500 ou </td></tr><tr><td> Microscope à Force Atomique PicoPlus </td><td> Agilent Technologies, Tempe, AZ </td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers AFM </td><td> Veeco, Santa Barbara, Californie </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

L&#39;AFM est une haute résolution (échelle nm) outil d&#39;imagerie que les sondes mécanique d&#39;une surface. Il a la capacité de cellules d&#39;image et de biomolécules, dans un environnement liquide, sans la nécessité de traiter chimiquement l&#39;échantillon. Afin d&#39;atteindre cet objectif, l&#39;échantillon doit suffisamment adhérer à la surface de montage afin de prévenir l&#39;enlèvement par les forces exercées par la pointe de numérisation AFM. Dans de nombreux cas, l&#39;imagerie succès dépend de l&#39;immobilisation de l&#39;échantillon à la surface de montage. Idéalement, l&#39;immobilisation devrait être minimalement invasive à l&#39;échantillon de telle sorte que les processus métaboliques et attributs fonctionnels ne sont pas compromises. En revêtement de surfaces mica fraîchement clivé par porcine (porc) de gélatine, les bactéries chargées négativement peuvent être immobilisés sur la surface et imagée dans le liquide par l&#39;AFM. Immobilisation des bactéries sur la gélatine mica est très probablement due à l&#39;interaction électrostatique entre les bactéries chargées négativement et la gélatine chargée positivement. Plusieurs facteurs peuvent interférer avec immobilisation bactérienne, y compris les constituants chimiques du liquide dans lequel les bactéries sont suspendues, le temps d&#39;incubation de la bactérie sur les caractéristiques de gélatine mica recouvert de surface, de la souche bactérienne et le milieu dans lequel les bactéries sont imagés. Globalement, l&#39;utilisation de gélatine-mica se trouve être généralement applicables pour l&#39;imagerie des cellules microbiennes.

En direct des bactéries Gram-négatives et gram-positif peut être immobilisé sur la gélatine-mica et imagée dans un liquide en utilisant la microscopie à force atomique (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

L'AFM est un outil d'imagerie à haute résolution (échelle nanométrique) qui sonde mécaniquement une surface. Il permet d'imager des cellules et des biomolécules, dans un liquide...

La microscopie à force atomique ou une MFA utilise un balayage mécanique d'une surface pour produire des images haute résolution sans nécessiter de traitement chimique de l'échantillon. Dans cette vidéo, des bactéries sont immobilisées sur du mica recouvert de gélatine et observées dans un environnement liquide par MFA. Des carrés de MICA sont d'abord découpés afin de s'adapter à la plateforme du microscope MFA. La couche supérieure du MICA est retirée, puis les carrés de mica sont recouverts de gélatine.Ensuite, une goutte de suspension bactérienne est déposée sur la mica recouverte de gélatine et étalée. À l'aide d'une pointe de pipette, les échantillons sont incubés pendant 10 minutes. Puis, les bactéries non liées sont éliminées par lavage de la surface.L'échantillon est placé dans la cellule humide de microscopie à force atomique (AFM) et observé afin d'obtenir des images de haute résolution de bactéries vivantes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mobilisation sur filtre poreux ISO est qu'elle permet d'immobiliser de manière fiable aussi bien les bactéries en forme de bâtonnet que les bactéries sphériques. De plus, un pourcentage plus élevé de la surface cellulaire est accessible à la sonde AFM.Un avantage clé de la microscopie à force atomique par rapport à d'autres microscopies est qu'elle permet d'effectuer des études sur des cellules individuelles, permettant d'explorer la morphologie cellulaire, la formation du septum et la cytokinèse. Les personnes novices dans cette méthode éprouvent généralement des difficultés car elles ont tendance à utiliser de la gélatine non validée pour immobiliser les bactéries ou des bactéries cultivées dans un milieu complexe dont les composants peuvent entrer en compétition avec l'adhésion des bactéries à la surface de la gélatine. Nous avons eu l'idée de cette méthode à partir d'expériences remontant aux années 1970, au cours desquelles des bactéries étaient immobilisées.Des lames en verre recouvertes de gélatine pour des expériences utilisant la microscopie optique et l'autoradiographie. Dans cette démonstration, des bactéries vivantes à Gram négatif sont immobilisées pour une imagerie en MF, mais la méthode s'applique également aux bactéries à Gram positif. Pour préparer le MICA, commencez par le découper avec des ciseaux afin qu'il s'adapte à la platine du microscope en MF et au dispositif humide en MF.Ensuite, appliquez du ruban adhésif sur la surface du MICA et retirez-le afin de détacher la couche externe du MICA du morceau découpé. Continuez à enlever la couche externe des deux côtés jusqu'à ce qu'il ne reste que des couches lisses et intactes. Pour préparer la solution de gélatine, ajoutez 100 millilitres d'eau distillée dans un flacon de laboratoire et chauffez-la au micro-ondes.Lorsque l'eau commence à bouillir, retirez-la du micro-ondes, ajoutez 0,5 gramme de gélatine et agitez doucement le flacon jusqu'à ce que la gélatine se dissolve. Notez que les gélatines bovines ne conviennent pas bien à cette procédure. Les gélatines porcines sont recommandées.Placez le flacon sur le plan de travail et laissez-le refroidir à une température comprise entre 60 et 70 degrés Celsius. Versez ensuite une quantité suffisante de la solution de gélatine dans un petit bécher afin de garantir que le MICA puisse être complètement immergé à l’aide de pinces. Immergez un carré de MICA dans la solution de gélatine tiède, puis retirez-le rapidement. Immédiatement.Placer la MICA sur son bord, contre une microcentrifugeuse en appui sur une serviette en papier, pour la faire sécher à l'air ambiant toute la nuit. La MICA revêtue de gélatine peut être utilisée pendant au moins deux semaines. Si la MICA revêtue de gélatine n'est pas utilisée pendant quelques semaines.Placez-le sur du papier filtre dans une boîte de Pétri couverte et conservez-le à température ambiante. La solution excédentaire de gélatine peut être conservée au réfrigérateur et utilisée pendant environ un mois en réchauffant simplement la solution mère entre 60 et 70 degrés Celsius. Il faut veiller à ne pas faire bouillir la gélatine lors du réchauffage.Avant de déposer les bactéries sur du MICA recouvert de gélatine, assurez-vous que la concentration bactérienne est adéquate. Utilisez un spectrophotomètre pour obtenir une mesure de densité optique de l'échantillon bactérien à 600 nanomètres. Une DO comprise entre 0,5 et 1 est optimale.Ensuite, transférez un millilitre de la culture dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugez pour former un culot selon les paramètres de centrifugation. Utilisez une pipette pour éliminer le surnageant, puis lavez le culot avec un millilitre d'eau déionisée filtrée ou un tampon. Resuspendez délicatement en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas.Suspendez le culot centrifugé et redisperser immédiatement le culot dans 500 microlitres d'eau déionisée nano pure. La suspension bactérienne doit être visiblement trouble afin d'avoir une concentration adéquate de cellules. Pour une imagerie en microscopie à fluorescence (FM).Si un choc osmotique est une préoccupation, du saccharose à 0,25 molaire peut être ajouté à la solution d'imagerie. J'ai mis en suspension cette bactérie dans de l'eau, mais n'ayez pas peur d'essayer d'autres liquides. Par exemple, nous avons réalisé cette manipulation avec du saccharose à 0,25 % ; essayez donc d'autres liquides pour voir si cela fonctionne également.Préparez deux lames pour chaque échantillon. À l’aide d’une micropipette, ajoutez de 10 à 20 microlitres de suspension cellulaire sur la surface recouverte de gélatine. Ensuite, afin d’obtenir une surface suffisante pour une imagerie en microscopie de fluorescence (FM), utilisez la pointe d’une micropipette pour étaler la goutte dans les directions X et Y.En prenant soin de ne pas toucher physiquement la surface de gélatine avec la pointe de la pipette, incuber l'échantillon pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, rincer à l'aide d'un filet d'eau et éliminer l'excès de liquide en posant le bord de l'échantillon sur une serviette en papier ou du papier filtre. Sécher rapidement l'une des lames à l'aide d'un jet d'azote gazeux.Ensuite, inspectez visuellement la lame. Une tache opaque indique que les bactéries n'ont pas été éliminées lors de l'étape de lavage. L'autre lame, qui sera désormais utilisée pour l'imagerie, ne doit pas être laissée sécher.Placez-le sur la platine humide A FM et fixez-le à l'aide des pinces ; à l'aide d'une micropipette, ajoutez de l'eau sur la platine humide. Il est conseillé de préparer le microscope à force atomique avant l'acquisition d'images dans un liquide. Assurez-vous que le levier destiné à l'imagerie en milieu liquide est inséré dans l'A FM et aligné avec le laser.Procédez à l’imagerie par microscopie à force atomique à l’aide d’un microscope à force atomique Pico Plus, équipé d’une tête de balayage de 100 micromètres et de sondes en nitrure de silicium Vico dont les constantes de raideur nominales varient de 0,01 à 0,1 nano newton par nanomètre. Une fois le microscope préparé, insérez le scanner FM et la platine dans le microscope. Généralement, nous commençons à une vitesse d’imagerie de 0,5 ligne par seconde, allant jusqu’à une ligne par seconde, et la résolution est réglée de 128 points de données par ligne à 512.Réglez l'instrument pour acquérir des images avec une résolution de 128 à 512 pixels par ligne. Effectuez la numérisation à une vitesse comprise entre 0,5 et une ligne par seconde. Ensuite, si nécessaire, ajustez le point de consigne ainsi que les gains sur le mode AFM afin d'obtenir des images optimales.Enfin, récupérez les images. Les bactéries E coli ont été déposées sur du MICA recouvert de gélatine comme décrit dans cette vidéo, puis observées en PVS à 0,005 molaire. En utilisant cette méthode.Les sceptres sont clairement visibles sur l'image recueillie et les surfaces cellulaires sont lisses, ne présentant aucun signe de déshydratation. En comparaison, les images prises du même E. coli à l'air, comme indiqué ici, montrent souvent des structures invisibles en milieu liquide. Dans ce cas, les cellules présentent un aspect annulaire dû à la déshydratation, et des appendices bactériens tels que les FIA peuvent être observés.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des échantillons bactériens pour une imagerie en microscopie à fluorescence (FM) dans un environnement liquide. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure, à condition que les microsurfaces recouvertes de gélatine aient été préparées au préalable. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de choisir la bonne gélatine et d'utiliser une concentration appropriée de bactéries selon ce protocole.D'autres mesures, telles que l'utilisation du levier de la sonde FN comme outil de détection de force afin d'effectuer des mesures de force sur les surfaces bactériennes, peuvent être réalisées. De plus, des molécules sondes spécifiques peuvent être fixées sur la pointe de microscopie à force atomique (AFM) pour interagir avec des cibles spécifiques à la surface bactérienne, permettant ainsi d'identifier et de mesurer les forces d'interaction. En général, n'oubliez jamais que si vous travaillez avec des bactéries pathogènes, des précautions doivent toujours être prises lorsque vous utilisez cette méthode.

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JoVE Journal

Bioengineering

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Un mode tapping microscope à force atomique (AFM) Méthode pour la visualisation de l'ADN plasmidique, protéines cytoplasmiques et complexes ADN-protéine est décrite. La méthode comprend d'autres approches pour la préparation d'échantillons pour l'imagerie AFM après manipulation biochimique. Spécifiques d'ADN contenant les régions interacting protein sont observées dans des conditions quasi-tampon physiologique.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Les informations spatio-temporelles sur les protéines dynamiques à l’intérieur des cellules vivantes sont cruciales pour comprendre la biologie. Un type de microscopie à super-résolution appelé microscopie à illumination rapide structurée en 3D (f3D-SIM) révèle des informations uniques sur l’anneau cytocinétique Z chez les bactéries : à la fois son apparence en forme de perle et la dynamique rapide de FtsZ à l’intérieur de l’anneau.

Super-résolution d&#39;imagerie de l&#39;Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

Ce protocole décrit l’immobilisation covalente de protéines avec un hétérobifonctionnel agent de couplage silane aux surfaces d’oxyde de silicium conçu pour la spectroscopie de force force atomique microscopie basée seule molécule qui est illustrée par la interaction de RrgA (adhésine pilus-1 pointe de S. pneumoniae) avec la fibronectine.

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Nous décrivons une procédure simple lithographique pour l’immobilisation des molécules d’ADN gène-longueur sur une surface, ce qui peut être utilisée pour réaliser des expériences d’expression de gène acellulaire sur biopuces.

Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser le microscope de force atomique (AFM) cantilevers avec une seule cellule T et particule de perle pour des études immunologiques. Des procédures pour sonder la liaison de cellule T-dendritic à paire simple par AFM et pour surveiller la réponse cellulaire en temps réel des macrophages à une seule particule solide par AFM avec la formation image de fluorescence sont montrées.

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La microscopie à force atomique combinée à la spectroscopie infrarouge comme outil pour sonder la chimie d’une seule bactérie

Nous présentons ici un protocole pour étudier les propriétés mécaniques intracellulaires de cellules embryonnaires isolées de poisson-zèbre en confinement tridimensionnel avec mesure directe de la force par un piège optique.

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Ici, nous présentons l’application de la microscopie à force atomique (AFM) comme une méthode simple et rapide pour la caractérisation bactérienne et analysons des détails tels que la taille et la forme bactériennes, les biofilms de culture bactérienne et l’activité des nanoparticules en tant que bactéricides.

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Procédé d’immobilisation verticale pour analyse de microscopie accélérée dans des cyanobactéries filamenteuses

Apprenez à immobiliser des bactéries vivantes sur du mica recouvert de gélatine pour l'imagerie par microscopie à force atomique en milieu liquide. Cette méthode permet d'observer Gram-négatifs et Gram-positifs sans traitement chimique.

Immobilisation bactérienne pour l'imagerie par microscopie à force atomique

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