Immobilisation covalente de protéines pour la spectroscopie de Force seule molécule

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biophysique, telles que la force d’une seule protéine dans les interactions protéiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour immobiliser un large éventail de biomolécules différentes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car la manipulation de la sonde en porte-à-faux du microscope à force atomique et le fonctionnement du microscope à force atomique lui-même peuvent être difficiles.

Pour commencer, mettez des gants résistants aux acides, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire. Sous une hotte, utilisez de l’isopropanol dans des lingettes de précision non pelucheuses. Enlevez toute poussière grossière et toute contamination de plusieurs lames de verre.

Transférez les lames propres dans un bocal rempli d’acide chlorhydrique dilué avec de l’eau doublement distillée. Fermez le bocal avec un couvercle approprié et placez-le dans un bain à ultrasons pendant 90 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez les sondes cantilever AFM en nitrure de silicium sur une lame en verre propre avec la pointe vers le haut.

Transférez la lame dans une chambre imperméable à la lumière UV et irradiez la lame avec une lumière ultraviolette par le haut pendant au moins 90 minutes. Après cela, remplacez l’acide chlorhydrique dans le pot de coloration par de l’eau doublement distillée, en veillant à ne pas laisser sécher la surface du verre. Fermez le bocal avec le couvercle et remettez-le dans le bain à ultrasons pendant encore 10 minutes.

Pendant ce temps, dissoudre l’acide polyéthylène glycol d’éthoxysilane dans un mélange d’éthanol et d’eau distillée deux fois jusqu’à une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre. Fermez hermétiquement cette solution afin d’éviter l’évaporation de l’éthanol. Lorsque vous êtes prêt, versez la solution de silane dans deux boîtes de Pétri séparées.

Placez les lames en verre propre dans une boîte de Pétri et le porte-à-faux dans l’autre. À l’aide d’un parafilm, fermez hermétiquement les deux plaques pour éviter que l’éthanol ne s’évapore. Incuber les plaques fixes pendant 90 minutes à température ambiante.

Après cela, utilisez trois béchers consécutifs contenant de l’éthanol pur pour laver à la fois le cantilever et les lames de verre. Placez le cantilever lavé sur une lame en verre propre. Transférez les lames de verre fonctionnalisées dans le pot de coloration.

Faites durcir les deux dans un four à 110 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, stockez les échantillons de verre silanisé et le porte-à-faux dans un dessiccateur sous vide jusqu’à une semaine. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’immobilisation aléatoire des protéines, préparez une solution contenant de l’EDC et du NHS dans une solution saline tamponnée au phosphate standard, comme indiqué dans le protocole de texte.

Couvrez les lames de verre recouvertes de silane avec cette solution. Placez les sondes cantilever silanisées dans une goutte de la solution ECD/NHS. Incuber les deux pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, rincez à la fois le cantilever et les lames dans trois béchers consécutifs afin d’éliminer complètement tout excès d’EDC/NHS. Transférez les lames de verre activées dans une boîte de Pétri équipée d’un mouchoir humide. Ajoutez une gouttelette de la solution protéique souhaitée dans la zone activée par l’EDC/NHS des lames de verre et scellez la boîte de Pétri à l’aide d’un parafilm et incubez les sondes à température ambiante.

Ajoutez une gouttelette de la solution protéique souhaitée dans la boîte en porte-à-faux équipée d’un tissu humide. Ensuite, lavez soigneusement les sondes en porte-à-faux avec du PBS. Placez les sondes dans la gouttelette dans la boîte et fermez la boîte.

Incuber les sondes à température ambiante. Après cela, marquez la zone de la gouttelette de protéine à l’arrière des lames de verre. Lavez soigneusement les lames de verre et les sondes en porte-à-faux à l’aide de trois béchers consécutifs remplis de PBS.

Placez les sondes lavées dans un récipient contenant une solution saline tamponnée au Tris pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez soigneusement les lames de verre et les sondes en porte-à-faux avec du PBS. Conservez-les dans des boîtes de Pétri séparées recouvertes de PBS jusqu’au moment de les utiliser.

Fixez une lame en verre fraîchement nettoyée sur le porte-échantillon AFM et couvrez-la d’un tampon PBS. Ensuite, fixez la sonde en porte-à-faux préparée sur le support en porte-à-faux et placez-la dans la tête AFM. Mouillez soigneusement le cantilever avec une goutte de tampon PBS.

Déplacez lentement le cantilever vers la surface d’étalonnage jusqu’à ce que le cantilever soit complètement immergé dans le tampon PBS, tout en restant à l’écart de la surface d’étalonnage. Utilisez soit le microscope optique à vue de dessus, soit le microscope inversé de l’AFM pour positionner le laser à l’arrière du cantilever. Placez le spot laser près de l’extrémité du porte-à-faux, près de l’endroit où se trouve la pointe, et ajustez la position sur la photodiode du détecteur à quatre quadrants de l’AFM de sorte que le faisceau laser réfléchi soit positionné au centre de la photodiode.

Ensuite, ouvrez le gestionnaire d’étalonnage dans le logiciel AFM. Pour commencer à calibrer la sensibilité en porte-à-faux et la constante de ressort, approchez-vous soigneusement de la surface du substrat et enregistrez une courbe de force-distance. Ajustez une ligne droite à la partie la plus raide de la courbe de force de rétraction où la pointe est en contact avec la surface du substrat pour déterminer la sensibilité du levier optique.

Rétractez le cantilever de la surface de l’échantillon et enregistrez plusieurs spectres de bruit thermique avec le cantilever à au moins 100 microns de la surface et installez un oscillateur harmonique, fourni par le logiciel AFM, sur les spectres de bruit thermique pour déterminer la constante de ressort du cantilever. Après cela, rétractez lentement le porte-à-faux et retirez-le de la solution. Retirez la surface en verre utilisée pour l’étalonnage en porte-à-faux et remplacez-la par la surface de l’échantillon contenant les protéines immobilisées.

Déplacez lentement le porte-à-faux humide vers la surface de l’échantillon jusqu’à ce que le cantilever soit complètement recouvert de tampon PBS, tout en restant éloigné de la surface du substrat. Approchez-vous de la surface et enregistrez plusieurs courbes de distance de force à différents endroits de la surface de l’échantillon avec une force de contact de 250 piconewtons, un temps de contact d’une seconde, une longueur de rétraction de deux micromètres et une vitesse de rétraction d’un micromètre par seconde. Dans le logiciel de traitement des données, sélectionnez l’icône Ouvrir le lot de Force Scan' pour ouvrir les fichiers de courbes de force mesurées.

Sélectionnez l’icône Recalibrer la diflection en V en ajustant la sensibilité dans la constante de ressort pour convertir la diflection en porte-à-faux en force directement proportionnelle. Ensuite, sélectionnez l’icône Soustraction de la ligne de base pour soustraire la ligne de base du canal de rétraction dans une région de la courbe de force éloignée de la surface, qui définit également le niveau de force zéro. Sélectionnez l’icône Détermination du point de contact pour définir le point où la pointe entre en contact avec l’échantillon.

Sélectionnez l’icône Séparation de l’échantillon de pointe pour convertir le signal de hauteur en séparation de l’échantillon de pointe. En plus de soustraire la position du point de contact, cela soustrait la flexion en porte-à-faux pour calculer la distance entre la surface du substrat et la pointe AFM. Sélectionnez l’icône Ajuster un modèle de chaîne polymère et choisissez le modèle Chaîne extensible de type ver pour filtrer les traces de distance de force à la recherche de pics de force se produisant à des longueurs de rupture supérieures à 70 nanomètres.

Triez les interactions non spécifiques et appliquez le modèle de chaîne extensible de type ver aux pics sélectionnés. Dans cette étude, les protéines sont immobilisées de manière covalente avec une orientation aléatoire via leurs amines primaires accessibles. Une image AFM de la couche de polymère silanisé ne montre que de petites ondulations de surface d’une hauteur variant entre environ deux et cinq nanomètres.

Cependant, la surface fonctionnalisée avec la fibronectine présente des molécules de fibronectine d’environ 10 nanomètres de haut. Un examen plus approfondi révèle que la structure dimérique des molécules peut être reconnue. Ces molécules semblent compactes, avec une hauteur de quatre à cinq nanomètres au-dessus du revêtement de surface PEG et une longueur d’environ 120 nanomètres.

Les forces d’interaction de la RRGA avec la fibronectine sont ensuite étudiées. Les courbes représentatives de séparation des échantillons de pointe enregistrées à une vitesse d’un micron par seconde ont montré une faible interaction de fond et des événements d’interaction bien formés, qui sont ensuite ajustés, à l’aide d’un modèle de chaîne extensible de type ver. Le tracé des résultats de cet ajustement montre que, après avoir surmonté les interactions de surface non spécifiques lors de l’étirement des liaisons PEG, jusqu’à 19 % des courbes de force ont des événements de rupture avec une force de rupture moyenne de 52 piconewtons pour l’interaction fibronectine RRGA et à une distance d’échantillonnage de pointe d’environ 100 nanomètres.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’en fonction de paramètres tels que le temps de contact ou la vitesse de rétraction, les données de spectroscopie de force de molécule unique contiennent plusieurs informations et que ce protocole ne peut être qu’un premier pas vers une analyse complète des données. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions entre molécules uniques, elle peut également être utilisée pour étudier les interactions au niveau de la cellule unique. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la spectroscopie de force de cellule unique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que comment des cellules entières interagissent avec des surfaces recouvertes de protéines.

N’oubliez pas que travailler avec des acides et des rayons UV peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants résistants aux acides et une chambre imperméable aux rayons UV doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.