Extraction basée sur l’immunoaffinité de peptides ubiquitinylés : une technique d’extraction sélective de peptides marqués à l’ubiquitine à partir de fractions peptidiques purifiées

L’ubiquitination des protéines est caractérisée par l’ajout d’ubiquitine - une mini-protéine régulatrice - via ses résidus de di-glycine aux résidus de lysine de la protéine de substrat. Cela génère une liaison lysine-glycine-glycine entre la protéine du substrat et l’ubiquitine.

Pour isoler les peptides marqués à l’ubiquitine, commencez par prendre un mélange de peptides.

Traitez ces peptides avec un cocktail d’enzymes endonucléases. Au cours du traitement, les enzymes Lys-C et trypsine clivent efficacement les peptides ubiquitinylés au niveau du résidu d’arginine, ce qui donne des fragments peptidiques contenant un motif de diglycine caractéristique.

Ajoutez ces fragments de peptides à une bouillie de billes d’hydrogel conjuguées à des anticorps.

Ces anticorps contiennent un site de reconnaissance de la diglycine, qui se lie exclusivement aux peptides ubiquitinylés, formant un complexe peptide-bille.

Centrifugeuse pour granuler des complexes peptides-billes ubiquitinylés. Retirer le surnageant non ubiquitinylé contenant du peptide non lié.

Chargez les complexes sur un ensemble de filtres. Centrifugeuse pour retirer le tampon et piéger les billes conjuguées aux peptides.

Ajoutez un réactif acidifié qui abaisse le pH, provoquant le désengagement des peptides des billes.

Récupérer les peptides libres du filtrat. Chargez-les sur un filtre frais avec une matrice hydrophobe. Les peptides restent dans la matrice tandis que les sels acides sont emportés.

À l’aide d’un solvant approprié, détachez les peptides.

Transférez les peptides ubiquitinylés dans un tube frais et séchez-les pour éliminer toute trace de solvant.

Un lot d’anticorps à motif résiduel d’ubiquitine conjugué à la suspension de billes d’agarose de protéine A est divisé en six fractions égales. Dissoudre les trois fractions peptidiques selon les instructions du manuscrit et faire tourner les débris.

Ajoutez les surnageants des trois fractions à la boue de billes tout en gardant les trois autres fractions sur de la glace et incubez-les pendant 2 heures à 4 degrés Celsius sur une unité rotateur.

Ensuite, faites tourner les perles. Transférez le surnageant dans un nouveau lot de billes et répétez l’incubation avec les trois fractions de boue de billes restantes.

Stockez les surnageants pour une analyse ultérieure du protéome global et transférez les billes dans des pointes de pipette de 200 microlitres équipées d’un bouchon filtrant GF/F.

Placez les pointes dans des tubes de 1,5 millilitre équipés d’un adaptateur de pointe de centrifugation et lavez les billes trois fois avec 200 microlitres de tampon IAP glacé, puis trois lavages avec de l’eau purifiée glacée

Faites tourner les colonnes à 200 x g pendant 2 minutes entre les lavages, en veillant à ne pas laisser la colonne sécher. Après le lavage final, éluez les peptides avec deux cycles de 50 microlitres de TFA à 0,15 %. Dessalez les peptides avec une pointe en étage C18 et séchez-les par centrifugation sous vide.

• Ubiquitination – Addition of ubiquitin to a substrate protein via a lysine-glycine-glycine linkage.
• Ubiquitin Lysine Linkage – A crucial bond between ubiquitin and the substrate protein.
• Ubiquitinylated peptides – Peptide fragments containing a signature di-glycine motif due to ubiquitination.
• Purified peptides – Peptides that have been isolated and rid of contaminants.
• Ubiquitin Affinity Matrix – A medium used for binding and isolating ubiquitinylated peptides.

• Introduce ubiquitination – the process of adding ubiquitin to substrate proteins (e.g., ubiquitin).
• Outline key peptides – explaining the process of creating peptide fragments with unique motifs (e.g., ubiquitin lysine linkage).
• Explain peptide purification – a brief walkthrough of the isolation and purification of peptides process.
• Connect to experiment – Highlight how this information pertains to the experimental process of using the PT-141 peptide.

• What is ubiquitination and how does it involve lysine-glycine-glycine linkage?
• How are ubiquitinylated peptides created and isolated?
• What is the role of ubiquitin affinity matrix in the purification process?

• Describe practical applications – Use in drug discovery and various research analysis (e.g., PT-141 peptide).
• Identify Industry impact – Benefits in pharmaceutical and biotechnological sectors.
• Highlight Societal importance – Potential to boost health sector by leading to novel treatment strategies.
• Link to scientific advancements – Contribution to a deeper understanding of protein behavior and function.