Extraction basée sur l’immunoaffinité de peptides ubiquitinylés : une technique d’extraction sélective de peptides marqués à l’ubiquitine à partir de fractions peptidiques purifiées

L’ubiquitination des protéines est caractérisée par l’ajout d’ubiquitine - une mini-protéine régulatrice - via ses résidus de di-glycine aux résidus de lysine de la protéine de substrat. Cela génère une liaison lysine-glycine-glycine entre la protéine du substrat et l’ubiquitine.

Pour isoler les peptides marqués à l’ubiquitine, commencez par prendre un mélange de peptides.

Traitez ces peptides avec un cocktail d’enzymes endonucléases. Au cours du traitement, les enzymes Lys-C et trypsine clivent efficacement les peptides ubiquitinylés au niveau du résidu d’arginine, ce qui donne des fragments peptidiques contenant un motif de diglycine caractéristique.

Ajoutez ces fragments de peptides à une bouillie de billes d’hydrogel conjuguées à des anticorps.

Ces anticorps contiennent un site de reconnaissance de la diglycine, qui se lie exclusivement aux peptides ubiquitinylés, formant un complexe peptide-bille.

Centrifugeuse pour granuler des complexes peptides-billes ubiquitinylés. Retirer le surnageant non ubiquitinylé contenant du peptide non lié.

Chargez les complexes sur un ensemble de filtres. Centrifugeuse pour retirer le tampon et piéger les billes conjuguées aux peptides.

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