Name: Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Découvrez l'analyse des topologies de chaînes d'ubiquitine par surveillance parallèle des réactions en spectrométrie de masse. Cette méthode permet l'identification et la quantification précises des peptides modifiés pour la recherche en protéomique.

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Les auteurs remercient Céline Jeanty pour son aide dans la création de granulés cellulaires avec traitement du MG-132 tel que décrit dans les résultats représentatifs et Elise Mommaerts pour sa fourniture de granulés E. coli utilisés dans le protocole.

1. Préparation d’une norme de peptide lourd
<ol><li>Selon le fournisseur et la qualité des peptides lourds achetés, les peptides lourds devront être dilués. Ce protocole utilisait les séquences peptidiques rapportées dans le tableau 1,l’acide aminé c-terminal ayant été modifié en Lysine(13C615N2-lysine) ou arginine(13C615N4-arginine).<ol>
<li>Mélanger les peptides lourds, diluer le mélange avec 50% d’acétylonitrile (ACN) pour créer un mélange de peptide avec chaque peptide à 10 μM.</li>
		<li>Créer des aliquots du mélange peptidique et les conserver à -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Exemple de lyse REMARQUE : La stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en compte lors de la préparation de l’échantillon. Gardez les échantillons biologiques et les tampons refroidis à 4 °C et ajoutez des échantillons au tampon de stabilisation de l’ubiquitine aussi rapidement que possible.<ol>
<li>Préparer une solution de 1 M NH4HCO3 (bicarbonate d’ammonium) dans l’eau et ajuster le pH à 8 à l’aide de 1 M NaOH.</li>
		<li>Préparer une solution de 200 mM N-éthylmaleimide (NEM) dans l’eau.</li>
		<li>Préparer le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à l’aide de 8 M d’urée dans 50 mM NH4HCO3/10mM NEM. Le tampon de stabilisation ubiquitine doit être préparé fraîchement à chaque fois. REMARQUE : Une solution de 5 mL de 8 M d’urée nécessitera beaucoup moins de 5 mL d’eau étant donné l’expansion de l’eau lorsqu’elle est dans une solution saturée d’urée. ATTENTION: Ne préparez pas le tampon au-dessus de 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.</li>
		<li>Resuspendez l’échantillon biologique à étudier dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine visant 0,5 μg/μL de protéines et lyse les cellules avec une méthode appropriée pour l’échantillon. Une méthode de sonication composée de trois impulsions de 10 s avec un sonificateur SFX 150 Branson réglé à 70% d’intensité avec 10 ruptures de glace entre chaque impulsion, a été utilisée pour les lignées cellulaires dans ce protocole.</li>
		<li>Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.</li>
		<li>Transférer le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse à faible teneur en protéines. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade si nécessaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de l’échantillon et des contrôles
	<ol>
<li>Si les échantillons sont congelés, mélanger (p. ex., à l’aide d’un thermomixeur) pendant qu’ils sont décongelés pour dissoudre rapidement l’urée. ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.</li>
		<li>Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.</li>
		<li>Transférer 20 μg d’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse fraîchement à faible liaison et ajuster le volume à 50 μL avec tampon de stabilisation de l’ubiquitine.</li>
		<li>Créez un contrôle négatif à l’aide d’un volume normalisé de tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Dans cet échantillon, aucune version légère de chaque peptide ne devrait être présente, permettant l’observation de toute contamination légère résultant des peptides lourds spike-in. Ce contrôle négatif a également été utilisé pour la planification du temps de rétention du PRM décrite à l’article 3.1.</li>
		<li>Un contrôle positif a également été créé avec le tampon de stabilisation de l’ubiquitine et l’ajout de types de chaîne disponibles dans le commerce au volume normalisé du tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Généralement, K63, K48, et M1 sont disponibles. Dans les résultats représentatifs 20 ng de K48, K63, et M1 ont été utilisés.</li>
	</ol></li>
	<li>Réduction, alkylation et digestion
	<ol>
<li>Préparer une solution de bicarbonate d’ammonium de 50 mM (NH4HCO3)dans l’eau et ajuster l’échantillon au pH = 8 avec 1 M NaOH.</li>
		<li>Une culture d’E. coli cultivée dans le bouillon LB a été centrifugée 5 000 x g pendant 5 min pour former une pastille, qui a ensuite été lavée 2x avec PBS avant la résuspension dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à 5 μg/μL.</li>
		<li>Ajouter 1 μg de lysate E. coli à chaque échantillon et contrôler. Ce protocole utilise E. coli (DH10B), mais tout lysate complexe sans ubiquitine peut être utilisé. Notez que l’ubiquitine est commune à tous les eucaryotes. REMARQUE : L’utilisation d’une matrice de lysate E. coli réduit la perte de peptides due à l’adhérence non spécifique aux plastiques. Ceci est particulièrement visible dans le contrôle négatif ou des échantillons avec une teneur limitée en protéines et a un fort impact sur l’observation de K6312.</li>
		<li>Préparer une solution de tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) de 500 mM dans l’eau de qualité SP (la TNT peut être utilisée comme alternative).</li>
		<li>Réduire les échantillons et les contrôles par l’ajout du PTCE à une concentration finale de 50 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 30 min à température ambiante (RT). Si la TNT est utilisée, la température doit être élevée à 50 °C. ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.</li>
		<li>Préparer une solution de chlorocétamide de 550 mM (CAA) en NH4HCO3. Stockez dans le noir.</li>
		<li>Alkylate les échantillons et les contrôles en ajoutant CAA à une concentration finale de 55 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 20 min à RT dans l’obscurité. REMARQUE : Caa est employé au lieu de l’iodoacetamide comme agent de réduction pour diminuer le risque d’une modification double de carbamidomethyl (114.0429) sur un résidu de lysine étant confondu avec une modification de -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Ajouter l’endopeptidase LysC aux échantillons à un rapport de 1:25 (w/w) à la teneur en protéines. Incuber pendant 3 h à 37 °C.</li>
		<li>Diluer les échantillons et les contrôles avec 200 μL de 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Ajouter la trypsine aux échantillons à un rapport de 1:25 w/w à la teneur en protéines. Incuber pendant 12 h à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter une solution d’acide formique (FA) de 10 % dans l’eau de qualité SP à un rapport v/v de 1:10 à chaque échantillon et contrôler l’échantillon. Vérifiez que le pH est <3) avant le nettoyage C18 et ajouter plus d’acide formique si nécessaire.</li>
		<li>À chaque échantillon et contrôle ajouter 0,5 μL de la norme peptidique lourde créée dans la section 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Nettoyage peptidique
	<ol>
<li>Plusieurs fabricants offrent des conseils ou des assiettes de nettoyage C18. Suivez les instructions du fabricant pour le produit utilisé, et séchez les peptides élités dans une centrifugeuse sous vide, prête pour l’analyse de la SP.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse par LC-MS/MS
<ol><li>Exécutez l’analyse prm initiale sur la norme peptidique lourde d’une manière imprévue.<ol>
<li>Resuspendez les échantillons séchés dans 10 μL de tampon de chargement de SP 2 % d’acide trifluoroacétique ACN/0,05 % d’acide trifluoroacétique (AFE).</li>
		<li>Équipez un HPLC d’une colonne analytique de phase inverse C18 (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 perles Å C18) conçue pour les gradients linéaires de nanoflow MS. Formez des gradients linéaires échangeant de l’eau de qualité MS complétée par 0,1 % de FA avec acn contenant 0,1 % de FA. Une colonne de piège sacrificielle (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 perles Å C18) pour préserver la durée de vie de la colonne analytique a été utilisée ici, mais n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Couplez la sortie de la colonne analytique à une source nano-ESI sur un spectromètre de masse haute résolution.</li>
		<li>Utilisez une méthode protéomique ciblée appropriée pour le spectromètre de masse. Par exemple, sur un Q-Exactive plus une méthode de deux expériences, cycle entre une SEp complète et une expérience PRM. Pour l’expérience full MS, une résolution de 120 000 avec un objectif AGC de 1e6 et 240 ms comme IT maximum a été utilisée. Pour l’expérience PRM, la même cible AGC et le maximum de TI ont été utilisés avec une résolution inférieure de 60 000 et une fenêtre d’isolement de 1,2 m/z.</li>
		<li>Injectez 200 ng de contrôle négatif sur la colonne analytique à l’aide de l’autosampler HPLC. Appliquer un gradient linéaire à l’échantillon sur la colonne analytique, augmentant la concentration d’ACN de 2 à 25 % sur une période d’environ 45 min. REMARQUE : La concentration d’ACN de 25 % est plus faible que d’habitude pour la protéomique en raison de la faible nature hydrophilique des peptides typiques caractéristiques de la topologie de l’ubiquitine. Si d’autres peptides doivent être quantifiés, une concentration plus élevée d’ACN peut être souhaitée pour atteindre une bonne séparation de cible.</li>
		<li>Analyser les résultats de l’exécutement de planification tel que décrit à la section 4.2 pour créer une liste d’inclusion planifiée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse des échantillons<ol>
<li>Exécutez les échantillons restants tels que décrits pour la planification en 3.1 en dehors de l’utilisation de la liste d’inclusion planifiée créée à la section 4.2. REMARQUE : Un blanc doit être exécuté après le contrôle positif pour s’assurer qu’aucun report de l’exécuter précédent n’est détecté dans les échantillons ultérieurs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse logicielle
<ol><li>Créez une liste d’inclusion de mise en forme appropriée pour la SP utilisée. Ce protocole a utilisé le logiciel open source Skyline (version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), qui offre un soutien et une aide bien documentés. Une liste d’inclusion peut être créée pour plusieurs spectromètres de masse à l’aide de l’installation de liste d’isolement des exportations.<ol>
<li>Ouvrez un nouveau document Skyline.</li>
		<li>Choisissez des modifications isotopiques lourdes, le cas échéant, aux peptides lourds caractéristiques de la topologie. Dans paramètres| Paramètres peptidique sous l’onglet Modification, cliquez sur le champ nom pour voir la modification potentielle. La sélection est basée sur l’état isotopique des peptides lourds achetés. Dans cet exemple, des peptides synthétiques transportant soit une lysine lourde(13C615N2-lysine) soit une arginine lourde(13C615N4-arginine) au C-terminus ont été utilisés. Les étiquettes appropriées seraient : « Étiquette : 13C(6)15N(2) (C-term K) » et « Label:13C(6)15N(4) (C-term R) ».</li>
		<li>Sélectionnez Paramètres| Transition. Sous l’onglet Filtre comprennent Les charges précurseurs 2, 3, 4.</li>
		<li>Insérez des peptides en sélectionnant Edit| Insérez| Peptides.</li>
		<li>Remplissez les champs pertinents, y compris la séquence peptidique caractéristique de la topologie et un nom protéique (p. ex., « Chaîne-K63 »).</li>
		<li>Élargissez chaque peptide maintenant indiqué dans le panneau Cibles. Supprimez les états de charge non désirés. L’état de charge préféré et l’énergie de collision, qui peuvent différer en fonction du spectromètre de masse utilisé, pour chaque peptide caractéristique de la topologie sont indiqués dans le tableau 1.</li>
		<li>Pour chaque peptide caractéristique de la topologie (à l’exception de M1 où le GG est inclus dans la séquence) cliquez à droite sur la séquence et sélectionnez Modifier. Ajouter un GG comme une modification structurelle en cliquant sur le champ de nom et la sélection <Afficher tousles ... > avant de sélectionner "GlyGly (K)« .</li>
		<li>Exporter la liste d’isolement Fichier| L’exportation| Liste d’isolement, sélectionnez le type d’instrument, et définissez le type de méthode à la norme. Sélection OK ouvrira une invite pour enregistrer un fichier *.csv qui peut être utilisé pour créer une méthode PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Créez une liste d’inclusion planifiée basée sur un lourd processus de planification peptidique expliqué ici à l’aide du logiciel Open source Skyline.<ol>
<li>Créez une liste de cibles telle que décrite à la section 4.1.</li>
		<li>Importez l’exécutement de planification en 3.1 en sélectionnant le fichier| L’importation| Résultats.</li>
		<li>Examinez les pièces d’identité. Le signal lourd pour chaque peptide est observable en cliquant sur la masse pour chaque entrée de peptide lourd. La reconnaissance correcte du pic est souvent déterminée automatiquement, mais le logiciel peut nécessiter une curation manuelle en sélectionnant le pic en utilisant le clic et la traînée sous l’axe x.</li>
		<li>Les temps de rétention sélectionnés pour les variantes lourdes sont également appliqués aux versions légères, créant ainsi un calendrier pour le PRM. La fenêtre de planification peut être modifiée sous Paramètres| Paramètres Peptide à l’aide de l’onglet Prédiction, en changeant la fenêtre de temps.</li>
		<li>Une liste d’inclusion planifiée peut maintenant être exportée à l’aide de File| L’exportation| Liste d’isolement et sélection du type d’instrument approprié et le type de méthode de réglage à scheduled.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser les données.<ol>
<li>Importez les échantillons de la même manière que pour l’analyse de l’exécutement de planification à la section 4.2.</li>
		<li>Après l’importation complète de tous les échantillons, la curation des transitions est recommandée. Il s’agit du processus par lequel les transitions avec des interférences ou de faibles rapports signal-bruit sont supprimées. Un exemple de chromatogramme avant et après la curation est indiqué dans la figure 4.</li>
		<li>Les données peuvent maintenant être exportées soit en cliquant à droite sur les graphiques pertinents et en sélectionnant les données copy, soit en sélectionnant le fichier| L’exportation| Résultats.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

L’analyse de l’état d’ubiquitine dans un protéome est d’une importance croissante pour une grande variété de questions biologiques. La description de l’état d’ubiquitination d’un échantillon doit se concentrer non seulement sur le profil des protéines étant ubiquitinées, mais aussi sur la topologie d’une telle ubiquitination. L’évaluation de cette topologie par SP ciblée, telle que décrite ici, a un rôle à jouer dans un large éventail d’études biologiques.
Il faut comprendre que le protocole d...

La régulation étroite de la fonction et de la stabilité des protéines est d’une importance primordiale, car ils sont les principaux moteurs du contrôle phénotypique de la biologie. La fonction d’une protéine est construite à partir de deux composants : sa séquence intrinsèque de polypeptide et toutes les modifications posttranslationnelles (MPT). Divers M PTM chimiques ont été identifiés, y compris la glycosylation, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation1. En 1975, Goldstein et coll.2 ont identifié une petite protéine et l’ont nommée ubiquitine en raison de sa nature omniprésente. L’ubiquitine s’est trouvée importante dans la dégradation deprotéine 3. Cependant, depuis lors, il a été établi que la fonction de l’ubiquitine en tant que molécule de signalisation s’étend bien au-delà de la régulation de la stabilité des protéines. La signalisation d’ubiquitine est impliquée dans un large éventail d’autres fonctions biologiques, telles que la stabilisation de protéine, l’autophagie, le contrôle de cycle cellulaire, et le trafic deprotéine 4.
Alors que d’autres MNP sont généralement binaires (c.-à-d. que la protéine est modifiée ou non modifiée) pour un site donné, l’ubiquitine peut modifier une protéine à la fois comme monomère ou comme chaîne polymérique, l’ubiquitine ci-jointe étant elle-même ubiquitinée. En outre, cette chaîne de polyubiquitination peut se développer dans plusieurs topologies avec l’ubiquitination de l’ubiquitine précédente s’attachant à l’un des huit sites deliaison 5,6. L’ubiquitine est transférée par un processus enzymatique en plusieurs étapes (figure 1) où le C-terminus d’ubiquitine est relié à l’un de ses sept résidus de lysine (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou au terminal N de l’ubiquitine précédente (appelée ubiquitination M1 ou linéaire)5,6. Cette topologie de chaîne est la clé du sort de la protéine en cours de modification. Par exemple, la modification avec une chaîne liée au K48 ou au K11 entraîne la dégradation de la protéine modifiée au protéasome, tandis qu’une chaîne linéaire est nécessaire pour l’activation de la signalisation NF-kB. Ainsi, la répartition relative de ces topologies de chaîne est pertinente à une grande variété de questions biologiques.
L’utilisation de la spectrométrie de masse (SP) est particulièrement bénéfique pour l’analyse de la topologie de la chaîne d’ubiquitine car elle ne dépend pas d’interactions basées sur les anticorps ou les affinités7,8, dont beaucoup ont une spécificité limitée et ne font pas de distinction entre les différents types de chaînes. Une autre possibilité de détection est d’utiliser des mutants ubiquitine génétiquement modifiés. Ici, une lysine spécifique est échangée contre de l’arginine, qui ne peut pas soutenir la modification par l’ubiquitine. L’absence de formation de chaîne d’ubiquitine sur la protéine de substrat est alors interprétée comme évidence pour une topologie spécifique9.
L’identification basée sur la SP des protéines ubiquitinées est basée sur le fait que le C-terminus d’ubiquitine contient un résidu d’arginine dans la position 74 qui est reconnu par la trypsine pendant la préparation protéolytique des échantillons pour l’analyse de la SP, séparant la double glycine du terminal C. Ce GlyGly (-GG) reste attaché au groupe ε-aminé du résidu de lysine de la protéine de substrat. Pour l’analyse de topologie d’ubiquitine, la modification se produit sur l’un des sept résidus de lysine de l’ubiquitine. Cela crée un ensemble de sept peptides clés qui transportent un résidu de lysine qui est modifié par GG, spécifique pour chacune des topologies (Figure 2). Par exemple, avec la topologie K06, la lysine à la position 6 sur la séquence des acides aminés sera protégée de la digestion tryptique avec une modification de -GG de 114 Da ajoutée à cette lysine.
L’identification de peptides prédéterminés spécifiques par la SP est appelée protéomique ciblée, ou plus précisément acquisition ciblée de peptides10. Deux méthodes ont été développées en fonction des performances du spectromètre de masse utilisé. Il s’agit d’une surveillance des réactions sélectionnée (GRS), également appelée surveillance des réactions multiples (MRM) et de la surveillance parallèle des réactions (PRM). SRM implique la sélection des transitions composées du précurseur m/z et de l’ion produit m/z. Inversement, PRM ne nécessite que le précurseur m/z. Après sélection, une analyse complète des ions du produit est effectuée. Cela a l’avantage qu’aucune sélection d’ions de produit appropriés pour la quantitation sur le spectromètre de masse spécifique n’est nécessaire avant lamesure 11. SRM et PRM peuvent, selon l’instrument, être programmés. La planification est la pratique consistant à attribuer une fenêtre de temps au cours de laquelle un ion particulier sera inclus pour analyse, car les peptides s’échappent à des moments de rétention définis à partir du système chromatographique. La réduction du nombre d’ions interrogés à un moment donné augmente la fréquence des interrogatoires des ions prévus à ce moment-là, améliorant ainsi l’exactitude des données.
En général, l’application de la protéomique ciblée pour la topologie de l’ubiquitine est la même que toute autre expérience protéomique ciblée. Cependant, deux différences clés sont importantes : premièrement, la stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en considération. Il existe de multiples enzymes déubiquitines puissantes (DUB) qui dégradent rapidement les chaînes lors de la lyse cellulaire. Les protéases spécifiques à l’ubiquitine se équipent en deux catégories, les thioesterases et les métalloproteases. La plupart des ubiquitine-hydrolases sont des thioesterases et portent un résidu de cystéine dans leur centre actif. En alkylating ce résidu de cystéine, ils peuvent être inactivés. En tant que tel, l’utilisation de tampons de stabilisation de l’ubiquitine contenant des agents alcalinateurs, comme l’éthylmaleimide N (NEM), et des produits chimiques très dénaturants, et de garder les échantillons réfrigérés est essentielle à une analyse réussie. Deuxièmement, contrairement à d’autres expériences ciblées, le choix du peptide est fixé. Dans une expérience ciblée typique, un peptide protéotypique peut être sélectionné pour une bonne performance chromatographique et ionisation. Pour certains peptides caractéristiques de la topologie tels que K48, ces propriétés sont bonnes, tandis que pour d’autres, elles sont moins souhaitables. Par exemple, la chromatographie K33 dans une configuration typique en phase inverse est pauvre en raison de la formation d’un profil d’élitution étiré, et les faibles propriétés d’ionisation du peptide K27 réduisent sa visibilité par MS12.
Dans ce protocole, nous décrivons comment effectuer l’évaluation de topologie d’ubiquitine d’un échantillon biologique par PRM. Des données d’exemple pour la procédure sont présentées utilisant une perturbation du protéasome utilisant le traitement inhibiteur de MG-132 dans plusieurs types différents de cellules.

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacétamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>lourds JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Colonne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-éthylmaléimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Chaîne de contrôle positif K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Chaîne de contrôle positif K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Chaîne de contrôle positif M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonificateur</td><td>Sonificateur Branson</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixeur Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Eaux &mu ; Élution C18 plaques</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

L’évaluation du profil global des topologies de chaîne d’ubiquitine dans un protéome est d’intérêt pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Le protocole décrit ici tire parti de la modification de la di-glycine (-GG) laissée après la digestion tryptique de l’ubiquitine incorporée dans une chaîne. En quantifiant ces peptides caractéristiques de la topologie, l’abondance relative de chaque topologie de la chaîne d’ubiquitine peut être déterminée. Les étapes nécessaires pour quantifier ces peptides par une expérience parallèle de surveillance des réactions sont signalées en tenant compte de la stabilisation des chaînes d’ubiquitine. La préparation des contrôles lourds, la lyse cellulaire, et la digestion sont décrites avec la configuration appropriée de spectromètre de masse et le flux de travail d’analyse de données. Un exemple de données avec des perturbations dans la topologie de l’ubiquitine est présenté, accompagné d’exemples de la façon dont l’optimisation du protocole peut affecter les résultats. En suivant les étapes décrites, un utilisateur sera en mesure d’effectuer une évaluation globale du paysage de topologie ubiquitine dans leur contexte biologique.

Pour démontrer l’utilisation d’une analyse de chaîne d’ubiquitine par PRM, trois lignes cellulaires ont été choisies : une ligne de cellule de mélanome de souris B16, et les deux lignes communes de cellules humaines A549 (cellules épithéliales alvéolaires alvéolaires adénocaronomiques) et HeLa (cellules cancéreuses cervicales). Ces cultures sont passée à la phase médiane dans les médias appropriés avant d’être traitées avec 0, 10 ou 100 mM MG-132 pendant 4 h avant la récolte. MG-132 est un inhibiteur protéasome empêchant...

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Comme les différentes topologies de chaînes d’ubiquitine ont un large éventail d’effets biologiques, la compréhension des changements dans leur abondance est pertinente pour une grande variété d’états biologiques. L’application de la surveillance des réactions parallèles à l’analyse de la chaîne d’ubiquitine permet d’identifier et de quantifier spécifiquement les topologies de la chaîne d’ubiquitine. Contrairement aux expériences PRM typiques, l’analyse de la topologie de la chaîne d’ubiquitine est limitée à des peptides modifiés spécifiques, dont beaucoup ne sont pas idéaux pour l’analyse MS.La démonstration visuelle de cette technique met en évidence les ajustements et les résultats attendus observés pour ces peptides non idéaux. Commencez par préparer une solution de bicarbonate d’ammonium, une solution de n-éthylmaléimide et un tampon de stabilisation de l’ubiquitine comme décrit dans le manuscrit du texte. Remettre l’échantillon biologique en suspension dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine et lyser les cellules avec une méthode appropriée.Après la lyse cellulaire, centrifugez l’échantillon à 18 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais à faible liaison protéique. Si nécessaire, conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius avant de continuer. Pour décongeler les échantillons, mélangez-les rapidement avec un ThermoMixer et n’utilisez pas de températures supérieures à 50 degrés Celsius.Une fois décongelés, centrifugez les échantillons à 18 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférez 20 microgrammes dans un tube de microcentrifugation frais à faible liaison, puis ajustez le volume à 50 microlitres avec un tampon de stabilisation de l’ubiquitine. Préparez un témoin négatif avec un volume normalisé de tampon de stabilisation de l’ubiquitine et un témoin positif avec le tampon et les types de chaîne disponibles dans le commerce. Préparez une solution de 50 millimolaires de bicarbonate d’ammonium dans de l’eau et ajustez le pH à huit avec une molaire d’hydroxyde de sodium.Granulez une culture d’E. coli par centrifugation à 5 000 fois G pendant cinq minutes. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et mettez-les en suspension dans un tampon de stabilisation de l’ubiquitine à cinq microgrammes par millilitre. Ajouter un microgramme de lysat d’E. coli à chaque échantillon et contrôler.Préparez ensuite 500 millimolaires de PTCE dans de l’eau de qualité MS et ajoutez-le à chaque échantillon jusqu’à une concentration finale de 50 millimolaires. Vortex brièvement les échantillons et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, préparez une solution de chloroacétaldéhyde de 500 millimolaires et de bicarbonate d’ammonium et ajoutez-la aux échantillons et aux témoins jusqu’à une concentration finale de 55 millimolaires.Vortex brièvement les échantillons et incubez-les dans l’obscurité pendant 20 minutes. Ajoutez l’endopeptidase Lys-C aux échantillons et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, diluez les échantillons avec 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires, ajoutez de la trypsine et incuberez-les pendant 12 heures supplémentaires.Le lendemain, ajoutez une solution d’acide formique à 10 % à chaque échantillon et contrôlez selon un rapport volume-volume de 1:10. Vérifiez que le pH est inférieur à trois. Ajoutez ensuite 0,5 microlitre d’étalon peptidique lourd à chaque échantillon.Après le nettoyage standard de l’échantillon de C18, procéder à l’analyse par spectrométrie de masse des échantillons à l’aide d’une méthodologie basée sur la PRM. Pour exporter la liste d’isolement, sélectionnez la liste d’isolement dans le menu d’exportation, sélectionnez le type d’instrument et définissez la méthode sur standard. Cliquez sur OK pour ouvrir une invite permettant d’enregistrer un fichier CSV pouvant être utilisé pour créer une méthode PRM.Ensuite, importez l’exécution de planification en sélectionnant Fichier, Importer et Résultats. Choisissez plusieurs fichiers à importer simultanément et cliquez sur OK, puis sélectionnez les fichiers et attendez la fin de l’importation. Lorsque vous êtes prêt, passez en revue les identifications en cliquant sur la masse pour chaque entrée de peptide lourd.La reconnaissance correcte du pic est souvent déterminée automatiquement, mais une sélection manuelle peut être nécessaire. Les temps de rétention sélectionnés pour les variantes lourdes sont également appliqués aux versions légères, créant ainsi un calendrier pour les PMR. Pour modifier la fenêtre de planification, sélectionnez le pic et cliquez sur Paramètres et Paramètres peptidiques.Modifiez ensuite la fenêtre de temps dans l’onglet Prédiction. La liste d’inclusion de la planification peut ensuite être exportée à l’aide de Fichier, Exporter et Liste d’isolement. Choisissez le type d’instrument approprié, définissez le type de méthode sur Programmé, cliquez OK.To analyser les données, importer tous les échantillons et effectuer la curation, en supprimant les transitions avec interférence ou les mauvais rapports signal/bruit, puis exportez les données en cliquant avec le bouton droit de la souris sur les graphiques pertinents et en sélectionnant Copier les données ou en cliquant sur Fichier, Exporter et Rapport.Le traitement avec l’inhibiteur du protéasome MG-132 empêche la dégradation des protéines conjuguées à l’ubiquitine, ce qui entraîne une augmentation de la chaîne K48 dans la lignée cellulaire B16 du mélanome de souris, ainsi que dans les deux lignées cellulaires humaines, A549 et HeLa. La surveillance des réactions parallèles ou PRM effectue un balayage complet des ions du produit après la sélection de l’ion précurseur, ce qui signifie que les ions du produit doivent être conservés après l’exécution. Le chromatogramme de K48 est montré avant et après la conservation.Les ions produits qui ont un signal avec un profil d’élution incohérent et de faible intensité ont été éliminés. La transition choisie pendant la conservation doit être cohérente entre les expériences, mais peut différer en fonction des conditions chromatographiques, des paramètres d’analyse et du contexte biologique de l’échantillon. Voici des chromatogrammes d’ions produits typiques pour chacune des topologies de chaîne d’ubiquitine identifiées dans cette expérience.Lors de la conception d’une expérience PRM, l’énergie de collision peut être optimisée pour améliorer le signal. Lorsque des énergies de collision de 14 à 28 ont été appliquées, il a été constaté qu’une énergie de collision plus élevée de 26 était optimale pour K63, tandis qu’une énergie plus faible de 18 était idéale pour M1. Des énergies de collision favorables ont été trouvées pour les peptides caractéristiques de la topologie dans cette expérience et une sélection de fragments d’ubiquitine non modifiés, mais ils devront peut-être être optimisés en fonction du spectromètre de masse et de la méthode de fragmentation utilisés. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que pour l’analyse de la chaîne ubiquitine, un équilibre des conditions doit être créé pour s’assurer que les liaisons de la chaîne ubiquitine sont maintenues tout en favorisant leur digestion en peptides.Cette méthode est essentielle pour la compréhension de la signalisation de l’ubiquitine car elle fournit une quantification précise de la topologie de la chaîne d’ubiquitine. Il pourrait être combiné avec un pull-down ou un fractionnement d’organites pour déterminer quelle topologie de la chaîne d’ubiquitine est associée à l’échantillon de protéine ciblé.

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