Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Comme les différentes topologies de chaînes d’ubiquitine ont un large éventail d’effets biologiques, la compréhension des changements dans leur abondance est pertinente pour une grande variété d’états biologiques. L’application de la surveillance des réactions parallèles à l’analyse de la chaîne d’ubiquitine permet d’identifier et de quantifier spécifiquement les topologies de la chaîne d’ubiquitine. Contrairement aux expériences PRM typiques, l’analyse de la topologie de la chaîne d’ubiquitine est limitée à des peptides modifiés spécifiques, dont beaucoup ne sont pas idéaux pour l’analyse MS.

La démonstration visuelle de cette technique met en évidence les ajustements et les résultats attendus observés pour ces peptides non idéaux. Commencez par préparer une solution de bicarbonate d’ammonium, une solution de n-éthylmaléimide et un tampon de stabilisation de l’ubiquitine comme décrit dans le manuscrit du texte. Remettre l’échantillon biologique en suspension dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine et lyser les cellules avec une méthode appropriée.

Après la lyse cellulaire, centrifugez l’échantillon à 18 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais à faible liaison protéique. Si nécessaire, conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius avant de continuer. Pour décongeler les échantillons, mélangez-les rapidement avec un ThermoMixer et n’utilisez pas de températures supérieures à 50 degrés Celsius.

Une fois décongelés, centrifugez les échantillons à 18 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférez 20 microgrammes dans un tube de microcentrifugation frais à faible liaison, puis ajustez le volume à 50 microlitres avec un tampon de stabilisation de l’ubiquitine. Préparez un témoin négatif avec un volume normalisé de tampon de stabilisation de l’ubiquitine et un témoin positif avec le tampon et les types de chaîne disponibles dans le commerce. Préparez une solution de 50 millimolaires de bicarbonate d’ammonium dans de l’eau et ajustez le pH à huit avec une molaire d’hydroxyde de sodium.

Granulez une culture d’E. coli par centrifugation à 5 000 fois G pendant cinq minutes. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et mettez-les en suspension dans un tampon de stabilisation de l’ubiquitine à cinq microgrammes par millilitre. Ajouter un microgramme de lysat d’E. coli à chaque échantillon et contrôler.

Préparez ensuite 500 millimolaires de PTCE dans de l’eau de qualité MS et ajoutez-le à chaque échantillon jusqu’à une concentration finale de 50 millimolaires. Vortex brièvement les échantillons et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, préparez une solution de chloroacétaldéhyde de 500 millimolaires et de bicarbonate d’ammonium et ajoutez-la aux échantillons et aux témoins jusqu’à une concentration finale de 55 millimolaires.

Vortex brièvement les échantillons et incubez-les dans l’obscurité pendant 20 minutes. Ajoutez l’endopeptidase Lys-C aux échantillons et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, diluez les échantillons avec 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires, ajoutez de la trypsine et incuberez-les pendant 12 heures supplémentaires.

Le lendemain, ajoutez une solution d’acide formique à 10 % à chaque échantillon et contrôlez selon un rapport volume-volume de 1:10. Vérifiez que le pH est inférieur à trois. Ajoutez ensuite 0,5 microlitre d’étalon peptidique lourd à chaque échantillon.

Après le nettoyage standard de l’échantillon de C18, procéder à l’analyse par spectrométrie de masse des échantillons à l’aide d’une méthodologie basée sur la PRM. Pour exporter la liste d’isolement, sélectionnez la liste d’isolement dans le menu d’exportation, sélectionnez le type d’instrument et définissez la méthode sur standard. Cliquez sur OK pour ouvrir une invite permettant d’enregistrer un fichier CSV pouvant être utilisé pour créer une méthode PRM.

Ensuite, importez l’exécution de planification en sélectionnant Fichier, Importer et Résultats. Choisissez plusieurs fichiers à importer simultanément et cliquez sur OK, puis sélectionnez les fichiers et attendez la fin de l’importation. Lorsque vous êtes prêt, passez en revue les identifications en cliquant sur la masse pour chaque entrée de peptide lourd.

La reconnaissance correcte du pic est souvent déterminée automatiquement, mais une sélection manuelle peut être nécessaire. Les temps de rétention sélectionnés pour les variantes lourdes sont également appliqués aux versions légères, créant ainsi un calendrier pour les PMR. Pour modifier la fenêtre de planification, sélectionnez le pic et cliquez sur Paramètres et Paramètres peptidiques.

Modifiez ensuite la fenêtre de temps dans l’onglet Prédiction. La liste d’inclusion de la planification peut ensuite être exportée à l’aide de Fichier, Exporter et Liste d’isolement. Choisissez le type d’instrument approprié, définissez le type de méthode sur Programmé, cliquez OK.To analyser les données, importer tous les échantillons et effectuer la curation, en supprimant les transitions avec interférence ou les mauvais rapports signal/bruit, puis exportez les données en cliquant avec le bouton droit de la souris sur les graphiques pertinents et en sélectionnant Copier les données ou en cliquant sur Fichier, Exporter et Rapport.

Le traitement avec l’inhibiteur du protéasome MG-132 empêche la dégradation des protéines conjuguées à l’ubiquitine, ce qui entraîne une augmentation de la chaîne K48 dans la lignée cellulaire B16 du mélanome de souris, ainsi que dans les deux lignées cellulaires humaines, A549 et HeLa. La surveillance des réactions parallèles ou PRM effectue un balayage complet des ions du produit après la sélection de l’ion précurseur, ce qui signifie que les ions du produit doivent être conservés après l’exécution. Le chromatogramme de K48 est montré avant et après la conservation.

Les ions produits qui ont un signal avec un profil d’élution incohérent et de faible intensité ont été éliminés. La transition choisie pendant la conservation doit être cohérente entre les expériences, mais peut différer en fonction des conditions chromatographiques, des paramètres d’analyse et du contexte biologique de l’échantillon. Voici des chromatogrammes d’ions produits typiques pour chacune des topologies de chaîne d’ubiquitine identifiées dans cette expérience.

Lors de la conception d’une expérience PRM, l’énergie de collision peut être optimisée pour améliorer le signal. Lorsque des énergies de collision de 14 à 28 ont été appliquées, il a été constaté qu’une énergie de collision plus élevée de 26 était optimale pour K63, tandis qu’une énergie plus faible de 18 était idéale pour M1. Des énergies de collision favorables ont été trouvées pour les peptides caractéristiques de la topologie dans cette expérience et une sélection de fragments d’ubiquitine non modifiés, mais ils devront peut-être être optimisés en fonction du spectromètre de masse et de la méthode de fragmentation utilisés. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que pour l’analyse de la chaîne ubiquitine, un équilibre des conditions doit être créé pour s’assurer que les liaisons de la chaîne ubiquitine sont maintenues tout en favorisant leur digestion en peptides.

Cette méthode est essentielle pour la compréhension de la signalisation de l’ubiquitine car elle fournit une quantification précise de la topologie de la chaîne d’ubiquitine. Il pourrait être combiné avec un pull-down ou un fractionnement d’organites pour déterminer quelle topologie de la chaîne d’ubiquitine est associée à l’échantillon de protéine ciblé.