Dosage immunobille multianalyte : une technique d’immunodosage basée sur le flux pour la détection simultanée de plusieurs sous-types d’anticorps dans un échantillon de sérum humain

Le dosage immunobille multianalyte utilise plusieurs microsphères enrobées d’antigène pour reconnaître simultanément leurs anticorps cibles correspondants.

Pour commencer ce test, prélevez un mélange de microbilles dans un tube contenant le tampon approprié. Chaque bille est recouverte d’un antigène spécifique sur sa surface, ce qui permet de différencier facilement les billes les unes des autres.

Pipetez le mélange d’immunobilles enrobées dans les puits d’une plaque de dosage de microtitration. Complétez les puits avec l’échantillon de sérum contenant différents isotypes d’anticorps cibles. Ces variants présentent des différences subtiles dans leurs structures, ce qui permet à chaque puits d’avoir plusieurs anticorps primaires.

Incuber, pour permettre aux isotypes d’anticorps de l’échantillon de se fixer à des antigènes spécifiques capturés sur des billes immunitaires respectives. Laver avec un tampon de dosage pour éliminer les anticorps primaires non liés. Ajoutez dans le puits des anticorps secondaires marqués d’un colorant fluorescent, correspondant à chaque variante de l’anticorps primaire.

Chaque anticorps secondaire marqué se lie au site Fc de l’anticorps primaire respectif. Plusieurs complexes antigène-anticorps primaires capturés par des billes sont marqués par fluorescence. Lavez la plaque pour éliminer les anticorps secondaires non liés.

Lire la plaque à l’aide d’un analyseur fluorescent capable de détecter simultanément différents fluorophores à leurs longueurs d’onde respectives. En fonction de la détection du signal, divers isotypes d’anticorps sériques et leur liaison à différents antigènes peuvent être évalués.

Pour des performances de dosage, remettre en suspension les microsphères couplées par vortex pendant 30 secondes et sonicate pendant 60 à 90 secondes. Ensuite, prélevez la quantité requise de chaque colloïde de billes du tube respectif et combinez les colloïdes de billes dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millimètre.

Ensuite, insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant, sans déranger la pastille de bille.

Après avoir retiré les billes du séparateur, remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon de dosage. Agitez pendant 30 secondes avant de placer le tube dans un séparateur magnétique pendant 60 secondes, pour séparer les billes. Répétez le lavage deux fois.

Ensuite, ajustez la concentration du mélange de microsphères de travail à trois plex en ajoutant un volume approprié de tampon de dosage pour générer une concentration finale de 100 microsphères par 1 μL, pour chaque cible.

Aliquote 25 microlitres du mélange de microsphères dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Diluez 500 fois les échantillons de plasma ou de sérum dans un tampon de dosage et préparez les échantillons standard en fonction du titrage souhaité.

Ajouter 25 microlitres de tampon d’essai comme échantillon vierge et ajouter chacun des échantillons dilués ou de l’étalon dans chaque puits désigné d’une plaque d’échantillon de 96 puits. Une fois terminé, couvrez la plaque d’un joint en aluminium ou d’une feuille d’aluminium pour incuber pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur de plaque réglé à 700 rotations par minute.

Préparer une solution d’anticorps de détection anti-humain, ou des solutions d’anticorps secondaires, à 4 μg/mL avec un tampon de dosage, comme décrit dans le manuscrit. Placez la plaque sur un séparateur magnétique pour la laver rapidement, puis retournez avec force la plaque sur un récipient à risque biologique pour éliminer le liquide des puits. Avec la plaque toujours inversée, tapotez avec force la plaque contre une épaisse liasse de papier.

Ensuite, lavez chaque puits avec 100 microlitres de tampon de dosage et retirez le liquide par inversion forcée sur un récipient à risque biologique. Répétez le lavage deux fois. Après le dernier lavage, jetez toutes les liasses de papier utilisées dans un contenant à risque biologique.

Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de travail d’anticorps secondaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits et couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour l’incuber sur un agitateur de plaque à 700 rotations par minute.

Après 30 minutes d’incubation, laver deux fois les puits de la plaque avec un tampon de dosage, comme démontré précédemment. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de dosage dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Couvrir l’assiette de papier d’aluminium et incuber pendant cinq minutes sur un agitateur à température ambiante.

Analysez un échantillon de 60 microlitres via l’analyseur de l’instrument conformément au manuel du système.