Un immunodosage multiplex basé sur des billes pour quantifier plusieurs cibles de cytokines

Prenez une plaque multipuits avec des filtres à la base.

Ajoutez un échantillon de test contenant différentes cytokines.

Ajoutez différents ensembles de microsphères différenciées par leur taille et leur intensité de fluorescence interne.

Chaque ensemble est conjugué à un anticorps ciblant une cytokine spécifique.

Incuber la plaque dans l’obscurité sous agitation.

Les anticorps se lient à leurs cytokines cibles, les immobilisant sur les microsphères.

Appliquez un aspirateur pour éliminer les cytokines non liées. Les cytokines liées aux microsphères sont conservées en raison de la plus petite taille des pores de la membrane.

Ajoutez un cocktail d’anticorps de détection conjugués à la biotine qui se lient aux cytokines liées à la microsphère.

Ajoutez une streptavidine fluorescente conjuguée au rapporteur et incubez dans l’obscurité sous agitation. La streptavidine se lie à la biotine, immobilisant le rapporteur sur le complexe de la microsphère.

Retirez les molécules non liées et remettez les microsphères en suspension.

À l’aide de la cytométrie en flux, identifiez les cytokines liées en déterminant la taille et la fluorescence interne des microsphères.

Pour déterminer la quantité d’une cytokine spécifique, mesurez l’intensité de fluorescence du rapporteur.

Pour effectuer le test, laissez tous les réactifs se réchauffer à température ambiante avant de les utiliser.

Des plaques filtrantes en polypropylène sont utilisées dans cette démonstration. Il est absolument essentiel que la plaque soit maintenue verticale pendant toute la procédure de dosage, y compris les étapes de lavage, pour éviter de perdre les billes.

Pré-mouillez le papier filtre en ajoutant 100 microlitres de 1x tampon de lavage dans chaque puits, et laissez reposer la plaque pendant 1 minute à température ambiante. Retirez le volume de tampon à l’aide du collecteur à vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette en appuyant l’assiette sur une pile d’essuie-tout propres. Placez ensuite la plaque sur le couvercle de la plaque inversée.

Pour les échantillons de surnageant de culture cellulaire, ajoutez 25 microlitres de tampon de dosage dans tous les puits. Ajoutez 25 microlitres de chaque étalon dans les puits étalons. Enfin, ajoutez 25 microlitres de chaque échantillon dans les puits d’échantillon. Agitez les billes mélangées pendant 30 secondes. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de billes mélangées dans chaque puits, en secouant la bouteille de perles par intermittence pour éviter que les billes ne se déposent.

Scellez la plaque avec une scelleuse de plaques. Une fois scellée, enveloppez toute la plaque, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium. Placez la plaque sur un agitateur à assiettes, fixez-la et secouez-la à environ 500 tr/min pendant deux heures à température ambiante. Sans renverser, placez la plaque sur le collecteur d’aspirateur et appliquez le vide comme précédemment. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 1x tampon de lavage dans chaque puits.

Retirez le contenu des puits de la plaque de dosage par filtration sous vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette avec un tampon absorbant ou des serviettes en papier avant de répéter cette étape une fois de plus. Ensuite, ajoutez 25 microlitres d’anticorps de détection dans chaque puits. Après avoir scellé la plaque avec une scelleuse de plaque neuve, enveloppez toute la plaque, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium.

Placez la plaque sur un agitateur de plaque et secouez à environ 500 tr/min pendant 1 heure à température ambiante. Sans aspirer, ajoutez 25 microlitres de réactif de phycoérythrine streptavidine directement dans chaque puits. Fermez et enveloppez l’assiette comme précédemment. Alors. Placez l’assiette sur un agitateur à assiette et agitez à environ 500 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante.

Après avoir répété deux fois l’étape de filtration sous vide, ajoutez 200 microlitres de 1x tampon de lavage dans chaque puits. Remettez les perles en suspension sur un agitateur pendant 1 minute. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez les échantillons de la plaque filtrante dans des tubes FACS afin de lire les échantillons sur un cytomètre en flux.