Microscopie à réflexion interférentielle pour une visualisation sans marquage de la dynamique des microtubules

La microscopie à réflexion interférentielle permet d’imager des microtubules qui grandissent et rétrécissent de manière dynamique.

Fixez les bandes de paraffine sur une lamelle et placez une lamelle légèrement plus petite sur le dessus. Chauffer pour faire fondre la paraffine en formant un canal scellé. Pipetez une solution contenant des anticorps à travers le canal. Les anticorps se fixent à la surface de la lamelle. Ajoutez une solution bloquante, bloquant les régions non liées aux anticorps et empêchant la liaison aux protéines non spécifiques.

Placez la lamelle sur la platine du microscope. Réglez le réchauffeur d’échantillon à une température facilitant la croissance des microtubules.

Pipette de graines de microtubules stabilisées avec un analogue non hydrolysable de guanosine triphosphate, GTP. Les graines se lient à la lamelle enrobée d’anticorps. Ajoutez un tampon contenant de la tubuline non étiquetée, du GTP et des agents réducteurs.

À une température et dans des conditions tampons optimales, les graines agissent comme des sites de nucléation, permettant la liaison de la tubuline non marquée et la croissance des microtubules.

Commencez l’imagerie. La lumière incidente se concentre à travers un diaphragme d’ouverture sur un séparateur de faisceau qui réfléchit partiellement la lumière vers l’objectif, éclairant ainsi l’échantillon. L’interface verre-tampon de la lamelle réfléchit partiellement la lumière incidente. La lumière incidente restante passe à travers et est réfléchie aux interfaces tampon-microtubules.

Sur la base de la distance microtubule-lamelle, les faisceaux réfléchis par les deux interfaces interfèrent, produisant des interférences constructives - les faisceaux se combinant pour produire un signal brillant, ou interférences destructrices - les faisceaux s’annulant pour produire un signal sombre.

Visualisez les microtubules sous forme d’images à contraste élevé. Capturez des images en accéléré, en détectant la croissance et le rétrécissement des microtubules.

Pour commencer, insérez un miroir 50/50 dans la roue à filtres d’un microscope fluorescent à l’aide d’un cube de filtre approprié. Manipulez le miroir avec précaution car il est souvent doté d’un revêtement antireflet. Tournez-vous vers un objectif à fort grossissement qui a également une grande ouverture numérique. Celui montré ici est un objectif à huile 100x avec une ouverture numérique de 1,3.

Ensuite, utilisez une lame de rasoir et une lame de microscope comme règle droite pour couper des bandes de 3 millimètres de large de film de paraffine plastique. Placez deux des bandes de film de paraffine en plastique à 3 millimètres l’une de l’autre sur une lamelle propre de 22 x 22 millimètres. Ensuite, placez une lamelle de 18 x 18 millimètres sur les bandes pour former un canal.

Transférez la lamelle dans un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant 10 à 30 secondes pour que le film de paraffine forme un canal scellé. À l’aide d’une pipette, injectez 50 microgrammes par millilitre d’un anticorps anti-rhodamine par perfusion, et incubez la lame pendant 10 minutes.

Après l’incubation, laver le canal cinq fois avec du BRB80 filtré. Ensuite, versez 1 % de poloxamère 407 dans le BRB80 filtré pour bloquer la surface contre la liaison non spécifique, et incubez la lame pendant 10 minutes. Encore une fois, lavez le canal cinq fois avec du BRB80 filtré.

Pour éviter que l’échantillon ne se dessèche, ajoutez deux gouttelettes du BRB80 filtré aux extrémités du canal et ajoutez plus de tampon si nécessaire. Placez l’échantillon sur la platine du microscope et allumez la source lumineuse d’épi-illumination. Concentrez-vous sur le bord du film de paraffine pour trouver la surface de l’échantillon, puis déplacez le champ pour définir la vue au centre de la chambre. Vous observerez plusieurs surfaces lorsque l’objectif est déplacé vers le haut et vers le bas en raison de la réflexion arrière de la lumière provenant de l’optique à l’intérieur du chemin optique.

Ensuite, centrez le diaphragme de champ dans le champ de vision en le fermant à mi-chemin et à l’aide des vis de réglage Une fois le diaphragme correctement aligné, rouvrez-le. Ensuite, glissez l’objectif Bertrand pour voir le plan focal arrière, également connu sous le nom de pupille de sortie de l’objectif.

Fermez le diaphragme d’ouverture au-delà des bords de la pupille de sortie et utilisez les vis de réglage pour centrer le diaphragme d’ouverture par rapport à la pupille de sortie. Vérifiez deux fois en ouvrant le diaphragme d’ouverture et en faisant correspondre ses bords avec ceux de la pupille de sortie. Ensuite, réglez le diaphragme d’ouverture sur environ 2/3 de l’ouverture numérique de l’objectif.

Pour imager la dynamique des microtubules à l’aide de la tubuline cérébrale, commencez par régler la température du chauffage de l’échantillon à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, versez 10 microlitres de graines de microtubules stabilisées au GMPCPP et surveillez leur liaison à la surface en imageant la surface en direct. Une fois que 10 à 20 graines sont liées dans le champ de vision, laver l’échantillon en utilisant deux fois le volume de canal du BRB80 préchauffé et filtré.

Ensuite, versez 10 microlitres du mélange de polymérisation.

Pour mesurer la croissance des microtubules, mettez en place un time-lapse à l’aide du logiciel d’acquisition pour acquérir une image toutes les 5 secondes pendant 15 minutes. Améliorez le contraste en acquérant une image moyenne de 10 à chaque point temporel. Acquérez des images d’arrière-plan comme indiqué dans la section précédente. Calculez la médiane en accédant à Image, en sélectionnant Empiler, puis Z Projet, puis Médiane. Soustrayez l’arrière-plan correspondant en accédant à Traiter, en allant à la Calculatrice d’images et en choisissant Soustraire dans le menu déroulant. Assurez-vous que l’option de résultat 32 bits à virgule flottante est cochée.

Pour le rétrécissement des microtubules, obtenez des images à 100 images par seconde en réglant le délai sur zéro et en maintenant le temps d’exposition à 10 millisecondes.