Name: Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez la visualisation simultanée de l'actine et des microtubules par microscopie TIRF in vitro. Cette méthode permet d'évaluer les protéines régulatrices et leurs propriétés émergentes dans la dynamique cytosquelettique.

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Je suis reconnaissant à Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) et Brian Haarer (SUNY Upstate) pour leurs commentaires utiles sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (GM133485).

Il n’y a pas de conflits d’intérêts à divulguer.

L’utilisation de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser des protéines purifiées a été une approche fructueuse et convaincante pour disséquer des mécanismes uniques de régulation du cytosquelette 5,23,24,25,26,27,35. Par rapport aux essais biochimiques traditionnels, les réactions TIRF nécessitent de très petits volumes (50-100 μL), et des mesures quantitatives de la dynamique du cytosquelette peuvent être glanées à partir d’un essai individuel. La plupart des études sur la dynamique du cytosquelette se concentrent sur un seul système polymère (c’est-à-dire les filaments d’actine ou les microtubules), de sorte que les mesures détaillées de la diaphonie ou des comportements émergents entre les filaments d’actine et les microtubules généralement observés dans les cellules sont restées insaisissables et difficiles à récapituler dans le tube à essai. Pour résoudre ce problème, ce protocole décrit un système de microscopie TIRF à filament unique qui permet la visualisation directe d’actine dynamique et de polymères de microtubules dans la même réaction biochimique. Ainsi, cette méthode va au-delà des essais traditionnels qui récapitulent le comportement dynamique des filaments d’actine ou des microtubules seuls. Cette technique a également été réalisée avec Tau comme exemple de la façon dont plusieurs propriétés dynamiques changent en présence d’un facteur de couplage du cytosquelette. Ce protocole peut être utilisé avec des protéines supplémentaires connues ou soupçonnées de coordonner la dynamique de l’actine ou des microtubules, y compris (mais sans s’y limiter) MACF, GAS, formines, etc. Enfin, les exemples d’analyses fournis peuvent être utilisés comme guide pour quantifier les données acquises avec ce protocole.
« Voir, c’est croire » est une raison impérieuse d’effectuer des tests basés sur la microscopie. Toutefois, la prudence est de mise dans l’exécution et l’interprétation des expériences de microscopie de la FRBR. L’un des principaux défis des tests de co-assemblage du cytosquelette est que de nombreuses conditions d’imagerie couramment utilisées ne sont pas compatibles avec chaque polymère. Les microtubules et l’actine ont généralement des exigences différentes en matière de tampon, de température, de sel, de nucléotide et de concentration pour la polymérisation. L’actine, la tubuline, les protéines régulatrices d’intérêt et les tampons utilisés dans ce protocole sont sensibles aux cycles de gel-dégel. Par conséquent, une manipulation prudente des protéines et des tampons est nécessaire pour exécuter avec succès ce protocole. Pour atténuer bon nombre de ces préoccupations, il est fortement recommandé d’utiliser de la tubuline fraîchement recyclée (congelée pendant <6 semaines) et de pré-éliminer les actines congelées/remises en suspension par ultracentrifugation. Ces considérations s’appliquent également à la myriade de protéines régulatrices à évaluer avec cette procédure, qui peuvent être sensibles aux cycles de gel-dégel ou à la concentration de sels tampons 5,11,36.
Malheureusement, il n’existe pas de tampon unique sans compromis expérimentaux. Pour s’approprier plus de volume pour les protéines de concentration plus faible, l’ATP et le GTP peuvent être inclus dans la solution tampon 2x TIRF (figure 1C). Cependant, comme ces nucléotides sont extrêmement sensibles aux cycles de gel-dégel, il n’est pas recommandé. Les composés piégeurs d’oxygène utilisés ici (c.-à-d. la catalase et la glucose-oxydase) sont nécessaires pour visualiser les protéines pendant de longues périodes de temps (de quelques minutes à quelques heures), mais sont connus pour restreindre la polymérisation des microtubules à des concentrations élevées5. En ce qui concerne ces considérations de tampon, une limitation de ce protocole est que certaines protéines régulatrices canoniques associées aux microtubules peuvent nécessiter plus ou moins de sel pour récapituler les fonctions trouvées dans les cellules ou les essais utilisant des microtubules seuls (sans actine). La modification de la nature ou de la concentration du sel pour répondre à ces préoccupations influencera probablement les taux de polymérisation des filaments d’actine et/ou les paramètres de la dynamique des microtubules. Des mesures de plusieurs paramètres descriptifs (minimal, nucléation, taux d’allongement et stabilité) (figure 3) sont nécessaires pour confirmer le succès du protocole ou pour documenter explicitement les effets de tampons ou de protéines régulatrices spécifiques. Par exemple, une trop grande polymérisation de filaments d’actine peut masquer les événements de couplage actine-microtubule en quelques secondes. Par conséquent, le réglage fin des conditions expérimentales en abaissant la concentration globale d’actine ou en incluant des protéines supplémentaires pour supprimer la nucléation de l’actine (c.-à-d. la profiline) prolongera la période globale pendant laquelle les activités coordonnées actine-microtubule peuvent être vues clairement. Les contrôles répondant à ces conditions préalables et les réplications techniques (au-delà de plusieurs champs de vision) sont essentiels pour que les utilisateurs génèrent des résultats fiables et reproductibles.
Les études cellulaires offrent une possibilité limitée d’observer les relations directes protéine-protéine ou l’action des complexes régulateurs. En revanche, certains des mécanismes glanés dans les essais in vitro ne reflètent pas toujours les comportements exacts des protéines observées dans les cellules. Ce dilemme biochimiste classique peut être abordé dans les applications futures de cette technique avec des modifications spécifiques. Par exemple, l’ajout de protéines de couplage fonctionnelles marquées par fluorescence élargit cette méthode des études à filament unique aux études à molécule unique. Les essais peuvent être modifiés pour utiliser des extraits cellulaires qui peuvent ajouter les facteurs clés inconnus « manquants » nécessaires pour récapituler les phénomènes cellulaires. Par exemple, les essais à base de TIRF utilisant des extraits de levure ou de Xenopus ont reconstitué les anneaux d’actomyosine contractile37, les fuseaux mitotiques26,38, les composants de l’assemblage d’actine ou de microtubule39,40, et même la dynamique au niveau du centrosome et des kinétochores 36,41,42,43 . De plus, de tels systèmes peuvent ouvrir la voie à des systèmes cellulaires artificiels qui ont des lipides ou des facteurs de signalisation présents 44,45,46.

Historiquement, l’actine et les microtubules ont été considérés comme des entités distinctes, chacune avec son propre ensemble de protéines régulatrices, de comportements dynamiques et d’emplacements cellulaires distincts. De nombreuses preuves démontrent maintenant que les polymères d’actine et de microtubules s’engagent dans des mécanismes de diaphonie fonctionnels qui sont essentiels à l’exécution de nombreux processus cellulaires, notamment la migration, le positionnement du fuseau mitotique, le transport intracellulaire et la morphologie cellulaire 1,2,3,4. Les divers comportements coordonnés qui sous-tendent ces exemples dépendent d’un équilibre complexe de facteurs de couplage, de signaux et de propriétés physiques. Cependant, les détails moléculaires qui sous-tendent ces mécanismes sont encore largement inconnus car la plupart des études se concentrent sur un seul polymère cytosquelettique à la fois 1,2,5.
L’actine et les microtubules n’interagissent pas directement 6,7,8. La dynamique coordonnée de l’actine et des microtubules observée dans les cellules est médiée par d’autres facteurs. De nombreuses protéines censées réguler la diaphonie actine-microtubule ont été identifiées et leurs activités sont bien caractérisées en ce qui concerne l’un ou l’autre polymère cytosquelettique seul 1,2. De plus en plus de preuves suggèrent que cette approche à polymère unique a dissimulé les doubles fonctions de certaines des protéines / complexes qui permettent les événements de couplage actine-microtubule 7,8,9,10,11,12,13. Les expériences où les deux polymères sont présents sont rares et définissent souvent des mécanismes avec un seul polymère dynamique et une version stabilisée statique de l’autre 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Ainsi, des méthodes sont nécessaires pour étudier les propriétés émergentes des protéines de coordination actine-microtubule qui ne peuvent être pleinement comprises que dans les systèmes expérimentaux qui utilisent les deux polymères dynamiques.
La combinaison d’approches de marquage direct des protéines, de marqueurs d’affinité génétiquement codés et de microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) a été appliquée avec beaucoup de succès dans les systèmes de reconstitution biomimétique 19,20,21,22,23. De nombreux schémas ascendants ne contiennent pas tous les facteurs qui régulent les protéines dans les cellules. Cependant, la technologie de la « biochimie sur un verre de couverture » a affiné de nombreux mécanismes de la dynamique de l’actine et des microtubules à des échelles spatiales et temporelles élevées, y compris les composants nécessaires à l’assemblage ou au démontage des polymères et au mouvement des protéines motrices 5,12,23,24,25,26,27 . Ici, une approche monofila filamenteuse à composant minimal pour étudier le couplage actine-microtubule in vitro est décrite. Ce protocole peut être utilisé avec des protéines purifiées disponibles dans le commerce ou très pures, des protéines marquées par fluorescence, des chambres de perfusion, et étendu à des schémas plus complexes contenant des extraits de cellules ou des systèmes synthétiques. Ici, la protéine Tau disponible dans le commerce est utilisée pour démontrer comment la dynamique du cytosquelette change en présence d’une protéine de couplage actine-microtubule, mais peut être substituée à d’autres facteurs de coordination actine-microtubule putatifs. L’avantage majeur de ce système par rapport à d’autres approches est la possibilité de surveiller simultanément la dynamique de plusieurs polymères cytosquelettiques en une seule réaction. Ce protocole fournit également aux utilisateurs des exemples et des outils simples pour quantifier les changements dans les polymères cytosquelettiques. Ainsi, les utilisateurs du protocole produiront des données fiables, quantitatives et de résolution d’un seul filament pour décrire les mécanismes qui sous-tendent la façon dont diverses protéines régulatrices coordonnent la dynamique actine-microtubule.

<table><tbody><tr><td>1 % BSA (w/v)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Pour ce faire (blocage des chambres TIRF), le BSA est remis en suspension dans ddH20 et filtré à travers un 0,22 &micro ; Filtre M.</td></tr><tr><td>1& fois ; BRB80</td><td>TUYAUX 80 mM faits maison</td><td></td><td>, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 avec KOH</td></tr><tr><td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxydase</td><td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td><td>G2133-50KU</td><td>Combiné avec la catalase, l’aliquote et stocker à -80 oC jusqu’à utilisation</td></tr><tr><td>100 &micro ; M tubulin</td><td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td><td>T240</td><td>Les tubulines faites maison doivent être recyclées avant utilisation pour éliminer la tubuline incompétente en matière de polymérisation (Hyman et al. (1992)29 ; Li et Moore (2020)30). Les tubulines disponibles dans le commerce sont souvent trop diluées pour être recyclées, mais fonctionnent bien si elles sont remises en suspension selon le fabricant. s et pré-approuvé par ultracentrifugation (278 000 & fois ; g) pendant 60 min, avant utilisation.</td></tr><tr><td>100 mM ATP</td><td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td><td>A-081</td><td>remis en suspension dans ddH20 (pH 7,5) et stérilisé par filtre.</td></tr><tr><td>100 mM GTP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC226250010</td><td>remis en suspension en 1&fois ; BRB80 (pH 6,8) et stérilisé par filtre.</td></tr><tr><td>Lasers à semi-conducteurs 120-150 mW</td><td>Leica Microsystems</td><td>11889151 ; 11889148</td><td></td></tr><tr><td>2 mg/mL catalase</td><td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td><td>C40-100</td><td>Combiné avec la glucose oxydase, aliquote et stocker à -80 oC jusqu’à utilisation</td></tr><tr><td>2& fois ; Tampon TIRF</td><td>Fait maison</td><td></td><td>2& fois ; BRB80, 100 mM de KCl, 20 mM de DTT, 80 mM de glucose, 0,5 % (v/v) de méthylcellulose (4 000 cp) ; Remarque : 1 & micro ; L de 0,1 M GTP et 1 & micro ; L d’ATP 0,1 M ajouté séparément aux réactions TIRF pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.</td></tr><tr><td>24 &times ; 60 mm, #1.5 coverglass</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>22-266882</td><td>Le coverglass doit être lavé abondamment avant utilisation (Smith et al. (2014)22)</td></tr><tr><td>37 oC heatblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 oC bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mg/mL de streptavidine (stock 600x)</td><td>Avantor, Philadelphie, PA</td><td>RLS000-01</td><td>Remise en suspension dans Tris-HCl (pH 8,8) ; diluer l’aliquote à 1& fois ; dans un tampon HEK le jour d’utilisation</td></tr><tr><td>5 min Résine époxy et durcisseur</td><td>Loctite, Rocky Hill, CT</td><td>1365736</td><td>La résine et le durcisseur combinés peuvent prendre jusqu’à 30 min pour durcir.</td></tr><tr><td>50 % de graines de microtubules biotinylées-GpCpp</td><td>Cytoskeleton Inc ; Les graines de</td> microtubules stabilisées <td>T333P</td> <td>(facultatif) GppCpp ou Taxol faites maison peuvent faciliter plus efficacement la polymérisation des microtubules. Le Taxol et le GppCpp stabilisent les microtubules de différentes manières, ce qui peut affecter la structure du réseau des microtubules et la capacité de certaines protéines régulatrices à se lier à la partie stabilisée du microtubule. Hyman et al. (1992) décrivent une méthode pour fabriquer divers types de graines de microtubules.</td></tr><tr><td>70 oC incubateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin mix stock</td><td>Fait maison ; ce protocole</td><td></td><td>A 12.5 &micro ; Mélange d’actine M composé d’actine marquée (fluorescente et biotinylée) et non marquée pour un maximum de six réactions. 2 et micro ; L de stock est utilisé dans la réaction finale du TIRF. La concentration finale d’actine utilisée dans chaque réaction est de 0,5 & micro ; M (10 % Alexa-647 ; 0,09 % marqué à la biotine).</td></tr><tr><td>Contrôles de tampons appropriés</td><td>Maison</td><td></td><td>Combinaison de tampons de toutes les protéines évaluées</td></tr><tr><td>Biotine-PEG-silane (MW 3 400)</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>biotin-PEG-SIL-3400</td><td>Distribué en aliquotes de 2 à 5 mg, remblayé d’azote, parafilmé fermé et stocké à -20 oC avec dessiccant jusqu’à utilisation</td></tr><tr>Cytosquelette<td>d’actine biotinylé</td><td>Inc ; La</td> biotine-actine <td>AB07</td> faite maison <td>est fabriquée par étiquetage sur des résidus de lysine et est donc supposée être étiquetée à au moins 100 %, mais varie selon les différents lots/préparations. Les concentrations optimales d’actine biotinylée doivent être déterminées empiriquement pour des utilisations ou des plans d’expérience particuliers. Des concentrations plus élevées permettent un suivi plus efficace, mais peuvent entraver la polymérisation ou les interactions avec les protéines régulatrices. Ici, un petit pourcentage (0,09 % ou 900 pM) d’actine biotinylée est présent dans la réaction finale de TIRF.</td></tr><tr><td>Savon à vaisselle</td><td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td><td></td><td>Pour des raisons inconnues, la version bleue nettoie les lamelles plus efficacement que les autres couleurs disponibles.</td></tr><tr><td>Logiciel de glace</td><td></td><td></td><td></td>carbonique</tr><tr><td>FIJI</td><td>www.https ://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td><td>Schneider et al. (2012)31.</td></tr><tr>Cytosquelette <td>d’actine marqué par fluorescence</td><td>Inc ; </td><td>AR05</td><td>L’actine faite maison marquée par fluorescence est stockée dans un tampon G complété par 50 % de glycérol à -20 oC (Spudich et al. (1971)47 ; Liu et coll. (2022)48). L’actine marquée par fluorescence est dialysée contre le tampon G et pré-éliminée par ultracentrifugation pendant 60 min à 278 000 & fois ; g avant utilisation.</td></tr><tr><td>Cytosquelette</td> de <td>tubuline marqué par fluorescence</td> Inc <td>TL488M, TLA590M, TL670M</td><td>remis en suspension en 20 & micro ; L 1& fois ; BRB80 (10 et micro ; M concentration finale) et pré-nettoyé par ultracentrifugation (278 000 & fois ; g) pendant 60 min, avant utilisation.</td></tr><tr><td>G-buffer</td><td>fait maison</td><td></td><td>3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP</td></tr><tr><td>HEK Buffer</td><td>Maison</td><td></td><td>20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl</td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambres d’imagerie</td><td>IBIDI, Fitchburg, WI</td><td>80666</td><td>Commandez des chambres sans fond pour utiliser différents revêtements de lamelles</td></tr><tr><td>iXon Life 897 Caméra EMCCD</td><td>Andor, Belfast, Irlande du Nord</td><td>8114137</td><td></td></tr><tr><td>LASX Logiciel de microscope Premium</td><td>Leica Microsystems</td><td>11640611</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose (4 000 cp)</td><td>Sigma Aldrich Inc</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Base de microscope équipée du module TIRF</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne</td><td></td><td></td>11889146</tr><tr><td>mPEG-silane (MW 2 000)</td><td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td><td>mPEG-SIL-2000</td><td>Distribué en aliquotes de 10 à 15 mg, remblayé d’azote, parafilmé fermé et stocké à -20 oC avec dessiccant jusqu’à utilisation</td></tr><tr><td>Chauffage d’objectif et insert de scène chauffé</td><td>OKO labs, Pozzioli, Italie</td><td>8113569</td><td>Réglez les commandes de température sur 35-37 oC. Utilisez les suggestions du fabricant pour un étalonnage précis.</td></tr><tr><td>Pompe à perfusion</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>704504</td><td>Une seringue et un tube peuvent être remplacés.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 100 x 15 mm</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur d’expédition de lames en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>SA-S-1L-SecureSeal 0,12 mm d’épaisseur</td><td>Grace Biolabs, Bend, OR</td><td>620001</td><td>Il est fortement recommandé d’utiliser du ruban adhésif double face de dimensions fabriquées précises.</td></tr><tr><td>Petit récipient en polystyrène</td><td>Abcam, Cambridge, Royaume-Uni</td><td></td><td>Réutilisé du transport maritime</td></tr><tr><td>Petit bateau de pesée</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tau</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>TA01</td><td>Trois isoformes de Tau sont présentes dans la préparation de Tau disponible dans le commerce. La concentration dans ce protocole a été déterminée à partir de la bande de masse moléculaire la plus élevée (14,3 & micro ; M, lorsqu’il est remis en suspension par constructeur » s recommandations avec 50 & micro ; L de ddH20).</td></tr><tr><td>Température corrigée 63& fois ; Plan Apo 1.47 N.A. immersion dans l’huile TIRF objectif</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506319</td><td></td></tr><tr><td>stock de tubuline</td><td>Fait maison ; ce protocole</td><td></td><td>Un stock de tubuline composé de 7.2 &micro ; L recyclé 100 & micro ; M non étiqueté tubuline et 3 & micro ; L de 10 & micro ; M tubuline en suspension disponible dans le commerce et marquée par fluorescence. Un stock de tubuline est utilisé par réaction et décongelé/stocké sur de la glace. La concentration finale de tubuline libre dans chaque réaction est de 15 & micro ; M (4 % étiquetés). Plus de 15 & micro ; La tubuline M entraînera une hyperstabilisation des microtubules, tandis que les concentrations inférieures à 7,5 et micro ; La tubuline libre M ne polymérise pas bien. Il est nécessaire de déterminer avec soin la concentration et la manipulation des protéines.</td></tr><tr><td>Actine non étiquetée (foncé)</td><td>Cytoskeleton Inc ; Les</td> nucléates d’actine <td>AKL99</td> faits maison <td>sont presque toujours présents dans les actines disponibles dans le commerce (lyophilisées) ou congelées et contribuent à la variabilité des mesures quantitatives (Spudich et coll. (1971)47 ; Liu et coll. (2022)48). L’actine musculaire du lapin est stockée dans le tampon G à -80 oC et pré-éliminée par ultracentrifugation pendant 60 min à 278 000 & fois ; g avant utilisation.&nbsp ; Plusieurs solutions de stock d’actine sont préparées tout au long de la journée (ce qui ne fait pas plus que suffisant pour six réactions à la fois). est fortement recommandé).</td></tr></tbody></table>

visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (tirf)

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionnellement, les cytosquelettes d’actine et de microtubules ont été étudiés en tant qu’entités distinctes, limitées à des régions ou des processus cellulaires spécifiques et régulées par différentes suites de protéines de liaison uniques pour chaque polymère. De nombreuses études démontrent maintenant que la dynamique des deux polymères cytosquelettiques est entrelacée et que cette diaphonie est nécessaire pour la plupart des comportements cellulaires. Un certain nombre de protéines impliquées dans les interactions actine-microtubule ont déjà été identifiées (c.-à-d. Tau, MACF, GAS, formines, etc.) et sont bien caractérisées en ce qui concerne l’actine ou les microtubules seuls. Cependant, relativement peu d’études ont montré des tests de coordination actine-microtubule avec des versions dynamiques des deux polymères. Cela peut entraîner des mécanismes de liaison émergents entre l’actine et les microtubules. Ici, une technique de reconstitution in vitro basée sur la microscopie par fluorescence interne totale (TIRF) permet de visualiser à la fois la dynamique de l’actine et des microtubules à partir d’une seule réaction biochimique. Cette technique préserve la dynamique de polymérisation du filament d’actine ou des microtubules individuellement ou en présence de l’autre polymère. La protéine Tau disponible dans le commerce est utilisée pour démontrer comment les comportements actine-microtubule changent en présence d’une protéine de réticulation cytosquelettique classique. Cette méthode peut fournir des informations fonctionnelles et mécanistes fiables sur la façon dont les protéines régulatrices individuelles coordonnent la dynamique actine-microtubule à une résolution de filaments uniques ou de complexes d’ordre supérieur.

Dans les conditions décrites ci-dessus (Figure 1), les polymères d’actine et de microtubules doivent être visibles (et dynamiques) dans les 2 minutes suivant l’acquisition de l’image (Figure 2). Comme pour tout protocole basé sur la biochimie, une optimisation peut être nécessaire pour différentes protéines régulatrices ou lots de protéines. Pour ces raisons, l’angle TIRF et les expositions d’image sont définis en premier avec des réactions contenant chaque polymère individuel. Cela confirme que les protéines stockées sont fonctionnelles et qu’une quantité suffisante de protéines marquées est présente pour la détection. Bien qu’il ne soit pas toujours nécessaire (et non effectué ici), le post-traitement des films (c’est-à-dire la soustraction d’arrière-plan, la moyenne ou les transformations de Fourier) peut être utilisé pour améliorer le contraste de l’image (en particulier des microtubules)5,25,33. La visualisation directe des filaments d’actine simples et des microtubules offerte par ce test permet de déterminer quantitativement plusieurs mesures dynamiques pour l’un ou l’autre composant du cytosquelette seul ou ensemble, y compris les paramètres de polymérisation (c.-à-d. la vitesse de nucléation ou d’allongement), les paramètres de désassemblage (c.-à-d. les taux de retrait ou les catastrophes) et le coalignage/chevauchement des polymères (figure 3). ). De plus, ces mesures peuvent servir de point de départ pour déchiffrer la liaison ou l’influence de ligands régulateurs comme Tau (Figure 3). De nombreuses mesures de filaments d’actine simples ou de microtubules peuvent être effectuées à partir d’un seul film TIRF. Cependant, en raison des variations dans le revêtement de couverture, le pipetage et d’autres facteurs, des mesures fiables devraient également inclure de multiples réactions / films de réplication technique.
De nombreuses facettes de la dynamique des microtubules peuvent être déterminées à partir d’exemples de kymographes, y compris le taux d’allongement des microtubules, ainsi que la fréquence des catastrophes et des événements de sauvetage (Figure 3A). L’utilisation de kymographes pour mesurer la dynamique de l’actine dans ce système n’est pas aussi simple car les filaments d’actine sont plus alambiqués que les microtubules. En conséquence, les paramètres de la dynamique des filaments d’actine sont mesurés à la main, ce qui prend du temps et demande beaucoup de travail. Les numérations sont mesurées comme le nombre de filaments d’actine présents à un point temporel cohérent pour toutes les conditions. Ces comptes varient considérablement d’un domaine d’imagerie TIRF à l’autre, mais peuvent être utilisés avec de nombreux réplicats ou pour compléter les observations d’autres essais de polymérisation. Les numérations de nucléation peuvent également être utilisées pour les microtubules si les conditions d’essai manquent de graines de microtubules stabilisées. Les taux d’allongement du filament d’actine sont mesurés comme la longueur du filament au fil du temps à partir d’au moins quatre images de film. Les valeurs de vitesse sont transmises par actine micromolaire avec un facteur de correction de 370 sous-unités pour tenir compte du nombre de monomères d’actine dans un micron de filament (Figure 3B)32. Les mesures permettant de définir les comportements coordonnés entre l’actine et les microtubules sont moins bien définies. Cependant, des analyses corrélatives ont été appliquées pour mesurer la coïncidence des deux polymères, y compris les balayages linéaires (Figure 3C) ou les logiciels de chevauchement 5,11,34.
Disponibilité des données : Tous les ensembles de données associés à ce travail ont été déposés dans Zenodo et sont disponibles sur demande raisonnable à l’adresse suivante: 10.5281 / zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Graphique 1. Schémas expérimentaux : assemblage de la chambre d’écoulement à l’acquisition d’images. (A) Assemblage de la chambre d’imagerie. De haut en bas : les chambres d’imagerie IBIDI sont scotchées le long des puits de perfusion (désignés par une flèche) ; la deuxième couche (blanche) de support de bande (laissée sur l’image montrée pour mieux orienter les utilisateurs) est retirée et l’époxy est appliqué au bord de la chambre de perfusion (flèche). Remarque: Pour orienter plus facilement les utilisateurs où placer l’époxy, le support blanc a été laissé sur cette image. Le couvercle nettoyé et revêtu est fixé à la chambre d’imagerie avec le côté revêtement orienté vers l’intérieur du puits de perfusion. (B) Organigramme illustrant les étapes du conditionnement des chambres d’imagerie pour les liaisons biotine-streptavidine. C) Exemples de réactions utilisées pour acquérir des films TIRF de microtubules dynamiques et de filaments d’actine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Graphique 2. Séquences d’images de filaments d’actine et de microtubules en croissance en l’absence ou en présence de Tau. Montage d’images en accéléré à partir de tests TIRF contenant 0,5 μM d’actine (10 % d’Alexa-647-actine et 0,09 % de biotine-actine marquée) et 15 μM de tubuline libre (4 % marquée HiLyte-488) en l’absence (A) ou en présence (B) de 250 nM Tau. Le temps écoulé depuis l’amorçage de la réaction (mélange du tube A et du tube B) est indiqué. Barres d’échelle, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Graphique 3. Exemples de mesures de microtubules et de dynamique des filaments d’actine. (A) La projection temporelle moyenne du canal de tubuline permet de visualiser efficacement les longueurs totales de microtubules pour les balayages linéaires utilisés pour générer des diagrammes kymographiques. Les lignes pointillées noires correspondent aux deux exemples de kymographes de microtubules dynamiques représentés à droite. Les phases de croissance (lignes noires pleines) et de démontage (lignes roses pointillées; deux signalées par des flèches roses) des microtubules sont indiquées sur chaque kymographe. Barre d’échelle de temps, 3 min. Barre d’échelle de longueur, 10 μm. La réaction contient 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte). Seul le canal de la tubuline est affiché. (B) Deux exemples de montages d’images en accéléré représentant des filaments à actine unique polymérisés activement. Les taux d’allongement sont calculés comme la pente des placettes de la longueur des filaments d’actine au fil du temps par actine micromolaire. Ainsi, un facteur de correction de deux doit être appliqué aux réactions d’actine de 0,5 μM pour comparaison des taux généralement déterminés à la concentration d’actine de 1 μM. Des exemples de cinq filaments sont montrés à droite. Barres d’échelle, 10 μm. La réaction contient 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte). Seul le canal d’actine est affiché. C) Images TIRF de microtubules dynamiques (MT) (vert) et de filaments d’actine (violet) polymérisés en l’absence (à gauche) ou en présence de 250 nM Tau (au milieu). Des lignes pointillées bleues et des flèches marquent l’endroit où une ligne a été tracée pour les tracés de balayage de ligne correspondant à chaque condition (sous chaque image). Le chevauchement entre les microtubules et les régions d’actine (en noir) peut être noté à un point de temps défini par zone (à droite). Barres d’échelle, 25 μm. Les réactions contiennent 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte) avec ou sans 250 nM De Tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole est un guide pour visualiser l’actine dynamique et les microtubules à l’aide d’un test de microscopie à fluorescence interne totale (TIRF) in vitro .

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Malgré de nombreux exemples de coordination, la plupart des études examinent individuellement les protéines d’actine ou de microtubules. Cette méthode permet de visualiser les deux polymères dynamiques en une seule réaction. Cette technique permet à l’utilisateur d’évaluer diverses protéines régulatrices pour des propriétés émergentes qui ne pouvaient être observées qu’avec des versions dynamiques d’actine et de microtubules.Cette technique peut être étendue pour inclure des lipides ou des extraits pour se rapprocher de la construction d’une cellule synthétique. Commencez par décongeler les aliquotes de poudres PEG-Silane et Biotin-PEG-Silane, et dissolvez les poudres PEG dans de l’éthanol à 80% pour générer les solutions mères de revêtement de 10 milligrammes par millilitre mPEG-Silane et de deux à quatre milligrammes par millilitre Biotine-PEG-Silane. Retirez le couvercle propre du stockage de l’éthanol à l’aide d’une pince.Sécher avec de l’azote gazeux et conserver dans une boîte de Pétri propre. Enduisez les couvercles de 100 microlitres de solution de revêtement et incuvrez-les à 70 degrés Celsius pendant au moins 18 heures ou jusqu’à utilisation. Coupez 12 bandes de ruban adhésif double face à double dos sur une longueur de 24 millimètres.Retirez un côté du support de bande et fixez des morceaux de ruban adhésif adjacents aux six rainures présentes sur une chambre d’imagerie propre. Retirez le deuxième morceau de support de bande pour exposer le côté collant de la bande le long de chaque rainure de chambre et placez le côté de la bande de chambre vers le haut sur une surface propre. Mélangez la résine époxy et les solutions de durcisseur un à un dans un petit bateau de pesage et utilisez une pointe P1000 pour placer une goutte d’époxy mélangé entre les bandes de ruban à l’extrémité de chaque rainure de la chambre d’imagerie.Ensuite, placez la chambre, le ruban adhésif ou le côté époxy vers le haut, sur une surface propre. Retirez un couvercle enduit de l’incubateur à 70 degrés Celsius et rincez les surfaces enduites et non revêtues des couvercles avec de l’eau distillée double six fois. Sécher avec de l’azote gazeux filtré, puis fixer à la chambre d’imagerie avec le revêtement de glissement du couvercle vers le ruban adhésif.Utilisez une pointe de pipette P200 ou P1000 pour appliquer une pression sur l’interface en verre collé afin d’assurer une bonne étanchéité entre le ruban adhésif et le glissement du couvercle. Incuber les chambres assemblées à température ambiante pendant au moins cinq à 10 minutes pour permettre à l’époxy de sceller complètement les puits de la chambre avant utilisation. Les chambres de perfusion expirent dans les 12 à 18 heures suivant l’assemblage.Utilisez une pompe de perfusion et échangez séquentiellement des solutions de conditionnement dans la chambre de perfusion en faisant couler 50 microlitres de 1% BSA pour amorcer la chambre d’imagerie. Retirez l’excès de tampon du réservoir de verrouillage du leurre. Ensuite, faites couler 50 microlitres de 0,005 milligramme par millilitre de streptavidine et incubez pendant une à deux minutes à température ambiante.Retirez l’excès de tampon du réservoir. Débitez 50 microlitres de 1% BSA pour bloquer la liaison non spécifique et incuber pendant 10 à 30 secondes. Retirez l’excès de tampon du réservoir.Ensuite, faites circuler 50 microlitres de tampon CHAUD 1x TENF, puis 50 microlitres de graines de microtubules stabilisées et biotinylées à 50% diluées dans 1x tampon TIRF. Réglez la scène ou le dispositif de chauffage de l’objectif pour maintenir une température de 35 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant d’imager la première réaction biochimique. Ensuite, réglez l’intervalle d’acquisition à toutes les cinq secondes pendant 15 à 20 minutes.Ensuite, réglez les expositions laser 488 et 647 à 50 à 100 millisecondes à 5% à 10% de puissance en ajustant d’abord la réaction de polymérisation pour initier l’assemblage du filament d’actine. Acquérir les images à 647 nanomètres et effectuer les ajustements appropriés. Ensuite, ajustez la réaction de polymérisation dans un deuxième puits de perfusion conditionné pour initier l’assemblage des microtubules.Visualisez à 488 nanomètres et effectuez les ajustements appropriés. Combiner trois microlitres de 10 micromolaires 488 tubuline avec l’aliquote de 7,2 microlitres de 100 micromolaires de tubuline micromolaire non marquée par fluorescence au plus tard 15 minutes avant utilisation. Ensuite, combinez trois microlitres d’actine diluée liée à la biotine dans des volumes appropriés d’actine fluorescente non marquée et marquée de sorte que le mélange final sera de 12,5 micromolaires d’actine totale avec une étiquette fluorescente de 10% à 30%.Préparez le mélange de cytosquelette en combinant deux microlitres du mélange d’actine de 12,5 micromolaires avec le mélange de tubuline au plus tard 15 minutes avant l’imagerie. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation. Préparez le mélange de réactions protéiques en combinant tous les autres composants expérimentaux et protéines, y compris 2x tampon TIRF, anti-eau de Javel, nucléotides, tampons et protéines accessoires.Incuber le mélange de cytosquelette et le mélange de réaction protéique séparément à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 secondes. Pour initier la réaction, ajoutez le contenu du mélange de réaction protéique au mélange de cytosquelette et mélangez-le. Débiter 50 microlitres du mélange réactionnel contenant 1x tampon TIRF complété par 15 tubulines libres micromolaires, un GTP millimolaire, 0,5 monomère d’actine micromolaire et des volumes appropriés de contrôles tampons dans la chambre de perfusion.Enregistrez un film en accéléré à l’aide d’un logiciel de microscope pour l’acquérir toutes les cinq secondes pendant 15 à 20 minutes. Conditionnez un nouveau puits de perfusion et remplacez le volume tampon par la protéine régulatrice d’intérêt et les contrôles tampons. Acquérir pour évaluer les protéines régulatrices des fonctions émergentes des microtubules d’actine.Des exemples de mesures de microtubules et de dynamique des filaments d’actine sont montrés dans ces images. La projection temporelle moyenne du canal de tubuline visualise efficacement les longueurs totales de microtubules pour les balayages linéaires utilisés pour générer les diagrammes kymographiques. Les lignes pointillées noires correspondent aux deux exemples de kymographes des microtubules dynamiques.Les phases de croissance et de démontage des microtubules sont indiquées sur chaque kymographe. Deux exemples de montages d’images en accéléré représentant des filaments d’actine simples polymérisant activement sont présentés ici. Les taux d’allongement sont calculés comme la pente des tracés de la longueur des filaments d’actine au fil du temps par actine micromolaire.Ainsi, un facteur de correction de deux doit être appliqué à 0,5 réaction d’actine micromolaire pour comparer les taux généralement déterminés à la concentration d’actine micromolaire. Des exemples de cinq filaments sont présentés ici. La fluorescence totale par réflexion interne, ou images TIRF des microtubules dynamiques dans les filaments d’actine polymérisés en l’absence ou en présence de 250 nanomolaires Tau sont montrées ici.Les lignes pointillées bleues et les flèches marquent l’usure une ligne a été tracée pour les tracés de balayage linéaire correspondant à chaque condition. Le chevauchement entre les microtubules dans les régions de l’actine peut être noté à un point de temps défini par zone. Les protéines du cytosquelette, en particulier l’actine, les microtubules et leurs régulateurs sont très sensibles aux cycles de gel / dégel.Pour la cohérence et le succès, utilisez des protéines très pures et correctement stockées.

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Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

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