Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Malgré de nombreux exemples de coordination, la plupart des études examinent individuellement les protéines d’actine ou de microtubules. Cette méthode permet de visualiser les deux polymères dynamiques en une seule réaction. Cette technique permet à l’utilisateur d’évaluer diverses protéines régulatrices pour des propriétés émergentes qui ne pouvaient être observées qu’avec des versions dynamiques d’actine et de microtubules.

Cette technique peut être étendue pour inclure des lipides ou des extraits pour se rapprocher de la construction d’une cellule synthétique. Commencez par décongeler les aliquotes de poudres PEG-Silane et Biotin-PEG-Silane, et dissolvez les poudres PEG dans de l’éthanol à 80% pour générer les solutions mères de revêtement de 10 milligrammes par millilitre mPEG-Silane et de deux à quatre milligrammes par millilitre Biotine-PEG-Silane. Retirez le couvercle propre du stockage de l’éthanol à l’aide d’une pince.

Sécher avec de l’azote gazeux et conserver dans une boîte de Pétri propre. Enduisez les couvercles de 100 microlitres de solution de revêtement et incuvrez-les à 70 degrés Celsius pendant au moins 18 heures ou jusqu’à utilisation. Coupez 12 bandes de ruban adhésif double face à double dos sur une longueur de 24 millimètres.

Retirez un côté du support de bande et fixez des morceaux de ruban adhésif adjacents aux six rainures présentes sur une chambre d’imagerie propre. Retirez le deuxième morceau de support de bande pour exposer le côté collant de la bande le long de chaque rainure de chambre et placez le côté de la bande de chambre vers le haut sur une surface propre. Mélangez la résine époxy et les solutions de durcisseur un à un dans un petit bateau de pesage et utilisez une pointe P1000 pour placer une goutte d’époxy mélangé entre les bandes de ruban à l’extrémité de chaque rainure de la chambre d’imagerie.

Ensuite, placez la chambre, le ruban adhésif ou le côté époxy vers le haut, sur une surface propre. Retirez un couvercle enduit de l’incubateur à 70 degrés Celsius et rincez les surfaces enduites et non revêtues des couvercles avec de l’eau distillée double six fois. Sécher avec de l’azote gazeux filtré, puis fixer à la chambre d’imagerie avec le revêtement de glissement du couvercle vers le ruban adhésif.

Utilisez une pointe de pipette P200 ou P1000 pour appliquer une pression sur l’interface en verre collé afin d’assurer une bonne étanchéité entre le ruban adhésif et le glissement du couvercle. Incuber les chambres assemblées à température ambiante pendant au moins cinq à 10 minutes pour permettre à l’époxy de sceller complètement les puits de la chambre avant utilisation. Les chambres de perfusion expirent dans les 12 à 18 heures suivant l’assemblage.

Utilisez une pompe de perfusion et échangez séquentiellement des solutions de conditionnement dans la chambre de perfusion en faisant couler 50 microlitres de 1% BSA pour amorcer la chambre d’imagerie. Retirez l’excès de tampon du réservoir de verrouillage du leurre. Ensuite, faites couler 50 microlitres de 0,005 milligramme par millilitre de streptavidine et incubez pendant une à deux minutes à température ambiante.

Retirez l’excès de tampon du réservoir. Débitez 50 microlitres de 1% BSA pour bloquer la liaison non spécifique et incuber pendant 10 à 30 secondes. Retirez l’excès de tampon du réservoir.

Ensuite, faites circuler 50 microlitres de tampon CHAUD 1x TENF, puis 50 microlitres de graines de microtubules stabilisées et biotinylées à 50% diluées dans 1x tampon TIRF. Réglez la scène ou le dispositif de chauffage de l’objectif pour maintenir une température de 35 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant d’imager la première réaction biochimique. Ensuite, réglez l’intervalle d’acquisition à toutes les cinq secondes pendant 15 à 20 minutes.

Ensuite, réglez les expositions laser 488 et 647 à 50 à 100 millisecondes à 5% à 10% de puissance en ajustant d’abord la réaction de polymérisation pour initier l’assemblage du filament d’actine. Acquérir les images à 647 nanomètres et effectuer les ajustements appropriés. Ensuite, ajustez la réaction de polymérisation dans un deuxième puits de perfusion conditionné pour initier l’assemblage des microtubules.

Visualisez à 488 nanomètres et effectuez les ajustements appropriés. Combiner trois microlitres de 10 micromolaires 488 tubuline avec l’aliquote de 7,2 microlitres de 100 micromolaires de tubuline micromolaire non marquée par fluorescence au plus tard 15 minutes avant utilisation. Ensuite, combinez trois microlitres d’actine diluée liée à la biotine dans des volumes appropriés d’actine fluorescente non marquée et marquée de sorte que le mélange final sera de 12,5 micromolaires d’actine totale avec une étiquette fluorescente de 10% à 30%.

Préparez le mélange de cytosquelette en combinant deux microlitres du mélange d’actine de 12,5 micromolaires avec le mélange de tubuline au plus tard 15 minutes avant l’imagerie. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation. Préparez le mélange de réactions protéiques en combinant tous les autres composants expérimentaux et protéines, y compris 2x tampon TIRF, anti-eau de Javel, nucléotides, tampons et protéines accessoires.

Incuber le mélange de cytosquelette et le mélange de réaction protéique séparément à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 secondes. Pour initier la réaction, ajoutez le contenu du mélange de réaction protéique au mélange de cytosquelette et mélangez-le. Débiter 50 microlitres du mélange réactionnel contenant 1x tampon TIRF complété par 15 tubulines libres micromolaires, un GTP millimolaire, 0,5 monomère d’actine micromolaire et des volumes appropriés de contrôles tampons dans la chambre de perfusion.

Enregistrez un film en accéléré à l’aide d’un logiciel de microscope pour l’acquérir toutes les cinq secondes pendant 15 à 20 minutes. Conditionnez un nouveau puits de perfusion et remplacez le volume tampon par la protéine régulatrice d’intérêt et les contrôles tampons. Acquérir pour évaluer les protéines régulatrices des fonctions émergentes des microtubules d’actine.

Des exemples de mesures de microtubules et de dynamique des filaments d’actine sont montrés dans ces images. La projection temporelle moyenne du canal de tubuline visualise efficacement les longueurs totales de microtubules pour les balayages linéaires utilisés pour générer les diagrammes kymographiques. Les lignes pointillées noires correspondent aux deux exemples de kymographes des microtubules dynamiques.

Les phases de croissance et de démontage des microtubules sont indiquées sur chaque kymographe. Deux exemples de montages d’images en accéléré représentant des filaments d’actine simples polymérisant activement sont présentés ici. Les taux d’allongement sont calculés comme la pente des tracés de la longueur des filaments d’actine au fil du temps par actine micromolaire.

Ainsi, un facteur de correction de deux doit être appliqué à 0,5 réaction d’actine micromolaire pour comparer les taux généralement déterminés à la concentration d’actine micromolaire. Des exemples de cinq filaments sont présentés ici. La fluorescence totale par réflexion interne, ou images TIRF des microtubules dynamiques dans les filaments d’actine polymérisés en l’absence ou en présence de 250 nanomolaires Tau sont montrées ici.

Les lignes pointillées bleues et les flèches marquent l’usure une ligne a été tracée pour les tracés de balayage linéaire correspondant à chaque condition. Le chevauchement entre les microtubules dans les régions de l’actine peut être noté à un point de temps défini par zone. Les protéines du cytosquelette, en particulier l’actine, les microtubules et leurs régulateurs sont très sensibles aux cycles de gel / dégel.

Pour la cohérence et le succès, utilisez des protéines très pures et correctement stockées.