Un test de clivage peptidique fluorogénique pour cribler l’activité protéolytique des protéases
Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 2:42 min • July 8th, 2025
Les virus enveloppés avec des protéines de pointe transmembranaires contiennent un site de clivage protéolytique.
Les protéases liées à la membrane sur les cellules hôtes clivent les protéines de pointe, exposant des peptides de fusion qui facilitent l’entrée du virus.
Pour commencer, prenez des peptides de type sauvage avec le site de clivage canonique et des peptides variants, chacun portant une mutation unique sur le site.
Les peptides fluorogènes contiennent un fluorophore et un quenchanteur. En raison de la proximité, le quencher absorbe la fluorescence du fluorophore.
Prenez une plaque multi-puits sur de la glace, contenant le tampon de dosage et les protéases de l’hôte.
Ajoutez les peptides de type sauvage et de variante dans des puits séparés. Incuber à une température appropriée pour une activité optimale de la protéase.
La protéase clive les peptides, séparant le quencher du fluorophore et permettant son émission de fluorescence.
Mesurez la variation du signal de fluorescence pour déterminer le taux de clivage protéolytique.
Un taux plus élevé pour la séquence de type sauvage indique une activité protéolytique plus élevée, tandis qu’un taux plus faible pour les variants i
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