Procédé d’immunomarquage multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte

Prenez une section surrénalienne fixe et perméabilisée comprenant un cortex et une moelle. Traitez-le avec un tampon acide bouillant, en brisant les réticulations induites par la fixation pour le démasquage de l’antigène.

Bloquez les sites de liaison non spécifiques et introduisez des anticorps primaires qui se lient aux marqueurs spécifiques du cortex.

Ajoutez des anticorps secondaires biotinylés ciblant les anticorps primaires et des peroxydases conjuguées à la streptavidine se liant à la biotine.

Introduisez un tyramide marqué au fluorophore et du peroxyde d’hydrogène.

Les peroxydases immobilisées utilisent le peroxyde d’hydrogène pour activer le tyramide, qui se lie aux protéines voisines, marquant le cortex.

Ensuite, traitez la section avec le tampon d’ébullition pour éliminer les anticorps liés.

Introduire les mêmes anticorps primaires générés par l’espèce hôte ciblant les marqueurs spécifiques de la moelle épinière et les anticorps secondaires biotinylés.

Introduisez des peroxydases conjuguées à la streptavidine et un autre tyramide conjugué au fluorophore pour marquer la moelle.

L’élimination des anticorps primaires spécifiques du cortex inhibe l’anticorps secondaire réintroduit qui les lie, empêchant ainsi la réactivité croisée.

Appliquez une coloration nucléaire et effectuez une imagerie pour visualiser le cortex et la moelle distinctement colorés, confirmant l’absence de réactivité croisée des anticorps.

Avant la coloration, déparaffiné et réhydratez les lames fixées au formol et incluses dans de la paraffine avec des immersions de cinq minutes dans chaque solution comme indiqué. Après la deuxième immersion dans de l’eau distillée, placez les lames dans une solution bouillante de citrate de sodium de 275 millilitres au fond d’une boîte à pointes de pipette avec un couvercle, et placez la boîte dans un micro-ondes de 700 watts à 70 % de puissance pendant huit minutes.

À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à température ambiante avant de laver les lames avec trois lavages de cinq minutes de PBST frais dans un bocal Coplin. Pour bloquer tout site de liaison non spécifique, après le dernier lavage, secouez l’excès de PBST de chaque lame et couvrez les lames avec un volume suffisant d’une solution de blocage appropriée.

Après 30 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée, agitez l’excès de solution bloquante de chaque lame et ajoutez 250 microlitres du premier anticorps primaire d’intérêt à chaque échantillon. Pour éviter que les échantillons ne se dessèchent, les lames peuvent être recouvertes d’un morceau de film de paraffine.

Après une nuit d’incubation à quatre degrés Celsius dans la chambre humidifiée, lavez les lames trois fois avec du PBST frais pendant cinq minutes par lavage. Secouez l’excès de PBST, puis recouvrez rapidement chaque lame de 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure dans la chambre humidifiée à température ambiante.

À la fin de l’incubation, lavez les lames trois fois dans du PBST frais, comme démontré, et ajoutez 250 microlitres de streptavidine et de peroxydase de raifort fraîchement préparée à chaque lame. Après 30 minutes à température ambiante, lavez les lames trois fois dans du PBST frais, puis secouez l’excès de PBST et couvrez chaque lame avec 250 microlitres de solution de tyramide fluorophore fraîchement préparée.

Une minute plus tard, immergez les diapositives dans du PBST frais, suivi de trois lavages de deux minutes dans du PBST frais. Après le dernier lavage, appliquez quelques gouttes d’une solution de glycérol 1 pour 1 à PBS sur les sections et vérifiez la présence d’un signal fluorescent par microscopie à fluorescence.

Pour éliminer le premier complexe d’anticorps, placez les lames marquées d’anticorps dans 275 millilitres de solution bouillante de citrate de sodium pendant au moins huit minutes, comme démontré. À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à température ambiante, avant de laver les lames trois fois avec du PBST pendant cinq minutes par lavage.

Pour colorer la deuxième protéine cible d’intérêt, après la démonstration du blocage pour la liaison non spécifique, étiquetez chaque échantillon avec 250 microlitres du deuxième anticorps primaire d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les lames trois fois pendant cinq minutes dans du PBST frais par lavage avant de recouvrir chaque lame de 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure à température ambiante.

À la fin de l’incubation, lavez les lames trois fois dans du PBST frais, comme démontré, et ajoutez 250 microlitres de streptavidine et de peroxydase de raifort fraîchement préparée à chaque lame. Pour développer le signal de la deuxième protéine cible d’intérêt après trois lavages PBST, traitez les lames avec un tyramide conjugué au fluorophore dans un spectre fluorescent différent.

Pour arrêter le développement du signal tyramide, immergez les lames dans du PBST, puis colorez les échantillons avec un colorant nucléaire approprié.