Immunohistochimie et d'étiquetage multiple avec des anticorps de l'espèce hôte mêmes pour l'étude des adultes hippocampe neurogenèse

L’objectif global de cette procédure est de contourner les limites de l’immunofluorescence indirecte pour étudier les cellules progénitrices neurales. Lorsqu’il n’existe pas d’anticorps primaires appropriés provenant de différentes espèces hôtes. Initialement, un analogue de la thymidine est injecté pour marquer les cellules en division, après quoi le tissu est récolté, traité et découpé en sections cryogéniques.

Ensuite, une immunofluorescence multiple séquentielle est effectuée pour commencer. Un anticorps primaire non marqué est appliqué, qui est ensuite lié par un anticorps secondaire marqué par fluorescence. Ensuite, les péricopes ouvertes du premier anticorps secondaire sont bloquées par le sérum de l’espèce d’anticorps primaire, et toutes les immunoglobulines qui pourraient être reconnues par le deuxième anticorps secondaire sont recouvertes de fragments de fabrication non conjugués.

Cela permet au tissu d’être traité avec un deuxième anticorps primaire, qui peut être marqué par un anticorps secondaire différent. En fin de compte, les images des coupes sont utilisées pour étudier le développement et la régulation des cellules progénitrices neurales en réponse à des stimuli spécifiques et leur implication dans des fonctions cérébrales particulières. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunofluorescence multiple simultanée est qu’elle contourne les problèmes découlant généralement de la nécessité d’utiliser des anticorps primaires élevés dans la même espèce hôte.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse adulte, telles que la prolifération de sous-ensembles de progéniteurs de l’hippocampe en réponse à des stimuli physiologiques ou pharmacologiques, des pathologies cérébrales ou le vieillissement. En général, les individus qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car le marquage multiple avec des anticorps primaires de la même espèce hôte peut entraîner des activités de croisement d’anticorps indésirables sans blocage adéquat. Tout d’abord, pesez les animaux à injecter et préparez une solution mère fraîche de 10 milligrammes par millilitre de thymidine pour l’injection.

Lorsque la solution est prête, préparez une dose ajustée au poids dans une seringue à dosage fin avec une aiguille de calibre 30. Ensuite, retenez la souris par la peau et injectez l’analogue de la thymidine intrapéritonéale au point de temps souhaité, anesthésiez profondément la souris et trans cardio. Perfuser-le avec 10 millilitres de PBS glacé, suivis de 40 millilitres de solution de formaldéhyde fraîche et glacée.

Ensuite, disséquez le cerveau et postez-le, fixez-le dans le même fixateur après la fixation. Incuber les cerveaux collectés pendant 24 heures dans 10 % de saccharose à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez les cerveaux dans 30 % de saccharose et incubez pendant 48 heures supplémentaires.

Avec les cerveaux prêts pour la cryoprotection, congelez-les à moins 25 degrés Celsius isop pentane. Plus tard, utilisez un cryostat pour couper des sections coronales de 40 microns pour un stockage à long terme. Transférez les sections dans une solution antigel et maintenez-les à moins 20 degrés Celsius.

Commencez par transférer les sections de la solution d’antigel au TBS à l’aide d’une brosse fine. Rincez abondamment les sections, en commençant par un lavage de nuit à quatre degrés Celsius, suivi de cinq lavages de 10 minutes à température ambiante. Toutes ces incubations doivent être effectuées avec une agitation douce et continue.

Si l’un des antigènes d’intérêt est un analogue de la thymidine, une étape de dénaturation de l’acide chlorhydrique doit être mise en œuvre à ce stade, suivie d’une étape de neutralisation dans le tampon de forage. Procéder à la perméabilité et au blocage des sites de liaison des anticorps non spécifiques dans TBS plus. Laissez cette incubation durer une heure à température ambiante, puis incubez dans le premier anticorps primaire dilué dans du TBS plus toute la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Lavez les sections trois fois dans TBS et une fois dans TBST. Laissez aller chaque bain pendant 10 minutes. Ensuite, incubez dans le premier anticorps secondaire conjugué au fluorochrome pendant trois heures à température ambiante.

À partir de maintenant, protégez les sections de l’exposition à la lumière. Après une autre série de lavages, transférez les sections dans une solution sérique à 10 % d’espèces hôtes à partir de laquelle les deux anticorps primaires ont été fabriqués. Incuber les sections dans cette solution pendant trois heures pour saturer les péricopes ouvertes du premier anticorps secondaire.

Plus tard, rincez trois fois au TBS et une fois au TBST pour éliminer le sérum. Préparez ensuite une solution de TBS plus avec 50 microgrammes par millilitre de fragments de fabrication monovalents non conjugués dirigés contre l’espèce hôte de l’anticorps primaire. Cela couvre les épitopes qui pourraient autrement être reconnus par le deuxième anticorps secondaire.

Transférez les sections dans cette solution et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, rincer les sections au moins trois fois dans le TBS et une fois dans le TBST. Pendant les transferts, tamponnez les inserts en maille contenant les sections sur une serviette en papier pour éliminer les résidus de fabrication.

Maintenant, incubez les sections du deuxième anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après une autre série de lavages, appliquez le deuxième anticorps secondaire pendant trois heures à température ambiante. Enfin, lavez les sections trois fois dans TBS et procédez au montage des sections de gélatine.

Séchez les diapositives à l’air libre et glissez-les à l’aide d’une image support de montage ANTIFA. Les coupes marquées en fluorescence avec un microscope confocal à balayage laser. Prenez des piles d’images à des positions aléatoires sur toute l’étendue du gyrus denté à un grossissement de 400 fois.

Analyser au moins 50 cellules d’intérêt sélectionnées au hasard par hémisphère pour le co-marquage des différents marqueurs. Pour calculer les nombres absolus pour des populations spécifiques de cellules néonatales, multipliez les pourcentages de cellules co-marquées par le nombre total de cellules néonatales estimé à partir de l’analyse de coloration DAB. Les méthodes décrites ont été utilisées pour quantifier et caractériser les cellules nouveau-nées dans l’hippocampe postnatal et adulte d’un cycle déficient en neurogenèse.

D deux modèles de souris knock-out, la coloration DAB contre différents marqueurs de prolifération comme le KI 67 ou le BRDU a constamment révélé des différences dans le nombre de cellules du nouveau-né entre les souris de type sauvage et les souris knock-out. Les cellules néonatales marquées BRDU pourraient être phénotypées avec un protocole conventionnel d’immunofluorescence multiple consistant à appliquer simultanément des anticorps primaires contre la nidification B-R-D-U-G-F-A-P dans la GFP et la double courtine. Cela a permis d’identifier avec succès les cellules progénitrices du nouveau-né de type un, de type deux A, de type deux B et de type trois dans un seul échantillon.

Alternativement, avec des intervalles de temps plus longs entre l’injection de BRDU et le sacrifice de l’animal, le nombre final de neurones nouveau-nés pourrait être analysé par une nouvelle immunocoloration BRDU simultanée. Le protocole d’immunomarquage séquentiel a parfaitement fonctionné si des sections ont d’abord été incubées simultanément avec des anticorps anti-KI 67 de lapin, anti-GFP de chèvre et anti double cordon de porc d’Inde, et d’autre part, avec des anticorps anti-GFAP de lapin, mais pas l’inverse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser jusqu’à quatre antigènes différents dans une seule section de tissu en utilisant des anticorps primaires élevés chez le même hôte.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’inclure des contrôles appropriés pour éliminer la possibilité d’anticorps, de réactivité croisée ou de faux positifs. Sachez que la séquence d’incubation des anticorps primaires peut fortement influencer le résultat du protocole.