Name: Immunohistochimie et détiquetage multiple avec des anticorps de lespèce hôte mêmes pour létude des adultes hippocampe neurogenèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Découvrez une méthode d'immunofluorescence séquentielle pour quantifier toutes les étapes de la neurogenèse adulte dans l'hippocampe. Cette technique contourne les limitations des anticorps de même espèce hôte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient S. Tausch pour son excellente assistance technique. Les travaux ont été soutenus par BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) et DFG (FOR1738).

NOTE: Toutes les procédures impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à la directive CE 86/609 / CEE des lignes directrices sur le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le comité d&#39;éthique local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. Injection par voie intrapéritonéale analogues de la thymidine <ol><li> Peser les animaux le jour avant l&#39;injection. Calculez le montant de la thymidine analogique requise pour toutes les injections prévues le lendemain ainsi que les volumes d&#39;injection individuels poids ajusté d&#39;un / ml solution stock de 10 mg. </li><li> Préparer / ml thymidine solution mère à 10 mg. (ATTENTION! Analogues de la thymidine sont toxiques. Suivez les fiches spécifiques de données de sécurité (FDS) fournies par les fournisseurs, ce est à dire, porter une blouse de laboratoire et des gants, utiliser une hotte chimique). <ol><li> Prenez thymidine analogique du congélateur et l&#39;amener à RT, env. 21 ° C. Peser 10 mg et ajouterune solution saline stérile (pour BrdU et CldU) ou N NaOH 0,04 (dans une solution saline stérile, car UDI), vortex. Placez au moins 10 à 15 min dans un bain tourbillon et 50 ° l&#39;eau tous les 2 à 3 min pour dissoudre la poudre. REMARQUE: Utilisez des solutions pour un maximum de 24 heures se il est entreposé à température ambiante et pendant plusieurs semaines à -20 ° C. Protéger solutions de la lumière (couvrir de papier d&#39;aluminium). Toujours vérifier précipités et re-dissoudre si nécessaire. </li></ol></li><li> Retenez la souris par la peau et par voie intrapéritonéale injecter un volume approprié, ajustée au poids de la solution mère (à température ambiante) en utilisant une seringue de dosage de précision avec une aiguille 30 G. NOTE: En cas CldU et IdU doivent être administrés de façon séquentielle dans le même animal, considèrent injecter des concentrations équimolaires (par exemple, 42,5 mg / kg et 57,5 CldU mg / kg IdU, ce qui correspond à 50 mg / kg BrdU). Par conséquent, ajuster le volume d&#39;injection des solutions à 10 mg / ml actions en conséquence. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Prepare 4% de formaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate pH 7,4 le jour avant la perfusion. Conserver à 4 ° C. </li><li> Perfuser transcardiaque les souris profondément anesthésiés (3,5% de l&#39;isoflurane) via le ventricule gauche avec du PBS 10 ml glacée, puis avec 40 ml glacée formaldéhyde (débit de 5 ml / min). On dissèque le cerveau et la post-correction dans le même fixatif pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Transférer les cerveaux consécutivement dans 10% (24 h à 4 ° C) et 30% de saccharose (jusqu&#39;à ce que les puits du cerveau, env. 48 h). Pour la congélation, plonger lentement dans les cerveaux cryoprotégés -25 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune bulle isopentane émergent du tissu. Stocker à -80 ° C. </li><li> Couper des coupes coronales de 40 pm d&#39;épaisseur sur un microtome de congélation (température du bloc à -25 et -16 ° C). sections de transfert de manière séquentielle dans une solution d&#39;antigel contenant des puits d&#39;une plaque de culture cellulaire à 24 puits (voir Figure 1). Stocker à -20 ° C. </li></ol><img aLT = &quot;Figure 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. Représentation schématique de transférer tranches microtome dans une plaque de 24 puits. Commencez à A1 et placez les tranches ultérieures dans la ligne A, après A6 aller jusqu&#39;à la ligne B et ainsi de suite. En arrivant à D6, revenir à A1 et continuer. Cet agencement permet de tranches pour la quantification de chaque n-ième partie de l&#39;ensemble d&#39;un cerveau. Pour la quantification des cellules nés prendre toutes les 6 e section du cerveau (l&#39;équivalent du contenu d&#39;une colonne), par immunofluorescence phénotypage prendre chaque section 12 e (équivalent au contenu de deux lignes alternées d&#39;une colonne). 3. Immunocoloration NOTE: Les sections sont traitées flottement libre, généralement dans des plaques 6 puits équipés d&#39;une plaque de support et Mesh. Par exception, le blocage, incubations d&#39;anticorps et la réaction ABC sont faites dans 12 ou 24 puits plaques sans inserts en mesh (0,5 à 1 ml par well est suffisante, en fonction du nombre de tranches qui doivent être colorées). Au cours de ces étapes, transférer sections avec l&#39;aide d&#39;un pinceau (rincer à chaque nouvelle solution). Toutes les incubations sont faites avec agitation continue (max 150 rpm). <ol><li> Immunohistochimie (méthode ABC) <ol><li> Transfert sections de l&#39;antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement l&#39;antigel. </li><li> Incuber pendant 30 min dans 1,5% de H 2 O 2 dans du TBS-T pour étancher une activité de peroxydase endogène. Faites attention à bulles et re-plonger sections si nécessaire. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Facultatif: Pendant ce temps, préchauffer une enceinte de chauffage et du HCl 2 N à 37 ° C. Incuber les coupes pendant 30 min à 37 ° C dans du HCl 2 N pour dénaturer l&#39;ADN. Gently sections distinctes à l&#39;aide d&#39;une brosse. </li><li> Facultatif: Neutraliser sections pendant 10 min dans 0,1 M tampon borate pH8,5, la température ambiante. Pendant le transfert, tamponner brièvement les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever restes HCl. Rincer deux fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d&#39;anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante. </li><li> Incuber dans anticorps primaire dilué dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Incuber dans anticorps secondaire biotinylé dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. Pendant ce temps ... </li><li> Préparer complexe ABC selon le protocole du fabricant (A + 1% 1% de B dans du TBS-T). Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante avant utilisation. Incuber sections réactif AB pendant 1 heure à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Préparer 50 ml 0,5 mg / ml DAB dans du TBS-T par 6 ou 12 puits plaque, divisé en deux moitiés et pipette 4 ml ou 2 ml par puits, respectivement. sections de transfert en solution DAB (ATTENTION! DAB est toxique. Suivez les spécific FDS fournies par le fournisseur, ce est à dire, de porter une blouse de laboratoire et des gants, utilisent une hotte chimique). </li><li> Ajouter 0,5 ml 1% H 2 O 2 à 25 ml de solution de DAB restant, mélanger et volumes pipette équivalentes comme ci-dessus à chaque puits pour démarrer la réaction peroxydase. Incuber pendant 12 min. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l&#39;air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage permanent. </li><li> Facultatif: Counterstain avant de placer la lamelle (voir section 3.5). NOTE: Si le rapport signal-bruit est faible en raison de bruit de fond élevé, répéter le traitement H 2 O 2 après l&#39;incubation avec le réactif AB (étape 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-immunofluorescence <ol><li> Immunofluorescence multiple unique ou simultanée <ol><li> Transfert sections de l&#39;antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement unetifreeze. </li><li> En option: que les étapes 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d&#39;anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante. </li><li> Incuber dans un cocktail d&#39;anticorps primaire (par exemple, α-BrdU rats, porcs Guinée α-DCX, chèvre α-GFP) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Incuber dans cocktail d&#39;anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome (par exemple, la rhodamine Rouge α-rat, Alexa-647 α-Guinée porc, Alexa-488 α-chèvre; tous dérivés dans âne) dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. </li><li> Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l&#39;air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage aqueux. </li></ol></li><li> Immunofluorescence multiple séquentielle avec des anticorps primaires de même espèce hôte <ol><li> Comme les étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incuber dans fipremier anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène A), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber en premier anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Rhodamine Red-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber à 10% de sérum normal même hôte que l&#39;anticorps primaire (par exemple, du sérum de lapin) pendant 3 heures à RT saturer paratopes ouvertes sur le premier anticorps secondaire. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans TBSplus avec 50 ug / ml monovalents non conjugué de fragments Fab dirigé contre l&#39;hôte des anticorps primaires (par exemple, α-lapin IgG (H + L)) pour couvrir épitopes qui pourraient être reconnus par le deuxième anticorps secondaire, O / N à 4 ° C. </li><li> Rincer au moins 3 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. Pendant le transfert, swa brièvementb les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever les restes Fab. </li><li> Incuber dans secondes anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène B), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber en second anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Alexa-488-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus. NOTE: Pour étiqueter antigènes avec des anticorps de différentes espèces hôtes les ajouter à l&#39;étape 3.2.2.2 et les anticorps secondaires respectifs à l&#39;étape 3.2.2.3. </li></ol></li><li> L&#39;un des anticorps secondaires de même espèce que l&#39;un des anticorps primaires NOTE: Ce protocole est adapté pour quadruple coloration contre BrdU ou Ki67 avec GFAP, nestine-GFP et DCX. <ol><li> Suivre strictement les étapes protocole 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Jusqu&#39;à ce point ne utiliser que du sérum âne dans TBSplus. </li><li> Incuber dans TBSplus contenant du sérum de chèvre à 3% pendant 1 heure à température ambiante. Ce couvre paratopes ouvertes sur l&#39;anticorps secondaire α-chèvre. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans AMCA-conj. α-lapin de chèvre dilué à TBSplus, RT 3 h ou O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus. </li></ol></li><li> CldU, IdU co-coloration <ol><li> Rincer, dénaturer et de neutraliser sections comme décrit dans la section 3.2.1 (étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incuber à 20 pg / ml de fragments Fab non conjugués α-IgG de souris (H + L) dans TBSplus, 1 heure à température ambiante. Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans un cocktail d&#39;anticorps primaire contenant α-BrdU rat (1: 400; purifié IgG2) et α-BrdU souris (1: 350) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans un cocktail d&#39;anticorps secondaire biotinylé contenant âne α-rat (1: 500) et FITC-conj. âne α-souris fragments Fab (1: 100). Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber dans la rhodamine-Rouge conj. Streptavidine, 2 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus. </li></ol></li><li> L&#39;amplification du signal de fluorescence dans des souris nestine-GFP <ol><li> Ajouter chèvre α-GFP au cocktail d&#39;anticorps primaire. </li><li> Ajouter un anticorps secondaire conjugué fluorochrome avec des propriétés spectrales similaires à la GFP (comme Alexa 488 conj. Âne α-chèvre) au cocktail d&#39;anticorps secondaire. </li></ol></li></ol></li><li> épitope <ol><li> Effectuer épitope après rinçage à l&#39;antigel. Préchauffer vapeur avec 6 ou 12 puits des plaques contenant 0,1 M de tampon citrate pH compris entre 6,0 95 à 99 ° C (environ 25 min). </li><li> Transférez les sections dans le tampon citrate chaude et la vapeur pendant 30 min (couvrir les plaques avec du papier d&#39;aluminium que le plastique lidentifiants ne sont pas résistant à la chaleur). </li><li> Immédiatement placer les plaques dans un bain de glace pour refroidir. Cela permet de protéger la morphologie du tissu, ce qui est particulièrement important lorsque l&#39;on travaille avec des coupes de cerveau des animaux post-natales. </li><li> Rincer trois fois dans TBS pendant 10 minutes chacun pour rincer et neutraliser le citrate et continuer coloration. </li></ol></li><li> Souris anticorps sur des tissus de la souris <ol><li> Ajouter / ml de fragments Fab monovalents 20 ug de α-souris IgG (H + L; mêmes espèces d&#39;hôtes que l&#39;anticorps secondaire) à la première étape de blocage (par exemple, l&#39;étape 3.1.5 ou 3.2.1.3). </li><li> Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 min chacun, et procéder avec protocole respective. </li></ol></li><li> Le violet de crésyl contre-coloration <ol><li> Préchauffer solution crésyl violet à 60 ° C (en pot de verre). Incuber les lames dans la solution chaude pendant 3 min. </li><li> Rincer à l&#39;aq. dest. déshydrater et deux fois pendant 1 minute chaque à 70%, 96% et 100% d&#39;isopropanol. </li&gt; <li> Ciel de 5-6 min dans du xylène ou un substitut du xylène et lamelle avec un milieu de montage permanent compatible. </li></ol></li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Compter les cellules nés peroxydase colorées dans chaque section 6 e sur toute la mesure rostrocaudal du gyrus denté. Utilisez un microscope optique à un grossissement de 400X. </li><li> Multiplier les nombres de cellules résultant de l&#39;intervalle d&#39;intersection pour obtenir une estimation du nombre total de cellules-nés. </li><li> L&#39;image de la fluorescence sections marqué avec un microscope confocal laser équipé de lasers appropriés et des systèmes de filtrage. Prendre piles d&#39;images à des positions aléatoires le long de la totalité de l&#39;étendue du gyrus denté à un grossissement de 400X et analyser au moins 50 cellules d&#39;intérêt sélectionnés au hasard par hémisphère pour co-marquage avec d&#39;autres marqueurs. </li><li> Multiplier les pourcentages résultant de cellules co-marqué (% / 100) avec le nombre total de cellules nés pour calculer absoluenombre de populations spécifiques de cellules nouveau-nés. </li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li>
<li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li>
<li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li>
<li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning%3F+evidence+from+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li>
<li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li>
<li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li>
<li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li>
<li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+protein%3A+the+immaculate+deception%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li>
<li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46(2012).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li>
<li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry%3A+a+concise+review+with+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem.+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Quantification et identification des sous-populations de cellules nouveau-nés est une question centrale dans la recherche de la neurogenèse adulte. Combinant marqueurs de prolifération et des anticorps contre les protéines exprimées au cours des étapes spécifiques de la neurogenèse adulte permet la détection immunohistochimique de ces sous-populations. Certains des anticorps ou des combinaisons d&#39;anticorps de coloration nécessitent des conditions particulières. Étiquetage des cellules en...

Deux régions du cerveau de manière constitutive générer de nouveaux neurones tout au long de la vie, la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus denté de l&#39;hippocampe (DG). Les nouveaux neurones dérivent de cellules progénitrices neurales et passent par différents stades de développement morphologique et physiologique avant d&#39;atteindre la maturité 1,2. A partir d&#39;une cellule souche radiale divisant lentement glie-like (type 1) étages consécutifs de transit amplification de cellules progénitrices intermédiaires se présentent. Les sous-types plus indifférenciées (type 2a et 2b) de type ont une forme irrégulière avec de courtes, les processus tangentielles. Ils génèrent des neuroblastes (type 3) qui sortent graduellement du cycle cellulaire pour devenir neurones immatures (avec dendrites étendus vers la couche moléculaire) et finalement se intégrer dans le réseau de l&#39;hippocampe des cellules granulaires comme matures. En raison de leurs caractéristiques physiologiques particulières ces cellules fournissent les circuits améliorés avec la plasticité 3 suggesTing un rôle unique dans la fonction hippocampique. En fait, les études de la dernière décennie ont généré des preuves substantielles que la neurogenèse adulte contribue à la mémoire spatiale, la séparation de modèle et le comportement émotionnel 4,5. Neurogenèse adulte peut être étudiée en utilisant des approches différentes. analogues de la thymidine intègrent dans l&#39;ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire et permettent la naissance datant, la quantification et le destin analyse des cellules nés 6-8. L&#39;application séquentielle des différents analogues de la thymidine (par exemple, CldU, EdU ou UDI) peut être utilisée pour étudier le renouvellement cellulaire ou populations de cellules nés à différents moments au cours d&#39;une expérience 9. Une alternative, le marqueur endogène pour la prolifération cellulaire est Ki67. Il est exprimé dans les cellules en division au cours de toutes les phases du cycle cellulaire (G1, S, G2, M) à l&#39;exception de la phase de repos (G0) et le début de G1 10,11. Afin d&#39;analyser le phénotype des populations de cellules-nés chez l&#39;adulte dentate gyrus plusieurs marqueurs moléculaires spécifiques de stade peuvent être utilisés tels que GFAP, nestine, DCX et NeuN 1,6. GFAP est un marqueur des astrocytes matures, mais est également exprimé dans les cellules gliales radiales comme dans le cerveau antérieur des adultes. Nestin est un filament intermédiaire spécifique des cellules gliales radiales ressemblant et les cellules progénitrices intermédiaires début. DCX est une protéine associée aux microtubules exprimée dans les progéniteurs intermédiaires, les neuroblastes et les neurones immatures. Basé sur le (co) expression de ces trois marqueurs et les caractéristiques morphologiques des cellules marquées quatre sous-types de cellules souches distinctes peuvent être identifiés: le type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), le type 2a (GFAP -, nestine + , DCX -), le type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) et le type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +) 1. Co-marquage de DCX avec NeuN, qui est exprimé dans les neurones post-mitotiques, permet la différenciation des immature (DCX +, NeuN +) et matures (DCX -, NeuN +) neurones granulaires. Les marqueurs mentionnés ci-dessus sont fréquemment utilisés pour co-marquage immunofluorescent et microscopie confocale ultérieur pour analyser le nombre et l&#39;identité des cellules de nouveau-nés. Cela nécessite habituellement des anticorps de différentes espèces hôtes anticorps pour empêcher une réactivité croisée indésirable. Cependant, la majorité des anticorps primaires appropriés pour la recherche de la neurogenèse sont élevés soit chez le lapin ou souris (par exemple, souris α-BrdU, souris α-NeuN, lapin α-Ki67, lapin α-GFAP). Cela conduit à de sérieuses limitations dans le nombre et la combinaison des antigènes qui peuvent être évalués en une seule tranche. Ceci à son tour augmente non seulement l&#39;effort de coloration, selon colorations multiples doivent être effectuées, mais peut aussi compromettre la fiabilité des résultats. De plus, certains antigènes sont sensibles à la formaline épitope induite par masquage de fixation (par exemple, Ki67, La nestine). Nous décrivons ici modifications des protocoles de immunomarquage simples et multiples classiques (par exemple, la récupération de l&#39;épitope, immunocoloration séquentielle multiples, utilisation de la nestine-GFP souris transgéniques 12) à surmonter bon nombre de ces questions. En particulier, le protocole d&#39;immunofluorescence multiple séquentielle permet coloration contre un maximum de quatre antigènes différents même si une partie des anticorps est dérivé du même hôte. Ceci permet la détection simultanée de type 1, type 2a, 2b et le type des cellules progénitrices de type 3, ainsi que leur activité proliferative dans une seule section.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Administration d’analogue de thymidine</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime ;-désoxyuridine, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>toxique (mutagène, tératogène)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime ;-désoxyuridine, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>toxique (mutagène, tératogène)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime ;-désoxyuridine, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>toxique (mutagène, tératogène)</td></tr><tr><td>5-Iodo-2&prime ;-désoxyuridine, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>toxique (mutagène, tératogène)</td></tr><tr><td colspan="4">Préparation des tissus</td></tr><tr><td>Isoflurane-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Poudre de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml ; fr</td><td>16005</td><td>toxique, inflammable</td></tr><tr><td>Pompe à perfusion PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Tube de laboratoire Masterflex Tygon, & Oslash ; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d’alimentation, droite, 21 G, pointe olive 1,75 mm, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>Microtome de congélation Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques multipuits de culture cellulaire 24 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochimie</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine vapeur</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm inserts de membrane en maille polyester</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>préchargé en plaques de culture 6 puits</td></tr><tr><td>Netwell 15 mm inserts</td> <td>de membrane en maille polyesterCorning</td><td>3477</td><td>préchargé dans des plaques de culture à 12 puits</td></tr><tr><td>Kit de support en plastique Netwell à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>pour inserts de membrane en maille de polyester de 24 mm</td></tr><tr><td>Kit de support en plastique Netwell à 12 puits Corning</td><td></td><td>3520</td><td>pour inserts de membrane en maille de polyester de 15 mm</td></tr><tr><td>Kit Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrachlorhydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>cancérogène, sensible à la lumière</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Anticorps primaires</td></tr><tr><td>Rabbit IgG1 &alpha ;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100 ; nécessite la récupération de l’épitope</td></tr><tr><td>Lapin &alpha ;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Systèmes synaptiques</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG de chèvre (H+L) &alpha ;-GFP</td><td>Anticorps Acris</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>IgG1 de souris &alpha ;-nestin</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200 ; nécessite la récupération de l’épitope</td></tr><tr><td>IgG de cobaye (H+L) &alpha ;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG2a de rat &alpha ;- BrdU (ascite)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>pour la détection de BrdU ; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Rat IgG2a &alpha ;-BrdU (purifié)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp ; &nbsp ;</td><td>pour la détection de CldU ; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>souris IgG1 &alpha ;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>souris IgG1&#954 ; &#945 ;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Pour la détection de l’IdU ; DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">Anticorps secondaires</td></tr><tr><td>Donkey &alpha ;-cobaye IgG (H+L)-Biotine</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG d’âne &alpha ;-rat (H+L)-Biotine</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG d’âne &alpha ;-souris (H+L)-Biotine</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG de chèvre &alpha ;-rat (H+L)-</td><td>Sondes moléculaires</td> Alexa Fluor 488 <td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>IgG âne &alpha ;-chèvre (H+L)-Sondes moléculaires Alexa Fluor 488</td><td></td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>IgG âne &alpha ;-souris (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>IgG âne &alpha ;-souris (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Âne &alpha ;-cobaye IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Âne &alpha ;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Âne &alpha ;-lapin IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Âne &alpha ;-cochon d’Inde IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptavidine-rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Chèvre &alpha ;-lapin IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, fonctionne uniquement avec lapin &alpha ;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondes moléculaires</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>DAPI D1306</td><td>1:1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Blocking </td></tr><tr><td>Fragment d’âne &alpha ;-souris IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Âne isolé &alpha ;-lapin IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Sérum normal de lapin</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum normal de chèvre</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>substitut de xylène non toxique</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>milieu</td></tr> <tr>de montage permanent<td colspan="4">Microscopie</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td><td>Microscopie</td><td></td><td></td>Carl Zeiss</tr><tr><td>LSM 710</td><td>Microscopie</td><td></td><td></td> Carl Zeiss</tr></tbody></table>

immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Neurogenèse adulte est un processus très réglementé multi-étape dans laquelle de nouveaux neurones sont générés à partir d&#39;une cellule souche neurale activé par de plus en plus engagés sous-types de souches intermédiaires. Chacun de ces sous-types exprime un ensemble de marqueurs moléculaires spécifiques qui, avec des critères morphologiques spécifiques, peuvent être utilisés pour leur identification. Typiquement, les techniques d&#39;immunofluorescence sont appliqués impliquant des anticorps spécifiques du sous-type en combinaison avec des marqueurs de prolifération exo ou endogènes. Nous décrivons ici immunomarquage méthodes pour la détection et la quantification de tous les stades de la neurogenèse hippocampique adulte. Celles-ci comprennent l&#39;application d&#39;analogues de la thymidine, perfusion transcardial, traitement des tissus, épitope par la chaleur, ABC immunohistochimie, immunofluorescence indirecte multiple, microscopie confocale et de quantification des cellules. En outre, nous présentons un protocole d&#39;immunofluorescence multiple séquentielle qui contourne les problèmes usually découlant de la nécessité d&#39;utiliser des anticorps primaires soulevées dans les mêmes espèces hôtes. Il permet une identification précise de tous les sous-types de souches de l&#39;hippocampe avec un marqueur de prolifération dans une seule section. Ces techniques sont un outil puissant pour étudier la régulation de différents sous-types de souches en parallèle, leur implication dans les pathologies du cerveau et de leur rôle dans les fonctions spécifiques du cerveau.

Nous avons appliqué les méthodes décrites ci-dessus pour quantifier et caractériser les cellules de nouveau-nés dans les postnatales et adultes hippocampe. Par conséquent, nous avons utilisé de type sauvage et la neurogenèse déficientes cycline D2 knock out (KO) Ccnd2 souris logées dans des conditions connues pour affecter le taux de la neurogenèse (ie, l&#39;environnement enrichi, EE) 13,14. DAB coloration immunohistochimique soit contre Ki67, BrdU, CldU ou IdU toujours révélé des différenc...

Cet article vidéo illustre un protocole complet permettant de détecter et de quantifier tous les stades de la neurogenèse de l’hippocampe adulte au sein d’une même section de tissu. Nous avons élaboré une méthode pour surmonter les limites de l’immunofluorescence multiple indirecte qui surviennent lorsque des anticorps appropriés de différentes espèces hôtes ne sont pas disponibles.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

L'objectif général de cette procédure est de contourner les limites de l'immunofluorescence indirecte pour étudier les cellules souches neurales, lorsque des anticorps primaires appropriés provenant d'espèces hôtes différentes ne sont pas disponibles. Dans un premier temps, un analogue de la thymidine est injecté afin de marquer les cellules en division, puis le tissu est prélevé, traité et découpé en coupes cryogéniques.Ensuite, l'immunofluorescence multiple séquentielle est initiée. Un anticorps primaire non marqué est appliqué, puis lié par un anticorps secondaire marqué fluorescent. Ensuite, les sites ouverts des premiers anticorps secondaires sont bloqués à l'aide du sérum de l'espèce de l'anticorps primaire, et toutes les immunoglobulines pouvant être reconnues par le second anticorps secondaire sont recouvertes par des fragments Fab non conjugués.Cela permet de traiter le tissu avec un deuxième anticorps primaire, qui peut être marqué par un anticorps secondaire différent. En fin de compte, les images des sections sont utilisées pour étudier le développement et la régulation des cellules progénitrices neuronales en réponse à des stimuli spécifiques et leur implication dans des fonctions cérébrales particulières. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'immunofluorescence multiple simultanée, est qu'elle évite les problèmes généralement liés à l'utilisation d'anticorps primaires provenant de la même espèce hôte.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse adulte, telles que la prolifération de sous-ensembles de progéniteurs hippocampiques en réponse à des stimuli physiologiques ou pharmacologiques, à des pathologies cérébrales ou au vieillissement. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car le marquage multiple par des anticorps primaires provenant d'une même espèce hôte peut entraîner des activités croisées indésirables entre anticorps en l'absence d'un blocage adéquat. Tout d'abord, peser les animaux à injecter et préparer une solution mère fraîche d'analogues de thymidine à 10 milligrammes par millilitre pour l'injection.Lorsque la solution est prête, préparez une dose ajustée en fonction du poids dans une seringue de précision munie d'une aiguille de calibre 30. Ensuite, immobilisez la souris par le repli de peau du cou et injectez l'analogue de thymidine par voie intrapéritonéale au point temporel souhaité, anesthésiez profondément la souris puis réalisez une perfusion transcardiale. Faites circuler 10 millilitres de PBS glacé, suivis de 40 millilitres de solution fraîche de formaldéhyde glacé.Ensuite, disséquer le cerveau et le fixer dans le même fixateur après la fixation. Incuber les cerveaux recueillis pendant 24 heures dans du saccharose à 10 % à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférer les cerveaux dans du saccharose à 30 % et incuber pendant 48 heures supplémentaires.Avec les cerveaux prêts pour la cryoprotection, les congeler dans de l'isopentane à moins 25 degrés Celsius. Ensuite, utiliser un cryostat pour découper des sections coronales de 40 micromètres destinées à un stockage à long terme. Transférer les sections dans une solution antigel et les conserver à moins 20 degrés Celsius.Commencez par transférer les sections de la solution antigél à l’aide d’un pinceau fin dans le TBS. Rincez soigneusement les sections, en commençant par une incubation de rinçage toute la nuit à quatre degrés Celsius, suivie de cinq rinçages de 10 minutes chacun à température ambiante. Toutes ces incubations doivent être effectuées sous agitation douce et continue.Si l'un des antigènes d'intérêt est un analogue de la thymidine, une étape de dénaturation à l'acide chlorhydrique doit être mise en œuvre à ce stade, suivie d'une étape de neutralisation dans un tampon bore. Poursuivre par la perméabilisation et le blocage des sites de liaison non spécifiques des anticorps dans le TBS plus. Laisser cette incubation se poursuivre pendant une heure à température ambiante, puis incuber dans le premier anticorps primaire dilué dans le TBS plus toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant.Laver les sections trois fois dans le TBS et une fois dans le TBST. Laisser chaque rinçage durer 10 minutes. Puis incuber avec le premier anticorps secondaire marqué au fluorochrome pendant trois heures à température ambiante.À partir de maintenant, protéger les sections contre l'exposition à la lumière. Après une autre série de lavages, transférer les sections dans une solution contenant 10 % de sérum de l'espèce hôte à partir de laquelle ont été obtenus les deux anticorps primaires. Incuber les sections dans cette solution pendant trois heures afin de saturer les paratopes libres du premier anticorps secondaire.Rincez ensuite trois fois dans le TBS et une fois dans le TBST pour éliminer le sérum. Préparez ensuite une solution de TBS additionné de 50 microgrammes par millilitre de fragments Fab monovalents non conjugués dirigés contre l'espèce hôte de l'anticorps primaire. Ceci masque les épitopes qui pourraient autrement être reconnus par le deuxième anticorps secondaire.Transférez les sections dans cette solution et incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, rincez les sections au moins trois fois dans du TBS, puis une fois dans du TBST. Lors des transferts, essuyez les inserts en treillis contenant les sections sur une serviette en papier afin d'éliminer les résidus de fab.Incubez maintenant les sections dans le deuxième anticorps primaire toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après une autre série de lavages, appliquez le deuxième anticorps secondaire pendant trois heures à température ambiante. Lavez enfin les sections trois fois dans le TBS et procédez au montage des sections avec la gélatine.Effectuez un séchage à l'air des lames et montez-les avec un milieu de montage ANTIFA. Observez les coupes marquées par fluorescence au microscope confocal à balayage laser. Acquérez des séries d'images à des positions aléatoires le long de toute l'étendue du gyrus denté avec un grossissement de 400 fois.Analyser au moins 50 cellules d'intérêt sélectionnées aléatoirement par hémisphère pour la co-marquage des différents marqueurs. Pour calculer les nombres absolus de populations cellulaires nouvelles spécifiques, multiplier les pourcentages de cellules co-marquées par les nombres totaux de cellules nouvelles estimés à partir de l'analyse de la coloration DAB. Les méthodes décrites ont été utilisées pour quantifier et caractériser les cellules nouvelles dans l'hippocampe postnatal et adulte d'un cycle déficient en neurogenèse.Le modèle murin invalidé pour D deux, avec une coloration DAB dirigée contre différents marqueurs de prolifération tels que KI 67 ou BRDU, a révélé de manière constante des différences dans le nombre de cellules nouvelles entre les souris de type sauvage et les souris invalidées. Les cellules nouvelles marquées au BRDU pouvaient être caractérisées phénotypiquement à l’aide d’un protocole classique d’immunofluorescence multiple appliquant simultanément des anticorps primaires dirigés contre B-R-D-U-G-F-A-P, nestine, GFP et doublecortine. Cela a permis l’identification réussie de cellules progénitrices de type un, de type deux A, de type deux B et de type trois nouvelles, au sein d’un même spécimen.Alternativement, avec des intervalles de temps plus longs entre l'injection de BRDU et l'euthanasie de l'animal, le nombre final de neurones nouvellement formés pourrait être analysé par une double coloration immunohistochimique BRDU et neuve. Le protocole d'étiquetage immunologique séquentiel fonctionnait parfaitement si les sections étaient d'abord incubées simultanément avec les anticorps anti-KI 67 de lapin, anti-GFP de chèvre et anti-doublecortine de cobaye, puis dans un second temps avec l'anticorps anti-GFAP de lapin, mais pas l'inverse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser jusqu'à quatre antigènes différents sur une même coupe tissulaire en utilisant des anticorps primaires issus de l'hôte identique.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'inclure des contrôles appropriés afin d'éliminer la possibilité d'une réactivité croisée ou de résultats faussement positifs liés à l'anticorps. Tenez compte du fait que l'ordre des incubations avec les anticorps primaires peut fortement influencer le résultat du protocole.

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

La vidéo illustre une méthode de coloration par immunofluorescence utilisée pour examiner la neurogenèse dans l’hippocampe adulte. Initialement, une section de cerveau de souris subit un traitement avec des anticorps primaires dirigés contre les protéines marqueurs associées à la neurogenèse dans les cellules progénitrices neuronales. Ensuite, il est marqué avec des anticorps secondaires marqués avec des fluorophores. La section du cerveau est ensuite observée au microscope confocal pour...

Une technique de coloration par immunofluorescence pour détecter la neurogenèse de l’hippocampe adulte

Cette vidéo montre la procédure de coloration des cellules souches neurales nouvellement proliférées dans des coupes de tissu cérébral à l’aide de l’incorporation d’EdU, suivie d’une immunofluorescence pour visualiser des protéines spécifiques, améliorant ainsi la compréhension de la dynamique cellulaire et de la prolifération.

Coloration par immunofluorescence pour la visualisation de cellules souches neurales proliférées dans des sections de cerveau de souris

La localisation et la distribution des protéines fournissent des informations importantes pour la compréhension de leurs fonctions cellulaires. La résolution spatiale supérieure de la microscopie électronique (EM) peut être utilisé pour déterminer la localisation subcellulaire d'un antigène donné à la suite immunohistochimie. Pour les tissus du système nerveux central (SNC), la préservation de l'intégrité structurelle tout en maintenant antigénicité a été particulièrement difficile en EM études.

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures Slice

Au cours de la neurogenèse de l’hippocampe adulte, un ensemble distinct de marqueurs génétiques est exprimé lorsqu’une cellule souche neurale quiescente progresse séquentiellement et se développe en un neurone fonctionnellement intégré dans le circuit. En utilisant la récupération d’antigènes induite par la chaleur, les types de cellules progénitrices qui sont autrement difficiles à détecter sont identifiés avec une efficacité accrue.

La chaleur induite par un antigène de récupération: une méthode efficace pour détecter et identifier les types de cellules progénitrices adultes au cours de l&#39;hippocampe neurogenèse

Ce protocole de niveau introductif décrit les réactifs, l’équipement et les techniques nécessaires pour réaliser la coloration immunohistochimique du cerveau des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour la microglie et les éléments neuronaux à titre d’exemple.

Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pour étudier le profil d'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Ce protocole peut être appliqué sur les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisée par des déficits cognitifs.

Visualisation immunohistochimique de l&#39;hippocampe Neuron Activité Après l&#39;apprentissage spatial dans un modèle de souris de troubles neurodéveloppementaux

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Le but de ce protocole est de décrire une approche pour analyser le comportement des cellules neurales adultes de tige/progéniteur en réponse à la manipulation chimiogénétique d'un circuit neural local spécifique.

Régulation spécifique du circuit d'analyse des cellules neuronales neuronales hippocampales adultes

Cet article présente quatre des techniques les plus courantes pour visualiser les cellules BrdU positives afin de mesurer la neurogenèse adulte chez le rat. Ce travail comprend des instructions pour la préparation des réactifs, l’administration d’analogues de thymidine, la perfusion transcardique, la préparation tissulaire, la réaction immunohistochimique de la peroxydase, l’immunofluorescence, l’amplification du signal, la contre-coloration, l’imagerie microscopique et l’analyse cellulaire.

Techniques d’immunohistochimie pour analyser la prolifération cellulaire et la neurogenèse chez le rat à l’aide de l’analogue de thymidine BrdU

Ici, le protocole décrit comment effectuer une immunofluorescence à double marquage en utilisant des anticorps primaires élevés chez la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène. En outre, il peut inclure le troisième anticorps d’un hôte différent dans ce protocole. Cette approche peut être faite dans n’importe quel type de cellule et d’agents pathogènes.

Immunofluorescence à double marquage à l’aide d’anticorps de la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène

Présenté ici est une méthode pour séquencer des noyaux uniques isolés du gyrus denté de la souris qui exclut la plupart des neurones par tri des noyaux activés par fluorescence (FAN). Cette approche génère des profils d’expression de haute qualité et facilite l’étude de la plupart des autres types de cellules représentées dans la niche, y compris les populations rares telles que les cellules souches neurales.

Tri négatif des neurones par noyaux activés par fluorescence combiné au séquençage de l’ARN à noyau unique pour étudier la niche neurogène de l’hippocampe

Découvrez une méthode d'immunofluorescence séquentielle pour quantifier toutes les étapes de la neurogenèse adulte dans l'hippocampe. Cette technique contourne les limitations des anticorps de même espèce hôte.

Immunohistochimie et détiquetage multiple avec des anticorps de lespèce hôte mêmes pour létude des adultes hippocampe neurogenèse (Vidéo) | JoVE Journal

Immunohistochimie et d'étiquetage multiple avec des anticorps de l'espèce hôte mêmes pour l'étude des adultes hippocampe neurogenèse

Explorer plus de vidéos