Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle

L’objectif général de l’expérience suivante est d’utiliser diverses approches virologiques et biochimiques pour disséquer le rôle d’une voie de signalisation de l’hôte dans la réplication lytique d’un virus de l’herpès modèle. Ici, à titre d’exemple, nous examinons le rôle de la protéine de signalisation antivirale mitochondriale Mavs lors de l’infection par le virus de l’herpès gamma HV 68. Pour la première fois à examiner le rôle des Mavs lors d’une infection aiguë, des souris de type sauvage et des souris Mavs knockout sont infectées par le gamma HV 68 à la suite d’une infection virale aiguë.

Le poumon de souris est prélevé et les charges virales sont déterminées par un test sur plaque dans lequel les échantillons sont dilués et mis en plaques. Sur les monocouches, le nombre de plaques est alors compté. L’augmentation des charges virales chez les souris knock-out suggère que le gène d’intérêt joue un rôle antiviral.

En revanche, des charges virales réduites chez les souris knock-out indiquent que le gène est nécessaire à l’infection virale pour valider ces résultats. La cinétique de croissance virale en plusieurs étapes in vitro est examinée dans des fibroblastes embryonnaires de souris, de type sauvage et des fibroblastes embryonnaires de souris knock-out. Les cellules sont ensuite prélevées et des tests de plaque sont effectués pour comparer la cinétique de croissance en plusieurs étapes entre les cellules de type sauvage et les cellules déficientes en mavs.

Pour valider davantage ces résultats, les cellules fibroblastiques embryonnaires de souris de type sauvage et mavs knock-out sont infectées par gamma HV 68. Ensuite, l’ADN et l’ARN sont extraits séparément des cellules infectées et les transcrits génomiques viraux sont analysés par PCR en temps réel. Nous avons eu l’idée de ce protocole pour la première fois lorsque nous avons étudié le rôle d’une voie d’immunité de l’hôte lors d’une infection virale.

Ce protocole peut potentiellement être appliqué pour étudier les règles des voies de signalisation de l’hôte pendant l’infection par d’autres agents pathogènes. Commencez cette procédure en laissant des souris de six à huit semaines de sexe identique fabriquées dans une portée de s’acclimater pendant une période de quatre jours après l’expédition. L’expérience suivante sera réalisée dans une installation à risque biologique.

En préparation, enfilez un équipement de protection individuelle comprenant une blouse de laboratoire, des gants, un masque et des chaussons en travaillant dans une armoire de biosécurité. Niveau deux. Préparez la suspension virale avec 40 à 10 000 PFU de gamma HV 68 et 30 microlitres de PBS stérile pour chaque souris qui sera infectée.

Conservez la suspension virale sur de la glace après une injection intrapéritonéale de kétamine Xylazine. Assurez-vous que les souris ont été mises sous sédatif en effectuant un pincement des orteils. Ensuite, à l’aide d’une pipette, déposez 30 microlitres de suspension virale goutte à goutte dans la narine gauche ou droite.

Allongez la souris sur le côté pendant cinq à 10 minutes pour faciliter l’administration du virus dans les poumons par les voies respiratoires. Ensuite, remettez les souris dans leur cage et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies de la sédation. Ensuite, du tissu pulmonaire est prélevé sur les souris injectées pour préparer un lysat cellulaire permettant d’évaluer le titre viral à divers jours après l’infection.

Placez les poumons prélevés sur des souris sacrifiées dans des tubes stériles à bouchon à vis de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de billes de silice de zircone de 1,0 millimètre sur de la glace. Si ce n’est pas le cas, passez à l’étape suivante le même jour. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Sinon, ajoutez un millilitre de DMEM sans sérum froid. Placez le tube dans un batteur à billes et appuyez sur start pour homogénéiser les poumons pendant 30 secondes. Pour éviter une surchauffe de l’échantillon, ce qui pourrait inactiver le virus.

Réfrigérez le tube sur de la glace pendant au moins une minute après 30 secondes d’homogénéisation. Répétez ensuite ce processus. Ensuite, centrifugez le tissu homogénéisé à 16 000 RCF à quatre degrés Celsius pendant une minute.

Suite à la rotation, les débris cellulaires seront au fond du tube et les lipides seront à la surface. Prenez immédiatement le snat comme indiqué ici pour effectuer un test de plaque en utilisant une monocouche NIH trois, T trois ou BHK 21. Ensuite, un test de plaque est effectué Pour déterminer le titre viral présent dans l’échantillon, commencez le test de plaque en effectuant une dilution en série du surnageant viral.

Tout d’abord, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 270 microlitres de média sur une plaque à 96 puits. Laissez la première rangée vide. Ajoutez ensuite 200 microlitres de surnageant à la première rangée de la plaque à 96 puits, chaque échantillon étant en trois exemplaires.

Ensuite, transférez 30 microlitres de l’échantillon de la première rangée à la rangée suivante et mélangez. Transférez ensuite 30 microlitres du mélange dans la rangée suivante et mélangez. Répétez cette étape plusieurs fois pour obtenir des dilutions en série décuplées.

Ensuite, ajoutez le surnageant viral dilué sur la monocouche cellulaire. Dans une plaque à 24 puits. Placez la plaque dans un incubateur et secouez la plaque toutes les 30 minutes pendant une incubation de deux heures après l’incubation pour éliminer les débris cellulaires, aspirez le surnageant de la plaque.

Ensuite, lavez les cellules une fois avec un milieu frais. Après le lavage, ajoutez un milieu contenant de la méthylcellulose aux cellules. Incuber les cellules pendant quatre à six jours.

Après quatre à six jours se sont écoulés. À l’aide d’un microscope, vous pouvez lire le numéro de plaque de chaque échantillon. Notez le nombre de plaques pour chaque dilution.

Calculez ensuite la moyenne et l’écart-type. Les puits contenant trop ou trop peu de plaques ne peuvent pas être utilisés pour calculer avec précision le titre. Donc, pour chaque échantillon, utilisez une dilution dans laquelle il y a sept à 70 plaques.

Cet échantillon dilué 1000 fois présente une moyenne de 23 plaques par puits. Pour calculer le titre viral dans la solution non diluée, multipliez le facteur de dilution par le nombre de plaques par le nombre de microlitres dans un millilitre. Divisez ensuite cela par le volume de surnageant dilué ajouté par puits.

Ainsi, dans cet exemple, 1000 fois 23 plaques fois 1000 microlitres par millilitre divisés par 100 microlitres donnent 2,3 fois 10 puissance 10 formant des unités par millilitre. Ensuite, une solution mère virale avec un titre connu est utilisée pour déterminer la cinétique de croissance du gamma HV 68 dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Les ORM commencent par diviser les mythes de type sauvage et ceux déficients dans un gène hôte en une plaque de 24 puits à 10 000 cellules par puits. Le lendemain, remplacez le fluide dans chaque puits par 0,5 millilitre d’une suspension gamma HV 68 à faible MOI.

Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et laissez l’incubation se poursuivre pendant deux heures tout au long de l’incubation. Secouez l’assiette toutes les 30 minutes après l’incubation. À l’aide d’une pipette, retirez la suspension virale et ajoutez 0,5 millilitre de DM EM complet frais contenant 8 % de sérum fœtal bovin aux cellules infectées par le virus.

Remettez les cellules dans l’incubateur à différents jours après l’infection. Récoltez les cellules de l’extrémité moyenne en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Transférez-les dans des tubes à centrifuger stériles de 1,5 millilitre et congelez-les immédiatement à moins 80 degrés Celsius pour libérer le gamma HV 68 des Mets.

Effectuez trois cycles de congélation et de décongélation. Décongelez les cellules en les plaçant à 37 degrés Celsius. Ensuite, vortex et remettez-les dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Déterminer le titre viral par un test de plaque à l’aide d’une monocouche NIH trois, T trois ou BHK 21, comme indiqué précédemment, pour examiner si la réplication de l’ADN ou de l’ARN est affectée par une déficience des gènes de l’hôte ou des gènes viraux. Commencer avec des mès infectés à différents jours après l’infection, jeter le surnageant, rincer les cellules avec des cellules froides de PBS et de trypsine glaciaire. Ensuite, granulez les cellules par centrification à 1000 RCF à température ambiante pendant une minute après l’essorage, jetez le surnageant et stockez les cellules à moins 80 degrés Celsius.

Extraire l’ADN et l’ARN totaux, qui sont d’origine hôte et virale. Ensuite, centrifugez les colonnes de centrifugation. Effectuez une PCR en temps réel à l’aide de l’ADN total et d’une amorce spécifique pour les transcrits lytiques viraux.

Déterminer la quantité relative du génome gamma HV 68 intracellulaire par rapport à un gène d’entretien de l’hôte tel que la bêta-actine. Préparez l’ADNC avec l’ARN total et l’amorce Oligo DT. Effectuez une PCR en temps réel à l’aide de CD NA et d’amorces comme ci-dessus pour déterminer la quantité relative de transcrits viraux.

En référence à celui de l’hôte, le gène Mavs est l’abréviation de signalisation antivirale mitochondriale, comme le montre ici. La molécule adaptatrice Mavs relaie la signalisation des récepteurs cytosoliques de type œil pour activer NF, kappa B et les facteurs de régulation de l’interféron IRF qui, à leur tour, régulent à la hausse l’expression génique des cytokines et interférons pro-inflammatoires. Les charges virales dans les poumons des souris sauvages infectées par le gamma HV et des souris de portée déficientes en Mavs sont présentées ici.

La carence en Mavs a considérablement réduit les charges virales dans les poumons 10 jours après l’infection, ce qui indique que Mavs est nécessaire pour une infection virale efficace in vivo. Cette figure montre une courbe de croissance virale en plusieurs étapes sur des fibroblastes embryonnaires de souris de type sauvage, et ceux déficients en Mavs déficients chez les Mavs. Des fibroblastes embryonnaires de souris infectés par des fibroblastes embryonnaires de souris ont été analysés par déficit de PCR en temps réel dans Mavs, ce qui a considérablement réduit les niveaux d’ARNm de trois gènes lytiques essentiels.

Tous ces résultats soutiennent collectivement la conclusion selon laquelle Mavs est nécessaire à l’activation de la transcription gamma HV 68 et à la réplication lytique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’interroger l’interaction hôte-pathogène à plusieurs niveaux, à la fois dans VO et Vevo. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes peut être extrêmement hésitant.

Des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent être prises pendant le déroulement des spectacles.