Imagerie en accéléré de la division de cellules souches neurales de souris à l’aide de la microscopie confocale

Prenez une plaque multi-puits contenant des cellules souches neurales ou NSC adhérentes isolées d’un cerveau de souris transgénique. Ces NSC contiennent une protéine marquée par fluorescence qui est spécifique à la première phase de croissance, ou G1.

Lorsque le NSC se divise, il devient fluorescent dans la phase G1 du cycle cellulaire tout en n’émettant aucune fluorescence dans les autres phases.

Placez la plaque dans une chambre d’imagerie confocale de microscope à balayage laser, maintenue à une température contrôlée.

Sélectionnez l’objectif souhaité et ajustez l’intensité de fluorescence.

Configurez les paramètres de l’imagerie en accéléré.

Choisissez l’option grande image et programmez l’acquisition d’images à intervalles réguliers pendant la durée souhaitée.

Utilisez un scanner résonant à grande vitesse pour éviter le photoblanchiment et maintenir une haute résolution.

Utilisez le paramètre de fond clair pour visualiser la forme de la cellule et utilisez un filtre fluorescent approprié pour capturer la fluorescence.

Démarrez l’imagerie en accéléré du NSC pour visualiser les différentes phases du cycle cellulaire.

Préparez un microscope confocal à balayage laser pour l’imagerie en préchauffant la chambre de contrôle de la température à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. Positionnez la plaque à 96 puits à l’intérieur de la chambre du microscope préchauffé et faites la mise au point sur le premier puits. Ensuite, ouvrez le logiciel d’imagerie et faites un clic droit dans la fenêtre principale pour sélectionner Acquérir les commandes d’acquisition et la désacquisition afin d’ouvrir le TI Pad et de sélectionner le plan Objectif Apo VC 20x DIC.

Ensuite, cliquez sur Acquérir les commandes d’acquisition, puis ouvrez les options de time-lapse. Définissez le centre de chaque puits comme position de scène et sélectionnez l’option Grande image sur 7 x 7 millimètres carrés. Observez une image en mosaïque autour du centre de chaque puits. Réglez le chevauchement de la grande image en mosaïque sur 5 % et réglez la fréquence de sorte que les photos soient prises toutes les 20 minutes pendant 24 heures.

Sous les paramètres A1 plus, sélectionnez le niveau de tension du tube photomultiplicateur pour chaque fluorescence répertoriée dans la barre de menus. Sélectionnez cette option pour acquérir des images à l’aide d’un scanner résonant haute vitesse au format 512 x 512 pixels, et utilisez DIC pour visualiser les cellules. Ensuite, sélectionnez le dossier dans lequel vous souhaitez enregistrer les fichiers de données. Sélectionnez le bouton Exécuter maintenant dans la fenêtre d’acquisition ND pour commencer l’acquisition.