Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer l'imagerie et l'analyse de la mitose des progéniteurs neuronaux dans des tranches de cerveau de souris vivantes. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant les cerveaux d'embryons. La deuxième étape consiste à préparer des tranches de cerveau à l'aide d'un vibratome.

Ensuite, l'imagerie en direct de tranches cérébrales est réalisée. La dernière étape consiste à extraire des informations à partir des vidéos afin d'analyser les paramètres d'intérêt relatifs à la mitose. En définitive, la microscopie en temps réel permet de montrer comment les populations de cellules progénitrices du cerveau se divisent en temps réel.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse sur tissu fixé, réside dans la possibilité d'obtenir des informations précieuses sur la dynamique temporelle de la division des progéniteurs neuronaux dans des tranches cérébrales vivantes. Elle peut également servir à comprendre comment des perturbations génétiques peuvent influencer la division des progéniteurs neuronaux. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier le développement cortical, l'analyse que nous avons décrite peut être appliquée à l'étude de la mitose des cellules souches dans d'autres régions du cerveau ou même en dehors du cerveau.

La démonstration de cette procédure sera assurée par Louis y, chercheur postdoctoral de mon laboratoire. Commencez cette procédure en prélevant les embryons de souris et en disséquant les cerveaux embryonnaires, y compris les cerveaux postérieurs et les quatre cerveaux avec les deux hémisphères cérébraux. Dans un récipient rempli de glace, percez un trou dans la glace destiné aux moules d'encapsulation.

Ensuite, verser le milieu aros à 3 % dans un moule en plastique et placer ce moule dans le trou de la glace. Agiter le milieu aros avec l'extrémité d'un thermomètre numérique jusqu'à ce que la température atteigne 35 degrés Celsius. Puis transférer rapidement le cerveau dans le milieu d'encapsulation afin d'éliminer l'excès de HBSS à l'interface entre le cerveau et le milieu aros.

Faites tourner délicatement et soigneusement le cerveau plusieurs fois dans la solution d'inclusion. À l'aide de la pince, un coussin de gélose gélifiée se formera au fond du moule, en contact avec la glace. Une fois que ce coussin est perceptible au bout de la pince lors du mélange, positionnez le cerveau avec la face dorsale vers le haut ; le cerveau ne doit pas couler jusqu'au fond du moule.

Laisser durcir les aros dans la glace pendant au moins cinq minutes avant de couper les coins du moule avec une lame de rasoir. Tailler soigneusement un bloc d'aros autour du cerveau en essayant de minimiser le nombre de coupes afin d'éviter de perturber le cerveau inclus. À l’aide du VT 1000 s Viome, produire des tranches de 200 à 250 microns.

Étendez maintenant le cyto 11 à une concentration finale de 0,5 à un micromolaire dans le milieu de culture de tranches supplémenté en facteurs de croissance et incubez les tranches provenant d'un cerveau dans une plaque de 12 puits avec 2,5 millilitres de la solution de marquage par puits pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lavez ensuite les tranches dans 2,5 millilitres de milieu de culture de tranches dépourvu de solution de marquage pendant 20 minutes. Pour monter les sections cérébrales, déposez une goutte de solution de collagène au fond d'une boîte micropuits de 35 millimètres à fond en verre.

Étalez-le à l’aide d’une pointe de pipette pour qu’il ait la même taille que la tranche. Ensuite, transférez une tranche dans une goutte de collagène. Laissez les tranches incuber à température ambiante pendant 10 minutes avant de les transférer dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 20 minutes, ajouter au total 1,2 millilitre de milieu de culture de tranches dans la microplaque à fond en verre, en versant 600 microlitres de milieu à la fois et en l’étalant à l’aide d’une pipette. Laisser les tranches se rétablir dans l’incubateur pendant au moins une heure et 30 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, avant de les transférer dans la chambre d’incubation du microscope confocal à disque rotatif, dans les mêmes conditions. Pour l’imagerie en temps réel, utiliser un objectif à immersion en huile de silice de 60 x, avec une distance de travail de 300 microns et une ouverture numérique de 1,3.

Pour l’imagerie cellulaire, les cellules sont capturées dans un empilement Z de 30 microns, dont le centre se situe à environ 40 microns sous la surface de la tranche. Si nécessaire, ajustez la puissance du laser et les temps d’exposition afin de limiter la photodégradation, en utilisant des durées d’exposition comprises entre 30 et 200 millisecondes, selon l’intensité du signal de cyto 11. Voici un exemple de données que l’on peut obtenir grâce à cette analyse pour identifier les figures mitotiques dans ImageJ. Après avoir ouvert le jeu de données pour une position sous forme d’empilement hyper, sélectionnez un plan Z où les tissus et les cellules semblent sains.

Revenez en arrière dans le temps pour identifier le moment où la cellule entre en mitose. La cellule peut se déplacer à travers les plans Z, mais la résolution temporelle et les paramètres de Zack décrits précédemment ont été optimisés pour permettre ce processus. Dans un tableur, enregistrez les quatre coordonnées D de la cellule dans la pile hyperstack au moment où elle entre en mitose.

Connaître ces coordonnées permettra d'éviter de compter plusieurs fois la même cellule. Avancez dans le temps et enregistrez l'instant où la cellule passe d'une phase à une autre. Documentez la durée de chaque phase mitotique pour une cellule donnée afin de réaliser une reconstruction 3D des cellules et de quantifier la rotation pendant la métaphase.

Une fois plusieurs cellules en mitose identifiées, utilisez les coordonnées d'une cellule et faites défiler vers l'avant dans le temps jusqu'au début. En métaphase, faites pivoter l'ensemble du hyper stack de manière à ce que la bordure ventriculaire soit plane. Utilisez l'outil d'angle pour déterminer l'angle à appliquer pour cette rotation.

Identifier le plan Z dans lequel la cellule d'intérêt est la plus visible dans ce plan. Utiliser l'outil de sélection rectangulaire pour dessiner une sélection incluant toute la cellule. Ensuite, identifier les plans Z qui incluent la cellule d'intérêt et utiliser la commande de duplication d'image pour créer une sous-pile.

Dans la boîte de dialogue, laissez l'option de duplication de la pile hyper activée pour les coupes. Le paramètre Z correspond aux plans Z, incluant toute la cellule, et le paramètre T aux cadres correspond à l'instant temporel courant. Ensuite, générez une reconstruction 3D de la cellule.

À ce moment précis. L'espacement des tranches correspond à l'intervalle entre chaque image du plan Z, exprimé en micromètres. À l'aide de la barre de défilement, faites pivoter la reconstruction 3D obtenue de manière à rendre le bord de la plaque métaphasique visible.

Le nombre de la trame correspond à l'angle bêta. Enregistrez ce nombre. Puis mesurez l'angle entre l'horizontale et les alignements bys.

Disséquer la plaque métaphasique perpendiculairement. Il s'agit de l'enregistrement de l'angle alpha. Ces angles pour tous les points temporels en métaphase de la cellule d'intérêt.

L'angle de rotation entre les points temporels t et t moins un est égal à la valeur absolue de la différence entre un angle à t et cet angle à T moins un, selon l'axe dorso-ventral. La mitose est plus facilement observée dans les régions dorsales des tranches de cerveau, car le processus basal des R GCs est plus court et est donc moins susceptible d'être sectionné par un viome. Le long de l'axe ROS coddle, les tranches provenant des régions coddle du cortex dorsal fournissent les résultats les plus reproductibles.

Voici des exemples de région appropriée et de région inappropriée pour l'imagerie. Dans une région appropriée, les noyaux ont une forme elliptique et de nombreuses cellules en mitose sont observées à la bordure du ventricule avant l'acquisition d'images en temps-lapsé. Dans une région inappropriée, très peu de cellules en mitose sont observées à la bordure du ventricule et les noyaux sont de forme ronde.

Voici un exemple de bon coupe observé avec un microscope à faible grossissement avant l'imagerie en direct, et voici quelques exemples de cellules marquées avec cyto 11 dans différentes phases de la mitose. On voit ici un montage d'une région située à la limite du ventricule, où deux progéniteurs neuronaux traversent les différentes phases de la mitose, marquées en couleurs différentes suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme l'électroporation neutre de constructions d'ADN, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, notamment quelle est la destinée des cellules en division et comment se comporte le cytosquelette ?

Il est également préférable d'utiliser des méthodes secondaires autres que CY 11 pour suivre la mitose, comme les souris transgéniques H two VGFP. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de manipuler les tranches de cerveau, des paramètres d'appariement les plus adaptés, ainsi que de l'analyse des données.