Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer l’imagerie et l’analyse de la mitose progénitrice neurale dans des tranches de cerveau de souris vivantes. Ceci est accompli en disséquant d’abord les cerveaux des embryons. La deuxième étape consiste à préparer des tranches de cerveau avec un vibrato.

Ensuite, l’imagerie en direct des tranches de cerveau est effectuée. La dernière étape consiste à extraire des informations des films pour analyser les paramètres de mitose d’intérêt. En fin de compte, la microscopie time-lapse est utilisée pour montrer comment les populations progénitrices du cerveau se divisent en temps réel.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’analyse fixe, est que l’on peut obtenir un aperçu significatif de la dynamique temporelle de la division des neuroprogéniteurs dans des tranches de cerveau vivantes. Il peut également être utilisé pour comprendre comment les perturbations génétiques peuvent influencer la division des neuroprogéniteurs. Bien que nous utilisions cette méthode pour comprendre le développement cortical, l’analyse que nous avons décrite peut être appliquée à l’étude de la mitose des cellules souches dans d’autres régions du cerveau ou même en dehors du cerveau.

La démonstration de cette procédure sera assurée par Louis Y, un post-doctorant de mon laboratoire. Commencez cette procédure en prélevant les embryons de souris et disséquez les cerveaux embryonnaires, y compris les cerveaux postérieurs et les quatre cerveaux avec les deux hémisphères cérébraux. Dans un seau de glace, créez un trou dans la glace pour l’enrobage des moules.

Ensuite, versez 3 % aros de milieu dans un moule en plastique et placez ce moule dans le trou dans la glace. Mélangez l’aros medium avec la pointe d’un thermomètre numérique jusqu’à ce que la température atteigne 35 degrés Celsius. Ensuite, transférez rapidement le cerveau dans le milieu d’enrobage pour éliminer l’excès de HBSS à l’interface entre le cerveau et l’aros.

Faites pivoter le cerveau avec précaution et douceur à plusieurs reprises dans la solution d’enrobage. A l’aide de la pince, un coussin d’aros gélifiés va se former au fond du moule au contact de la glace. Une fois que le coussin peut être palpé avec la pointe de la pince tout en remuant le cerveau, positionnez le cerveau avec le côté dorsal vers le haut, le cerveau ne doit pas couler tout au fond du moule.

Laissez les aros durcir dans la glace pendant au moins cinq minutes avant de couper les coins du moule avec une lame de rasoir. Sculptez soigneusement un bloc aros autour du cerveau et essayez de minimiser le nombre de coupures pour éviter de perturber le cerveau intégré. Avec le VT 1000 s Viome, générez des tranches de 200 à 250 microns.

Diluez maintenant le cyto 11 jusqu’à une concentration finale de 0,5 à une micromolaire dans le milieu de culture en tranches, complété par des facteurs de croissance et une plaque à 12 puits, incubez des tranches d’un cerveau dans 2,5 millilitres de la solution de coloration dans chaque puits pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lavez ensuite les tranches dans 2,5 millilitres de milieu de culture de tranches sans solution de coloration pendant 20 minutes. Pour monter les sections cérébrales, placez une goutte de solution de collagène au fond d’une parabole à micropuits à fond de verre de 35 millimètres.

Étalez-le avec une pointe de pipette pour correspondre à la taille de la tranche. Transférez ensuite une tranche dans une goutte de collagène. Laissez les tranches incuber à température ambiante pendant 10 minutes avant de les transférer dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 20 minutes à un total de 1,2 millilitres de milieu de culture en tranches dans le micro à fond en verre, bien répartissez 600 microlitres de milieu à la fois et étalez-le avec une pointe de pipette. Laissez les tranches récupérer dans l’incubateur pendant au moins une heure et 30 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone avant de les transférer dans la chambre d’incubation du microscope confocal à disque rotatif dans les mêmes conditions. En ce qui concerne l’imagerie en direct, utilisez un objectif à huile de silicium 60x avec une distance de travail de 300 microns et une ouverture numérique de 1,3.

Pour l’imagerie cellulaire, les cellules se trouvent dans une pile Z de 30 microns avec le centre de la pile Z, situé à environ 40 microns sous la surface de la tranche. Si nécessaire, ajustez la puissance du laser et les temps d’exposition pour limiter le photoblanchiment et utilisez le temps d’exposition allant de 30 à 200 millisecondes en fonction de l’intensité du signal cyto 11. Voici des données représentatives que l’on peut obtenir à partir de cette analyse pour identifier les figures mitotiques dans l’image J.Après avoir ouvert l’ensemble de données pour une position en tant qu’hyper empilement, sélectionnez un plan Z où le tissu et les cellules semblent sains.

Faites défiler dans le temps pour identifier le moment où la cellule entre en mitose. La cellule peut se déplacer sur des plans Z, mais la résolution temporelle et les paramètres Zack décrits précédemment ont été optimisés pour permettre ce processus. Dans une feuille de calcul, notez les quatre coordonnées D de la cellule dans l’hyperpile lorsqu’elle entre en mitose.

Connaître ces coordonnées évitera de compter plusieurs fois la même cellule. Faites défiler vers l’avant dans le temps et enregistrez le temps pendant lequel la cellule progresse d’une phase à une autre. Documenter la durée de chaque phase mitotique pour une cellule donnée afin d’effectuer une reconstruction 3D des cellules et une quantification de la rotation pendant la métaphase.

Une fois que plusieurs cellules mitotiques ont été identifiées, utilisez les coordonnées d’une cellule et faites défiler vers l’avant dans le temps jusqu’au début. La métaphase fait pivoter l’ensemble de l’hyper-pile de sorte que le bord ventriculaire soit plus plat. Utilisez l’outil d’angle pour déterminer l’angle à appliquer pour cette rotation.

Identifiez le plan Z où la cellule d’intérêt est la plus visible dans ce plan. Utilisez l’outil de sélection rectangulaire pour dessiner une sélection qui inclut la cellule entière. Identifiez ensuite les plans Z qui incluent la cellule d’intérêt et utilisez la commande image duplicate pour créer une sous-pile.

Dans la boîte de dialogue, laissez l’hyper pile en double cochée sur les tranches. Le paramètre Z correspond aux plans Z, y compris la cellule entière et le paramètre T des images correspond au point temporel actuel. Après cela, générez une reconstruction 3D de la cellule.

Au point temporel actuel. L’espacement des tranches correspond à l’intervalle entre chacune des images du plan Z en microns. À l’aide de la barre de défilement, faites pivoter la reconstruction 3D résultante de sorte que le bord de la plaque de métaphase soit visible.

Le numéro du cadre correspond à l’angle bêta. Notez ce numéro. Mesurez ensuite l’angle entre l’horizontale et alignez-la par.

Dissection perpendiculaire de la plaque de métaphase. Il s’agit de l’enregistrement alpha de l’angle. Ces angles pour tous les points temporels de métaphase de la cellule d’intérêt.

L’angle de rotation entre les points temporels t et t moins un est égal à la valeur absolue de la différence entre un angle en t et cet angle en T moins un le long de l’axe ventral dorsal. La mitose est plus facilement imagée dans les régions dorsales des tranches de cerveau, car le processus basal des R GC est plus court et donc moins susceptible d’être sectionné par un viome. Le long de l’axe du coddle ROS, les coupes dans les régions du coddle du cortex dorsal donnent les résultats les plus cohérents.

Ce sont des exemples d’une bonne région et d’une mauvaise région pour l’imagerie. Dans une bonne région. Les noyaux sont de forme elliptique et de nombreuses cellules mitotiques sont observées au bord du ventricule avant l’imagerie en accéléré dans une mauvaise région, très peu de cellules mitotiques sont observées au bord du ventricule et les noyaux sont ronds.

Voici un exemple d’une bonne coupe observée avec un microscope à faible grossissement avant l’imagerie en direct, et voici quelques exemples de cellules marquées au cyto 11 dans différentes phases de la mitose. Voici un montage d’une région à la limite du ventricule où deux progéniteurs neuronaux passent par les différentes phases de la mitose marquées de différentes couleurs à la suite de cette procédure. D’autres méthodes, comme l’électroporation neutre des constructions d’ADN, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, notamment quel est le devenir des cellules en division et comment se comporte le cytosquelette ?

Il est également préférable d’utiliser des méthodes secondaires au-delà de CY 11 pour suivre la mitose, telles que les souris transgéniques H two VGFP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler les tranches de cerveau, des paramètres de correspondance qui sont les meilleurs et de la façon d’analyser les données.