Name: Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct de la mitose des progéniteurs neuronaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires. Cette méthode permet d'observer la dynamique temporelle des divisions cellulaires en temps réel.

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Les auteurs reconnaissent financement du NINDS / NIH, R00-NS064197 et NINDS / NIH, R01NS083897 (à la fois pour DLS).

1. Préparation des milieux (figure 1, étape 1) <ol><li> Tranche milieu de culture <ol><li> 25 ml de milieu de culture de la tranche est suffisante pour préparer des plats de fond 5 de verre avec deux tranches par puits. </li><li> Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 250 ul d&#39;une solution de N2 100x et 500 ul d&#39;une solution 50x B27 sans vitamine A. Ajouter DMEM/F12 à un volume de 22,5 ml. </li><li> Stériliser par filtration, puis ajouter une solution de 1,25 ml de sérum de cheval inactivé à la chaleur et de 1,25 ml de sérum de veau fœtal. </li><li> Incuber la solution dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant la durée de la préparation des tranches. </li><li> Ajouter facteurs de croissance (FGF, l&#39;EGF et la concentration finale de 10 ng / ml et 20 ng / ml, respectivement) immédiatement avant le début de la culture. La composition de ce milieu a été optimisé pour favoriser la survie des cellules en culture et d&#39;augmenter le taux de prolifération de cellules progénitrices neurales. Ce sera donc maximiser la probabilité deobserver les cellules en mitose dans la tranche. </li></ol></li><li> Plein HBSS Dissection Solution <ol><li> Préparer 500 ml de HBSS complet en ajoutant 50 ml de HBSS 10x, 1,25 ml de 1 M Hepes (pH 7,4, 2,5 mM FC), 6 ml de 2,5 M D-glucose (FC 30 mM), 2,2 ml de 0,9 M NaHCO3 (FC 4 mM) et autoclavé diH 2 O à volume final de 500 ml. </li><li> Solution filtre à stériliser et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que la collection de cornes utérines de la souris enceinte. Cette solution peut être conservée à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li><li> Gardez HBSS sur la glace pendant toute la procédure de dissection. </li></ol></li><li> Solution Intégration <ol><li> Pour l&#39;encastrement de 4 cerveaux embryonnaires, de préparer 30 ml de 3% d&#39;agarose à faible point de fusion dans la solution HBSS complet. Dans un tube de 50 ml conique, ajouter 0,9 g de bas point de fusion d&#39;agarose et plein HBSS à 30 ml. </li><li> Mélanger la solution avec un vortex, et faites le fondre au micro-ondes avec la position du tube et le bouchon ouvert. </li><li> Alors que dans le micro-ondes, surveiller la solution de pdébordement revent due à ébullition excessive. Lorsque l&#39;ébullition commence, arrêter le four micro-ondes et vortex la solution. </li><li> Répétez ces étapes jusqu&#39;à ce que tout l&#39;agarose a fondu. </li><li> Stocker le tube dans un bain-marie à 42 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Dissection du embryons (Figure 1, étape 2) <ol><li> Après euthanasie attention de la souris enceinte, recueillir les cornes utérines et les transférer dans un plat de 10 cm 2 de Pétri contenant plein froid 1x HBSS. L&#39;âge de l&#39;embryon peut varier en fonction de l&#39;étude. Ce protocole a été utilisé avec succès pour la culture des tranches de cerveau de jours embryonnaires E12.5 E17.5 à. En raison de leur taille, les jeunes cerveaux ont tendance à être plus difficile de travailler avec. </li><li> Recueillir les embryons et disséquer les cerveaux embryonnaires tels que décrits précédemment chez le rat et la souris 26,27, jusqu&#39;à ce qu&#39;un cerveau embryonnaire complet, y compris le cerveau postérieur et le cerveau antérieur avec les deux hémisphères cérébraux est obtenu. Ceux-ci peuvent êtreconservé à température ambiante jusqu&#39;à ce que tous les cerveaux ont été disséqués. </li><li> Recueillir les embryons et disséquer les cerveaux embryonnaires tels que décrits précédemment chez le rat et la souris 26,27, jusqu&#39;à ce qu&#39;un cerveau embryonnaire complet, y compris le cerveau postérieur et le cerveau antérieur avec les deux hémisphères cérébraux est obtenu. Ceux-ci peuvent être conservés à température ambiante jusqu&#39;à ce que tous les cerveaux ont été disséqués. </li></ol> 3. Incorporation des cerveaux embryonnaires (Figure 1, étape 3) <ol><li> Dans un seau contenant de la glace, créer un trou dans la glace pour insérer les moules d&#39;inclusion dans. </li><li> Verser le milieu d&#39;agarose à 3% dans un moule plastique et placer ce moule dans le trou préparé dans la glace. </li><li> On agite le milieu d&#39;agarose avec la pointe d&#39;un thermomètre numérique jusqu&#39;à ce que la température atteigne 35 ° C. </li><li> Rapidement transférer le cerveau dans le milieu d&#39;inclusion. </li><li> Étape: Pour éliminer l&#39;excès de HBSS à l&#39;interface entre le cerveau et l&#39;agarose, avec soin et sèche doucement / faire tourner le cerveau à plusieurs reprisesdans la solution d&#39;enrobage avec la pince. </li><li> Un coussin d&#39;agarose gélifié se forme au fond du moule en contact avec la glace. Une fois le coussin peut se faire sentir avec le bout de la pince tout en agitant le cerveau, positionner le cerveau avec la dorsale vers le haut. Le cerveau ne doit pas couler au fond de la moule. </li></ol> 4. Préparation du bloc d&#39;agarose (figure 1, étape 4) <ol><li> Laissez le agarose durcir dans la glace pendant au moins 5 min. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, la section des coins du moule. </li><li> Tailler soigneusement un bloc d&#39;agarose autour du cerveau en utilisant une lame de rasoir. Essayez de réduire le nombre de coupures pour éviter de perturber le cerveau intégré. </li><li> Assurez-vous que le bloc a une plus grande surface dans la région caudale du cerveau (par rapport à la région rostrale, voir la figure 1, étape 4) pour augmenter la stabilité du bloc sur le socle de sectionnement. </li><li> La dernière coupe doit être celui sur le côté caudal de cerveau;cette coupe définira le plan de découpe correcte avec le vibratome. </li><li> Faire en alignant la lame perpendiculaire à l&#39;axe rostro-caudale du cerveau et le bloc d&#39;agarose. Faites glisser la lame caudale long de l&#39;axe rostro-caudale et faire le montage final d&#39;environ 5 mm de la région la plus caudale du cerveau. </li><li> Réglez le bloc d&#39;agarose / cerveau de côté et répétez l&#39;incorporation d&#39;autres cerveaux. </li></ol> 5. Transfert des cerveaux embarqués dans le bac de la Vibratome (Figure 1, étape 5) <ol><li> Ajouter une goutte de colle sur le fond du plateau de vibratome. Placer la colle de sorte que les blocs d&#39;agarose sont positionnées à l&#39;intérieur de la portée de la lame vibrante. </li><li> Placez le côté caudal bloc d&#39;agarose / cerveau vers le bas sur le bord de la spatule, avec environ 50% de la bascule de bloc sur le bord de la spatule. </li><li> Appliquer la face caudale du bloc d&#39;agarose pour la colle et le faire glisser la spatule à une distance, en maintenant le bloc d&#39;agarose à la partie inférieure du plateau avec la shoulder d&#39;une paire de pinces. Ne laissez pas la spatule contacter directement la colle. </li><li> Laissez la colle se solidifier à la température ambiante pendant 5 min. </li></ol> 6. Sectionnement des cerveaux embarqués (Figure 1, étape 6) <ol><li> Remplissez le bac à vibratome avec HBSS. </li><li> Définir les positions de départ et d&#39;arrivée de la lame de vibratome. </li><li> Générer de 200 à 250 um tranches. Avec la vibratome VT1000S, utilisez les paramètres suivants: vitesse de 2 - 4, 8 fréquences. </li><li> Retirez délicatement les tranches de la vibratome comme ils sont coupés. Transférer les tranches avec une spatule et l&#39;extrémité arrière de pince à épiler dans 12 plats et remplis de plein HBSS. Sinon certains chercheurs ont utilisé un pinceau en lieu et place de pinces Point clé:. Pendant le transfert, veiller à ce que les tranches de cerveau restent attachés à la gélose environnante. </li></ol> 7. Syto11 coloration des tranches (Figure 1, étape 7) <ol><li> Diluer Syto11 à une concentration finale de0,5 à 1 uM dans du milieu de culture de tranche complétées par des facteurs de croissance. </li><li> Dans le puits d&#39;une plaque à 12 puits, incuber les tranches de cerveau dans une 2,5 ml de la solution de coloration pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Laver les tranches dans 2,5 ml de milieu de culture de tranche sans solution de coloration pendant 20 min. </li></ol> 8. Montage de la de tranches dans un plat à fond de verre (figure 1, les étapes 8, 9) <ol><li> Préparer 15 pi de l&#39;intégration solution de collagène par tranche. Préparer une solution à 1,5 mg / ml de collagène en mélangeant 375 ul de 3 mg / ml de solution de collagène de type I avec 75 ul de DMEM 10x, 9,4 pi de NaOH 1 M et 290 ul de H 2 O. Stocker sur la glace. </li><li> Placer une goutte de 15 ul de la solution de collagène en bas d&#39;un fond en verre de 35 mm de micropuits vaisselle. Etalez avec une pointe de pipette pour correspondre à la taille de la tranche. </li><li> Transférer la tranche dans la goutte de collagène avec une spatule et pince Point clé:. Montage de plusieurs tranches de différerplats de rentes augmente la probabilité d&#39;acquérir tranches appropriés pour l&#39;imagerie. Écran à travers différentes tranches et sélectionner celles qui répondent le mieux aux critères décrits ci-dessous dans la section «Les résultats représentatifs&quot;. </li><li> Laissez les tranches incuber à température ambiante pendant 10 min avant de les transférer dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Après 20 min, ajouter 1,2 ml de milieu de culture de tranche dans le fond plat en verre Microwell. Ajouter 600 ul de milieu à la fois et l&#39;étaler avec une pointe de pipette. </li><li> Capturer une image à faible grossissement de la tranche de cerveau pour enregistrer le niveau anatomique et l&#39;intégrité de la tranche. </li></ol> 9. Imagerie en direct de la tranches (figure 1, les étapes 10, 11) <ol><li> Laissez les tranches de récupérer dans l&#39;incubateur pendant au moins 1 heure et 30 minutes à 37 ° C avec 5% de CO 2 avant l&#39;imagerie en direct. </li><li> Image les tranches avec le microscope de choix, en gardant à l&#39;esprit que Syto11 est très sujette au photoblanchiment. Voici une inversionted disque en rotation microscope confocal est utilisé (Andor XD révolution disque rotatif microscope confocal). En variante, un microscope confocal à balayage laser peut être utilisé. Les paramètres suivants sont pour le microscope à disque en rotation mis en place. </li><li> Durant toute la session d&#39;imagerie en temps réel, de maintenir les tranches à 37 ° C, 5% CO 2 dans une chambre d&#39;incubation humidifié fixée au microscope. </li><li> les cellules d&#39;image avec un objectif 60X de silicium à l&#39;huile avec une distance de travail de 300 um, et une ouverture numérique de 1,3 (pour des exemples, voir figures 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Un objectif de l&#39;huile 100X avec une distance de travail de 130 um et une ouverture numérique de 1,4 (voir par exemple la figure 4C) peut également être utilisé. La résolution de la caméra est de 512 x 512. </li><li> L&#39;image des cellules dans un 30 um z-pile, avec le centre de la z-pile située à environ 40 um sous la surface de la tranche. Essayer de l&#39;image profondément dans les tissus peut causer l&#39;objectif d&#39;ajouterune pression mécanique sur la tranche. Cela peut affecter l&#39;intégrité de la tranche de cerveau. Si la planification de faire des reconstitutions en 3D des cellules, utilisez un z-intervalle de pas plus de 2 um. </li><li> Régler la puissance du laser et le temps d&#39;exposition afin de limiter le photoblanchiment. Utiliser des temps d&#39;exposition allant de 30 à 200 ms, en fonction de l&#39;intensité du signal Syto11. </li><li> Avec une platine motorisée, une image de plusieurs positions sur plusieurs tranches montés dans une boîte. Par exemple, l&#39;image jusqu&#39;à 20 postes répartis sur 4 tranches différentes dans 1 seul plat. </li><li> Pour l&#39;imagerie en temps réel, utilisez une résolution temporelle inférieure à 5 min pour permettre l&#39;identification des différentes phases de la mitose. Utilisation Syto11 et / ou histone H2B-EGFP, le 4 - 5 heures de l&#39;imagerie en direct sont suffisantes pour observer un nombre important de cellules en mitose. Toutefois, si l&#39;imagerie peu marqué les cellules en mitose (tels que ceux obtenus par électroporation in utero), alors un paramètre plus imagerie (la nuit) est appropriée et fonctionne, nousll. Remarque: En utilisant ce protocole, nous observons généralement en moyenne 10 cellules en mitose par position. Comme indiqué plus haut, l&#39;imagerie multiple monté tranches augmente la probabilité d&#39;avoir une expérience réussie. Avec cette approche, nous identifions généralement les cellules en mitose dans pratiquement toutes les expériences réalisées avec Syto11 ou histone H2B-EGFP. </li></ol> 10. Post-acquisition Analyse de la mitose (Figure 2) Toutes les procédures de cette section ont été optimisés à Fidji (ImageJ), ce qui est avantageux, car il est un logiciel libre et open source. Autres solutions logicielles sont disponibles pour effectuer les mêmes tâches, telles que Metamorph, Imaris, et Amira. <ol><li> Identification des mitotique Chiffres à Fidji <ol><li> Après l&#39;ouverture de l&#39;ensemble de données pour une position de &quot;HyperStack&quot;, sélectionnez un plan z (voir la figure 2A pour l&#39;emplacement de la barre de défilement) où le tissu et les cellules semblent en bonne santé (voir les critères dans la section de discussion).Faites défiler à travers la dimension temporelle pour identifier les cellules en passant par l&#39;anaphase, car il est le plus facile de phase mitotique à identifier. </li><li> Retour dans le temps pour identifier le point de temps où la cellule entre la mitose (condensation de l&#39;ADN). La cellule peut se déplacer à travers z-avions, mais la résolution temporelle et les paramètres z-stack décrits précédemment ont été optimisés pour permettre à ce processus. </li><li> Dans une feuille de calcul, enregistrent leurs coordonnées en 4D de la cellule dans le HyperStack (X, Y, Z et l&#39;heure, voir la figure 2A pour visualiser l&#39;emplacement de ces chiffres dans l&#39;interface Fidji) à son entrée dans la mitose. La connaissance de ces coordonnées empêchera compter de la même cellule à plusieurs reprises. </li><li> Défiler vers l&#39;avant dans le temps et d&#39;enregistrer le moment où la cellule progresse d&#39;une phase à l&#39;autre. Documenter la durée de chaque phase mitotique pour une cellule donnée. </li><li> Procéder à d&#39;autres cellules, à travers l&#39;ensemble de données complet (plusieurs cellules à l&#39;intérieur et à travers les positions). </li></ol></li><li> 3D Reconstructionion des cellules et quantification de rotation durant la métaphase (Adapté de Haydar et al, 2003) (Figure 2B). <ol><li> Après avoir identifié plusieurs cellules en mitose, utiliser les coordonnées d&#39;une cellule et avancez dans le temps jusqu&#39;à ce que le début de la métaphase. </li><li> Tourner l&#39;ensemble &quot;HyperStack&quot; de sorte que la frontière ventriculaire est plane (en utilisant le &quot;Image / Transformation / Rotation ...&quot; commande). Utilisez l&#39;outil &quot;angle&quot; pour déterminer l&#39;angle d&#39;appliquer cette rotation. </li><li> Identifier le plan z où la cellule d&#39;intérêt est le plus visible. Dans ce plan, utilisez l&#39;outil &quot;Rectangle de sélection&quot; pour dessiner une sélection qui comprend l&#39;ensemble de la cellule. </li><li> Identifier les z-plans qui comprennent la cellule d&#39;intérêt. Utilisez la commande &quot;Image / Dupliquer&quot; pour créer un &quot;sous-pile&quot;. Dans la boîte de dialogue, laissez &quot;HyperStack Dupliquer&quot; cochée. Le &quot;tranches (z)&quot; paramètre correspond à la z-plans contenant l&#39;ensemble CEll, et les «Cadres (t)&quot; paramètre correspond à l&#39;instant présent. </li><li> Si la résolution est faible, augmenter la taille de la &quot;sous-pile&quot; en utilisant le &quot;Image / Réglage / Taille ...&quot; commande. </li><li> Générer une reconstruction 3D de la cellule au point d&#39;heure à l&#39;aide du &quot;projet de Image/Stacks/3D ...&quot; commande. Les paramètres de cette commande sont affichés dans la figure 2B. La &quot;tranche espacement&quot; correspond à l&#39;intervalle entre chacune des images planes z-(um). Important: assurez-vous que la dimension physique (um) de la sous-pile a été conservée. Si non, l&#39;interpolation des pixels dans la dimension z sera incorrecte, et la reconstruction 3D sera inexacte. </li><li> Utilisation de la barre de défilement, faire tourner la reconstruction 3D résultant de telle sorte que le bord de la plaque métaphasique est visible. Le numéro de la trame correspond à l&#39;angle bêta est décrit sur ​​la figure 3B, enregistrer ce numéro. Utilisationl&#39;outil «angle» et «Analyse / Mesure ...&quot; commande, mesurer l&#39;angle entre l&#39;horizontale et une bissectrice la plaque métaphasique perpendiculairement (figure 2B). Il s&#39;agit de l&#39;angle alpha. </li><li> Enregistrer ces angles pour tous les points dans le temps en métaphase de la cellule d&#39;intérêt. L&#39;angle de rotation entre les points dans le temps (t) et (t-1) est égale à la valeur absolue de la différence entre un angle (t) et cet angle à (t-1). </li></ol></li><li> Mesure de l&#39;orientation de la plan de clivage <ol><li> 3D reconstruire une cellule d&#39;intérêt à un moment donné du temps lors de l&#39;anaphase en suivant les instructions décrites pour la reconstruction 3D de plaques métaphasiques. </li><li> Tourner la reconstruction jusqu&#39;à ce que les bords des deux plaques formées par ségrégation des chromosomes sont visibles. </li><li> Utiliser l&#39;outil d&#39;angle pour mesurer l&#39;angle entre l&#39;horizontale (le bord ventriculaire) et une ligne parallèle aux deux plaques formées par ségrégation des chromosomes. Il s&#39;agit de l&#39;angle du plan de clivage (figure 2C). </li></ol></li><li> Génération de Films <ol><li> Comme les cellules se déplacent souvent entre différents z-avions, identifier les z-avions occupées par la cellule lors de la session en direct de l&#39;imagerie. Générer une &quot;projection d&#39;intensité maximale&quot; de ces z-avions en utilisant le &quot;/ / projet de Z piles de l&#39;image ...&quot; commande. Enregistrer la pile résultante comme un &quot;TIF&quot;. Fichier. </li><li> Ouvrez ce fichier dans la version 1.45 de ImageJ que Fidji ne comprend pas un plugin stable pour la génération des «. Mov&quot; ou &quot;. Avi&quot; fichiers. </li><li> Utilisez le menu &quot;Fichier / Enregistrer sous / ...&quot; commande de ImageJ pour générer un film dans un format compatible avec vos applications en aval. </li></ol></li></ol>

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<li>Pulvers, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+mouse+Aspm+%28abnormal+spindle-like+microcephaly+associated%29+cause+not+only+microcephaly+but+also+major+defects+in+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).</li>
<li>Feng, Y., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+regulation+by+Nde1+controls+cerebral+cortical+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size.</a> Neuron. 44, 279-293 (2004).</li>
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<li>Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Imaging+of+Fluorescently+Labeled+Live+Cells+in+the+Embryonic+Mammalian+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain.</a> CSH Protoc. , (2011).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li>
<li>Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique+radial+glial+divisions+in+the+developing+mouse+neocortex+induce+self-renewing+progenitors+outside+the+germinal+zone+that+resemble+primate+outer+subventricular+zone+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors.</a> Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).</li>
<li>Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+and+cell+tracking+using+a+histone+fluorescent+protein+fusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice.</a> BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK7+interacts+with+TACC3+to+regulate+interkinetic+nuclear+migration+and+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis.</a> Nat Neurosci. 15, (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139, 597-609 (2009).</li>
<li>Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+is+required+for+interkinetic+nuclear+migration+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;avantage majeur du protocole que nous avons décrit est qu&#39;il fournit une résolution temporelle dynamique de la mitose de cellules progénitrices neurales. Typiquement, les dosages de visualiser la mitose dans le cerveau en développement sont effectuées par immunofluorescence de coupes de tissus fixés. Mais cette approche ne donne qu&#39;un aperçu de la mitose à un point de temps. Il existe plusieurs étapes qui sont les plus critiques pour l&#39;imagerie de la mitose dans des tranche...

L&#39;objectif global de ce protocole est de décrire comment effectuer l&#39;imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans des tranches de cerveau embryonnaires. En utilisant l&#39;imagerie en direct de tranches de cerveau de la culture, ce protocole fournit une méthode simple pour analyser les multiples aspects de la mitose dans les progéniteurs neuronaux dans un environnement très similaire à un cadre in vivo. Il peut être appliqué sur le cerveau des animaux et / ou les cerveaux mutantes qui ont été manipulés par électroporation in utero) 5.1. Cette technique est également idéal pour tester l&#39;effet d&#39;agents pharmacologiques sur la mitose de précurseurs neuronaux, par le simple ajout d&#39;un agent pour le milieu de culture. En somme, cet article va faire un protocole défi technique accessible à ceux qui étudient la neurogenèse. Au cours de la neurogenèse, les populations progénitrices neurales distinctes subissent divisions précises pour générer des neurones qui contribuent finalement à six couches corticales de l&#39;adulte néocortex 6-8. Au début du développement cortical, la piscine de précurseur neural se développe comme neuroépithéliales (NE) les cellules se divisent de manière symétrique à se renouveler. cellules NE transforment en cellules gliales radiales (CGR). Initialement CGR divisent symétriquement à produire deux nouveaux CGR, mais pendant la plus grande partie de la neurogenèse, principal mode de CGR de division est asymétrique. Dans la division asymétrique, une RGC donne lieu à un nouveau RGC et soit un neurone post-mitotique, ou un progéniteur plus spécialisé (soit un précurseur neuronal court (SNP), une glie radiale externe (ORG), ou un progéniteur intermédiaire (INP) 2,3,7,9. INP, SNP, et ORG peuvent alors générer des neurones à la sous-ventriculaire, ventriculaire, et les régions du cortex basaux, respectivement. conséquent, la division cellulaire des progéniteurs est un processus fondamental pour générer des neurones de l&#39; néocortex. De nombreuses études font état d&#39;une corrélation entre les traits spécifiques de la mitose CGR et le destin des cellules filles. Haydar et al. Et Takahashi et al.ont montré que RGC durée mitotique et augmentation de la longueur du cycle cellulaire comme neurogenèse produit, une constatation fait écho dans le suivi des études 10-13. Un certain nombre d&#39;études ont suggéré que fuseau mitotique orientation par rapport au ventricule influe sur les aspects de la neurogenèse et corticogenèse, y compris les types de neurones générés et le placement de la descendance dans le cerveau, respectivement 3,10,14-16. Que plan de clivage orientation influe directement sur le destin des cellules est controversée, mais la conclusion reste que cette mitotique impacts de paramètres neurogenèse. Souligne en outre l&#39;importance de la mitose est l&#39;observation que de nombreux gènes impliqués dans les mécanismes de la mitose sont cruciales pour la neurogenèse et de bon développement du cerveau 17-20. La mitose est un processus dynamique, encore à ce jour la plupart des études détaillant progénitrices neurales mitose utiliser l&#39;analyse des coupes de tissus fixes ou imagerie de progéniteurs neuronaux via la culture de cellules in vitro. Ainsi, les procédés traditionnels pour évaluer la mitose ne fournissent qu&#39;un aperçu de ce processus et ne parviennent pas à découvrir comment les cellules se comportent dans un tissu. L&#39;imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose est progressivement devenu un outil essentiel pour comprendre la fonction neuronale progénitrice. Pour des exemples s&#39;il vous plaît voir ces références 4,8,10,21-25. Plusieurs protocoles en circulation ont été publiées pour la préparation et l&#39;imagerie des tranches de cerveau 26,27. Toutefois à ce jour, un protocole détaillé pour l&#39;imagerie et l&#39;analyse de la mitose n&#39;a pas été décrite ni démontré dans la vidéo. Cette technique offre plusieurs avantages importants par rapport à l&#39;analyse fixe de coupes de cerveau. Analyse Time-lapse de tranches de cerveau permet la génération de beaucoup plus de points de données qui peuvent être analysées de manière flexible. Tout d&#39;abord, les données sont collectées à des instants individuels sur une période de plusieurs minutes ou plusieurs heures. On peut analyser des points de temps individuels (pour créer un montage statique) oupeut combiner différents moments dans les films. Deuxièmement, l&#39;imagerie confocale de tranches permet la génération de données au niveau des sections de Z différents dans des tranches de cerveau. En conséquence, les sections individuelles peuvent être analysées. En variante, des piles de sections individuelles peuvent être combinées en une projection d&#39;intensité maximale. Troisièmement, l&#39;analyse se fait dans le cadre d&#39;un tissu, révélant comment les cellules se divisent par rapport à des cellules et des structures voisines. Quatrièmement, il est parfaitement adapté à l&#39;analyse de mutants qui montrent des signes de défauts mitotiques. Ensemble, ce protocole permettra de clarifier les étapes critiques pour aider les chercheurs qui souhaitent faire de l&#39;imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans leurs propres laboratoires.

<table><tbody><tr><td>100X N2</td><td>Life technologies</td><td>17502048</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>50X B27 sans vitamine A</td><td>Life technologies</td><td>12587010</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technologies</td><td>11320033</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>Sérum de cheval inactivé à la chaleur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1138-500ml</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>Sérum de veau inactivé à la chaleur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>FGF</td><td>R& D Sytems</td><td>3139-FB-025</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>EGF</td><td></td><td></td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14065-056</td><td>pour la dissection des embryons</td></tr><tr><td>Hepes Free Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>diluer à 1 M (pH 7,4)</td></tr><tr><td>2,5 M D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>pour la dissection des embryons</td></tr><tr><td>0,9 M NaHCO3</td><td>Life technologies</td><td>25080-094</td><td>pour la dissection des embryons</td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td>pour la génération de coupes</td></tr><tr><td>Syto11</td><td>Life technologies</td><td>S7573</td><td>Make 5&micro ; l aliquotes</td></tr><tr><td>3 mg/ml de collagène de type I</td><td>Technologies de la vie</td><td>A1048301</td><td>pour la culture des tranches Plat</td></tr><tr><td>à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>pour la culture des tranches Boîtes</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>Pétri</td><td>pour la dissection des embryons</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td></td><td></td> numérique <td>pour mesurer la température de l’agarose</td></tr><tr><td>Spatule</td><td></td><td></td><td>pour cerveau de transfert Alternative</td></tr><tr>au<td>pinceau</td><td></td><td></td><td>pour les cerveaux de transfert</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td>pour générer des coupes Microscope</td></tr><tr><td></td><td></td><td>de dissection</td><td>d’embryons</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td> d’imagerie <td>Un microscope confocal est nécessaire, il doit être équipé d’une chambre d’incubation</td></tr></tbody></table>

imagerie en direct de la mitose dans les développement cortex souris embryonnaires

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Bien que de courte durée, la mitose est un processus multi-étapes complexe et dynamique fondamentale pour le développement des organes, y compris le cerveau. Dans le cortex cérébral en développement, la mitose anormale de cellules progénitrices neurales peut causer des malformations à la taille et la fonction du cerveau. Par conséquent, il existe un besoin critique des outils pour comprendre les mécanismes de neurones progéniteurs mitose. Développement cortical chez les rongeurs est un modèle exceptionnel pour l&#39;étude de ce processus. Progénitrices neurales mitose est souvent examiné dans les sections du cerveau fixes. Ce protocole décrit en détail une approche de l&#39;imagerie en direct de la mitose en ex vivo des tranches de cerveau embryonnaires. Nous allons décrire les étapes essentielles de cette procédure, qui comprennent: l&#39;extraction du cerveau, intégration, vibratome découpe des tranches de cerveau, la coloration et la culture de tranches, et imagerie time-lapse. Nous allons ensuite montrer et décrire en détail comment effectuer une analyse post-acquisition de la mitose. Nous incluons résultats représentatifs from ce dosage en utilisant le colorant vital Syto11, des souris transgéniques (histone H2B-EGFP et centrine-EGFP), et l&#39;électroporation in utero (mCherry-α-tubuline). Nous allons discuter de la façon dont cette procédure peut être mieux optimisé et comment il peut être modifié pour l&#39;étude de la régulation génétique de la mitose. Imagerie en temps réel de la mitose dans des tranches de cerveau est une approche souple pour évaluer l&#39;impact de l&#39;âge, de l&#39;anatomie, et la perturbation génétique dans un environnement contrôlé, et de générer une grande quantité de données avec une résolution spatiale et temporelle. Ainsi ce protocole vient compléter les outils existants pour l&#39;analyse des neurones progéniteurs mitose.

Le succès de cet essai et l&#39;observation de plusieurs cellules en mitose au cours d&#39;une session live d&#39;imagerie dépendent en grande partie à la fois l&#39;intégrité et le niveau anatomique de la tranche où les acquisitions sont réalisées. Comme discuté ci-dessous, le niveau anatomique d&#39;une tranche est un facteur important. Figure 3A montre rostro-caudale et médio-latérale des endroits où nous avons le mieux réussi. Pour une discussion supplémentaire sur ce sujet s&#39;il vous plaît voir ...

Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l&#39;analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer l'imagerie et l'analyse de la mitose des progéniteurs neuronaux dans des tranches de cerveau de souris vivantes. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant les cerveaux d'embryons. La deuxième étape consiste à préparer des tranches de cerveau à l'aide d'un vibratome.Ensuite, l'imagerie en direct de tranches cérébrales est réalisée. La dernière étape consiste à extraire des informations à partir des vidéos afin d'analyser les paramètres d'intérêt relatifs à la mitose. En définitive, la microscopie en temps réel permet de montrer comment les populations de cellules progénitrices du cerveau se divisent en temps réel.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse sur tissu fixé, réside dans la possibilité d'obtenir des informations précieuses sur la dynamique temporelle de la division des progéniteurs neuronaux dans des tranches cérébrales vivantes. Elle peut également servir à comprendre comment des perturbations génétiques peuvent influencer la division des progéniteurs neuronaux. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier le développement cortical, l'analyse que nou

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Ici, nous développons les outils nécessaires...

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Cette vidéo présente un protocole permettant d’isoler et de cultiver des cellules primaires du cortex cérébral à partir du télencéphale dorsolatéral d’embryons de souris.

Isolement et culture de cellules à partir de télencéphales dorsolatéraux d’embryons de souris

Source : Wiegreffe, C., et al.,  Imagerie confocale en accéléré de neurones migrateurs dans une culture en coupe organotypique de cerveau embryonnaire de souris à l’aide deIn Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Cette vidéo montre la microscopie confocale time-lapse pour observer la migration radiale des neurones corticaux à partir de la zone sous-ventriculaire à la plaque corticale via des échafaudages gliaux radiaux dans des tranches de cerveau embryonnaire de souris transduites.

Imagerie en accéléré de la migration radiale des neurones corticaux dans des tranches de cerveau embryonnaire de souris transduites

Ce protocole décrit comment l'image des cellules en division dans un tissu en Caenorhabditis elegans embryons. Bien que de nombreux protocoles décrivent comment la division cellulaire de l'image dans l'embryon précoce, ce protocole décrit comment l'image de la division cellulaire dans un tissu en développement au cours de l'embryogenèse tardive milieu.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

L’imagerie Live est un outil puissant pour étudier les comportements cellulaires en temps réel. Nous décrivons ici un protocole pour le Time-lapse vidéo-microscopie des cellules du cortex cérébral primaire qui permet un examen détaillé des phases adoptées au cours de la progression de la lignée du primaire des cellules souches neurales au différenciée des neurones et cellules gliales.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

Ce protocole décrit une méthode simple et pratique pour étiqueter et visualiser direct chromosomes dans les cellules mitotiques en utilisant l’étiquette Histone2B-GFP BacMam 2.0 et un système de microscopie confocale tourne disque.

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

Nous présentons un protocole détaillé pour la culture et l’imagerie d’embryons de souris qui permet l’imagerie 3D + temps des cellules progénitrices cardiaques. Cette boîte à outils vidéo aborde les compétences clés requises pour réussir l’imagerie en direct autrement difficile à acquérir à partir de publications textuelles.

Imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques dans l’embryon de souris

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

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Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

Découvrez l'imagerie en direct de la mitose des progéniteurs neuronaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires. Cette méthode permet d'observer la dynamique temporelle des divisions cellulaires en temps réel.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

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