Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

L’objectif global de cette procédure est d’imager le comportement cellulaire dans le tube neural embryonnaire à haute résolution pendant de longues périodes. Ceci est accompli en transectant d’abord le tube neural précoce avec une construction pilotant l’expression d’une protéine fluorescente de choix pour marquer des cellules uniques. L’étape suivante consiste à faire des tranches de l’embryon précoce et à les monter sur des plats à fond de verre.

Après récupération dans un incubateur, les tranches d’embryons sont imagées à intervalles réguliers sur un microscope à grand champ. En fin de compte, cette technique peut être utilisée pour étudier le comportement cellulaire au sein de l’épithélium neurologique en développement sur de longues périodes de temps avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d’imagerie des tissus vivants est qu’elle nous permet d’observer le comportement des cellules individuelles sur de longues périodes de temps à haute résolution spatiale et temporelle.

Cette méthode vous permet d’aborder des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du développement, telles que le rôle de l’orientation du fuseau mitotique dans le choix du sulfate, ou comment la dynamique de signalisation pourrait réguler le comportement cellulaire avant l’électroporation des plasmides dans le tube neural. Les aiguilles de verre sont préparées à l’aide d’un extracteur microcapillaire sous un microscope à dissection. À l’aide d’une pince fine, cassez la pointe de l’aiguille.

L’extrémité de l’aiguille doit être suffisamment pointue pour percer le tube neural tout en n’étant pas si étroite qu’elle empêche l’injection de la solution d’ADN. Les X de cette expérience ont été incubés à 37 degrés Celsius pendant environ 36 heures pour hamburger Hamilton. Étape 10.

Pour commencer cette procédure, insérez de l’ADN dans le tube neural. L’ADN est coloré avec une petite quantité de vert rapide pour la visualisation. Appliquez un courant de 12 à 17 volts et une durée d’impulsion de 50 millisecondes trois fois avec 950 millisecondes entre les impulsions.

De faibles concentrations d’ADN et de faibles tensions d’électroporation sont utilisées pour obtenir une expression en mosaïque afin que les cellules individuelles puissent être suivies. Enfin, couvrez la fenêtre de la coquille de l’œuf avec du ruban adhésif, en vous assurant qu’elle est scellée. Laissez les embryons se rétablir pendant trois à quatre heures ou toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le mélange de collagène et le milieu de culture en tranches doivent être préparés environ une heure avant de trancher les embryons. Pour préparer le mélange de collagène à 100 microlitres de solution d’acide acétique à 0,1 % pour 300 microlitres de collagène de type 1 et tourbillonnez complètement, ajoutez 100 microlitres de cinq fois L 15, moyen et tourbillonnez complètement. Encore une fois, la solution devrait jaunir.

Ensuite, ajoutez 15 à 20 microlitres de bicarbonate de sodium à 7,5 % et tourbillonnez complètement. La solution doit devenir légèrement rose. Restez sur la glace.

Ce mélange de collagène doit être préparé frais à chaque fois. Pour préparer le milieu de culture en tranches à 10 millilitres de milieu neurobasal, de supplément de vitamine B 27 et de solution de gentamycine, placez le milieu dans un incubateur à 37 degrés Celsius, tamponné avec 5 % de dioxyde de carbone. Laissez le haut du récipient lâche pour lui permettre de s’équilibrer avec le dioxyde de carbone pendant au moins une heure.

Pour commencer cette procédure, utilisez une paire de petits ciseaux pour découper l’embryon. Retirez l’embryon de l’œuf à l’aide d’une pince à épiler en lavant L 15 medium. Placez l’embryon dans une boîte de culture tissulaire avec une couche de syl guard au fond.

Centrez l’embryon à travers les membranes embryonnaires supplémentaires environnantes afin que les membranes soient tendues. À l’aide d’un micro-couteau, coupez l’embryon aussi droit que possible dans la région d’intérêt. Pour les tranches de moelle épinière, il doit y avoir entre un et deux somites de feuilles épaisses attachées au tissu latéral de l’embryon afin qu’elles ne soient pas perdues pendant que d’autres embryons sont tranchés.

Un micro-embout personnalisé est nécessaire pour transférer les tranches de moelle épinière dans le plat à fond de verre. Pour préparer cela, fixez un embout de 200 microlitres à un P deux ou P 10 par homme et coupez environ un millimètre de l’extrémité de l’embout. Codez l’intérieur de l’embout avec du collagène en préparant un microlitre du mélange de collagène préparé précédemment.

Laisser agir une à deux minutes puis rincer avec du L 15 medium. Cela évitera que le tissu ne colle à l’intérieur de la pointe. Maintenant, détachez une tranche de l’embryon à l’aide d’un micro-couteau et retirez-la de la coupelle à l’aide du P deux ou du P 10 équipé de l’embout de 200 microlitres.

Essayez d’occuper le moins de support possible. Vortex le mélange de collagène et déposez-en cinq à huit microlitres sur un plat à fond en verre recouvert de polyol lysine avec une lamelle comme base, placez immédiatement la tranche d’embryon dans le collagène et positionnez-la avec une paire de pinces fines. Les SIL doivent être positionnés de manière à ce que le côté à imager affleure la lamelle.

Le tissu doit adhérer à l’enrobage de polyol lysine sur la lamelle. Répétez cette opération jusqu’à ce que vous ayez plusieurs tranches sur la lamelle. Habituellement, six à neuf tranches sont placées sur un plat.

Lorsque toutes les tranches sont en place, ajoutez deux à trois microlitres de L 15, de collagène moyen à premier placé et couvrez le plat. Laissez le collagène prendre pendant 20 minutes. Une fois que le collagène est soigneusement pris, ajoutez deux millilitres de milieu de culture en tranches qui a été équilibré pendant au moins une heure dans 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius.

Il faut veiller à ne pas déloger le collagène de la lamelle, à la placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone et à laisser les tranches récupérer pendant au moins trois heures avant l’imagerie. L’imagerie du comportement cellulaire dans les tissus pendant de longues périodes à haute résolution temporelle et spatiale est un défi. La combinaison de conditions de culture optimales et de l’utilisation de la microscopie à champ blanc est essentielle pour obtenir de bons résultats.

Un microscope à grand champ à cœur de vision delta équipé d’une chambre environnementale de station météorologique est utilisé pour imager les coupes. La chambre est constamment maintenue à 37 degrés Celsius avec un appareil de perfusion de dioxyde de carbone pour maintenir la platine du microscope à 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air, l’imagerie est normalement réalisée à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 40 fois 1,30 NA et les images sont capturées avec un capteur de noyau. Le temps doit être maintenu aussi bas que possible, par exemple, de cinq à 50 millisecondes.

Pour chaque section, des images sont capturées toutes les sept minutes. Jusqu’à neuf tranches peuvent être visitées à l’aide des systèmes de vision Delta. La fonction de visite précise du point illustrée ici est un exemple de séquence time-lapse d’une cellule progénitrice de la moelle épinière transfectée avec une construction exprimant la GFP alpha L’imagerie de la tubuline a été commencée sur une tranche de moelle épinière d’un embryon HH de stade 12 âgé de deux jours.

Au cours de ce stade précoce, les cellules progénitrices neurales subissent principalement des divisions en mode progéniteur progéniteur au cours desquelles les cellules se divisent pour générer deux autres cellules progénitrices cycliques. Cette figure montre des images sélectionnées de la séquence time-lapse qui vient d’être montrée. Au bout de deux heures et 20 minutes, la cellule se divise avec un plan de clivage perpendiculaire à la surface apicale, générant deux cellules filles.

Ces deux cellules se divisent à nouveau à 24 heures et 23 minutes et 25 heures et 54 minutes. Cette séquence time-lapse suivante est celle d’une cellule transfectée avec G-F-P-G-P-I marquant la membrane cellulaire. Cette cellule subit une division au cours de laquelle le processus basal se divise en deux indiqués par les flèches blanches et est également hérité par les cellules filles.

Des images sélectionnées de cette séquence en accéléré montrent que la division cellulaire se produit à zéro heure et 49 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de préparer et d’imager des coupes de moelle épinière. N’oubliez pas que si vous êtes nouveau dans cette technique, vous pouvez avoir des difficultés au début, car il y a un certain nombre d’étapes techniquement difficiles qui doivent toutes être réunies pour que cela fonctionne.