Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

L'objectif général de cette procédure est d'observer le comportement cellulaire au sein du tube neural embryonnaire avec une résolution élevée pendant de longues périodes. Cela est réalisé en sectionnant d'abord le tube neural précoce à l'aide d'un vecteur induisant l'expression d'une protéine fluorescente choisie afin de marquer des cellules individuelles. L'étape suivante consiste à réaliser des tranches de l'embryon précoce et à les monter sur des boîtes en verre à fond transparent.

Après récupération dans une étuve, les tranches d'embryon sont observées au microscope à grand champ à intervalles réguliers. En fin de compte, cette technique peut être utilisée pour étudier le comportement cellulaire au sein de l'épithélium neuroépithélial en développement sur de longues périodes, avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'imagerie de tissus vivants réside dans sa capacité à observer le comportement individuel des cellules sur de longues périodes, avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Cette méthode vous permet d'aborder des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du développement, comme le rôle de l'orientation du fuseau mitotique dans le choix du sulfate, ou la manière dont la dynamique des signaux pourrait réguler le comportement cellulaire avant l'électroporation de plasmides dans le tube neural. Des aiguilles en verre sont préparées à l'aide d'un tireur de microcapillaires sous un microscope stéréo. Utilisez une pince fine pour briser l'extrémité de l'aiguille.

L'extrémité de l'aiguille doit être suffisamment pointue pour percer le tube neural, sans être toutefois trop fine au point d'entraver l'injection de la solution d'ADN. Les X de cette expérience ont été incubés à 37 degrés Celsius pendant environ 36 heures jusqu'au stade de hamburger Hamilton. Stade 10.

Pour commencer cette procédure, faire une fenêtre dans l’œuf et placer des électrodes à cinq millimètres l’une de l’autre de chaque côté de l’embryon, puis injecter de l’ADN dans le tube neural. L’ADN est coloré avec une faible quantité de vert rapide pour en faciliter la visualisation. Appliquer un courant de 12 à 17 volts avec une durée d’impulsion de 50 millisecondes, répété trois fois, avec un intervalle de 950 millisecondes entre chaque impulsion.

Des concentrations faibles d'ADN et des tensions d'électroporation faibles sont utilisées pour obtenir une expression en mosaïque afin que l'on puisse suivre les cellules individuelles. Enfin, recouvrir l'ouverture dans la coquille avec du ruban adhésif imperméable, en veillant à ce qu'elle soit bien scellée. Laisser les embryons se rétablir pendant trois à quatre heures ou toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le mélange de collagène et le milieu de culture de tranches doivent être préparés environ une heure avant de découper les embryons. Pour préparer le mélange de collagène, ajouter 100 microlitres de solution d'acide acétique à 0,1 % à 300 microlitres de collagène de type I et mélanger vigoureusement au vortex, puis ajouter 100 microlitres de milieu L 15 à cinq fois la concentration et mélanger à nouveau vigoureusement au vortex. La solution doit de nouveau devenir jaune.

Ensuite, ajoutez 15 à 20 microlitres de bicarbonate de sodium à 7,5 % et vortexez soigneusement. La solution doit devenir légèrement rose. Conservez-la sur de la glace.

Ce mélange de collagène doit être préparé frais à chaque utilisation. Pour préparer le milieu de culture de tranches, ajoutez à 10 millilitres de milieu neurobasal les suppléments B-27, GlutaMAX et une solution de gentamicine, puis placez le milieu dans un incubateur à 37 degrés Celsius, tamponné à 5 % de dioxyde de carbone. Laissez le couvercle du récipient légèrement desserré afin de permettre l'équilibre avec le dioxyde de carbone pendant au moins une heure.

Pour commencer cette procédure, utilisez une petite paire de ciseaux pour découper l'embryon. Retirez l'embryon de l'œuf à l’aide de pinces en le rinçant avec du milieu L 15. Placez l'embryon dans une boîte de culture tissulaire munie d'une couche de Sylgard au fond.

Épingler l'embryon à travers les membranes extra-embryonnaires environnantes de manière à tendre ces membranes. À l’aide d’un couteau microchirurgical, sectionner l’embryon aussi droit que possible à travers la région d’intérêt. Pour les tranches de moelle épinière, l’épaisseur doit correspondre à une à deux somites, avec des tranches de tissu latéral attachées à l’embryon afin qu’elles ne soient pas perdues pendant la découpe d’autres embryons.

Une micro-pipette personnalisée est nécessaire pour transférer les tranches de moelle épinière dans la boîte à fond de verre. Pour la préparer, fixez un embout de 200 microlitres sur une pipette P2 ou P10 et coupez environ un millimètre à l'extrémité de l'embout. Enduisez l'intérieur de l'embout de collagène en préparant un microlitre du mélange de collagène préparé précédemment.

Laisser pendant une à deux minutes, puis rincer avec le milieu L 15. Cela empêchera le tissu de coller à l'intérieur de l'embout. Détacher maintenant une tranche de l'embryon à l'aide d'un microcouteau et retirer la tranche de la boîte à l'aide d'une pipette P deux ou P 10 équipée d'un embout de 200 microlitres.

Essayez de prélever le moins de milieu possible. Vortexez le mélange de collagène et déposez cinq à huit microlitres de celui-ci sur une boîte à fond en verre revêtu de polyol-lysine, avec une lamelle comme base. Placez immédiatement la tranche d'embryon dans le collagène et positionnez-la à l’aide d’une pince fine. Les LIC doivent être positionnés de sorte que la face à imager soit bien à fleur de la lamelle.

Le tissu doit adhérer au revêtement de polyolysine sur la lamelle. Répétez cette étape jusqu'à ce que vous ayez plusieurs tranches sur la lamelle. Habituellement, six à neuf tranches sont placées dans une même boîte.

Lorsque toutes les tranches sont en place, ajoutez deux à trois microlitres de milieu L 15 sur le collagène placé en premier et recouvrez le plat. Laissez le collagène prendre pendant 20 minutes. Une fois le collagène solidifié, ajoutez soigneusement deux millilitres de milieu de culture de tranches préalablement équilibré pendant au moins une heure à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius.

Il faut faire attention à ne pas déloger le collagène du lambeau. Placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et laisser les tranches se rétablir pendant au moins trois heures avant l'acquisition d'images. L'observation du comportement cellulaire au sein des tissus sur de longues périodes, avec une résolution temporelle et spatiale élevée, est une tâche difficile. Une combinaison de conditions de culture optimales et l'utilisation de la microscopie en champ blanc sont essentielles pour obtenir de bons résultats.

Un microscope à champ large Delta Vision Core équipé d'une chambre environnementale station météorologique est utilisé pour imager les tranches. La chambre est maintenue constamment à 37 degrés Celsius à l'aide d'un appareil de perfusion de dioxyde de carbone, afin de maintenir l'atmosphère sur la platine du microscope à 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'air. L'imagerie est généralement réalisée à l'aide d'un objectif à immersion dans l'huile de 40 fois, NA 1,30, et les images sont capturées avec une caméra CCD Core Snap HQ2. Des sections en Z sont capturées tous les 1,5 micromètres sur une profondeur de 45 micromètres de tissu exposé. La durée d'exposition doit être maintenue aussi faible que possible, par exemple entre cinq et 50 millisecondes.

Pour chaque section mentionnée, des images sont capturées toutes les sept minutes. Jusqu'à neuf coupes peuvent être analysées à l'aide des systèmes Delta Vision. La fonction de visite de points précis illustrée ici présente un exemple de séquence en accéléré d'une cellule progénitrice de la moelle épinière transfectée avec un vecteur exprimant la GFP alpha Tubuline ; l'imagerie a été initiée sur une coupe de moelle épinière provenant d'un embryon de stade HH 12 âgé de deux jours.

Au cours de ce stade précoce, les cellules progénitrices neuronales subissent principalement des divisions en mode progéniteur-progéniteur, au cours desquelles les cellules se divisent pour produire deux autres cellules progénitrices en cycle. Cette figure montre des images sélectionnées de la séquence en lapse de temps précédemment présentée. À deux heures et vingt minutes, la cellule se divise avec un plan de clivage perpendiculaire à la surface apicale, générant deux cellules filles.

Ces deux cellules se divisent une nouvelle fois à 24 heures et 23 minutes, puis à 25 heures et 54 minutes. Cette séquence de microscopie à lapse de temps montre une cellule transfectée avec G-F-P-G-P-I marquant la membrane cellulaire. Cette cellule subit une division au cours de laquelle le processus basal se divise en deux, comme indiqué par les flèches blanches, et est hérité de manière égale par les cellules filles.

Des images sélectionnées de cette séquence en accéléré montrent que la division cellulaire a lieu à zéro heure et 49 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de préparer et d’imager des tranches de moelle épinière. N’oubliez pas que si vous débutez avec cette technique, vous pourriez éprouver des difficultés au départ, car de nombreuses étapes techniques délicates doivent être maîtrisées conjointement pour que celle-ci fonctionne.