Name: Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez une technique d'imagerie à haute résolution du comportement cellulaire dans le neuro-épithélium embryonnaire de poulet. Cette méthode permet d'observer les cellules individuelles sur de longues périodes avec une résolution spatiale et temporelle optimale.

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1. Préparation de la vaisselle <ol><li> Plats utilisés pour la culture tranche sont à fond de verre (avec une lamelle de la base) (plats WillCo). Ces derniers sont placés sur du tissu optique dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm pour garder le fond de verre propre. </li><li> Le jour avant l&#39;expérience, ajouter 2 ml de 0,1% de poly-L-lysine solution au plat à fond de verre et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour permettre à la poly-L-lysine recouvrir le fond de verre. </li><li> Retirer la poly-L-lysine solution et rincer trois fois dans de l&#39;eau désionisée, puis une fois dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Laissez sécher une nuit. Les plats peuvent également être séché en chauffant légèrement dans un micro-ondes à faible puissance pendant 30-45 secondes. </li></ol> 2. L&#39;électroporation d&#39;embryons <ol><li> Incuber les œufs à 37 ° C à Hamburger-Hamilton (HH) étape 10 (~ 36 heures) (ou un autre stade de croissance désiré). </li><li> Avant de commencer de préparer des aiguilles de verre (nous utilisons un Flaming / modèle de Brown p87 extracteur microcapillaire) et de rompre la pointe de l&#39;needle à l&#39;aide d&#39;une pince fines sous une loupe binoculaire. La fin de l&#39;aiguille doit être suffisamment pointu pour percer l&#39;embryon tout en n&#39;étant pas si étroite qu&#39;elle entrave l&#39;injection de la solution d&#39;ADN. </li><li> Oeufs de fenêtres et positionner les électrodes (5mm d&#39;intervalle) de chaque côté de l&#39;embryon </li><li> Injecter de l&#39;ADN (~ 0,025 à 0,5 ug / ul dans de l&#39;eau déminéralisée coloré avec une petite quantité de vert rapide) dans le tube neural. </li><li> Appliquer le courant - 12-17 V trois fois, la longueur d&#39;impulsion 50ms avec 950 ms entre les impulsions. </li><li> Nous utilisons de faibles concentrations d&#39;ADN et des tensions d&#39;électroporation bas pour obtenir l&#39;expression de la mosaïque afin que nous puissions suivre les cellules individuelles. </li><li> Couvrez la fenêtre dans la coquille d&#39;oeuf avec scotch et assurez-vous qu&#39;il est scellé. </li><li> Laisser embryons de récupérer pendant 3-4 heures ou toute la nuit à 37 ° C. </li></ol> 3. Le collagène et de préparation moyen Slice Culture <ol><li> Préparer le mélange de collagène et d&#39;un milieu de culture tranche d&#39;environ une heure avant de trancher. </li><li> Pour 300 t plype 1 collagène ajouter 100 ul solution à 0,1% d&#39;acide acétique et 100 ml 5 x milieu L15. Vortex bien après chaque addition. La solution doit virer au jaune. </li><li> Maintenant, ajoutez du bicarbonate de 15-20 pi de sodium à 7,5% et de manière approfondie vortex. La solution doit devenir légèrement rosée, et le volume de bicarbonate de sodium requise pour cela peut varier. Gardez sur la glace et maquillage frais à chaque fois. </li><li> Pour 10 ml de milieu neurobasal ajouter B-27 supplément et Glutamax, à une concentration de 1 x final et une solution à 10 gentamicine ul. </li><li> Lieu moyenne dans un incubateur à 37 ° C tamponnée avec 5% de CO 2. Laisser la partie supérieure du récipient lâche pour lui permettre de s&#39;équilibrer avec le CO 2. </li></ol> 4. Culture Slice <ol><li> Retirer embryons à partir d&#39;œufs et se laver dans du milieu L15. </li><li> Lieu dans une boîte de culture tissulaire avec une couche de Sylgard au fond et les fixer à travers les entourant extra-embryonnaire de telle sorte que les membranes sont tendus. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un microroknife, embryon tranche aussi droite que possible à travers la région d&#39;intérêt. Pour la moelle épinière, des tranches doit être comprise entre 1-2 somites épais. Laissez tranches attachés à l&#39;embryon pendant que vous coupez d&#39;autres embryons afin de ne pas les perdre. </li><li> Préparer une spatule 200 micropipette ul en coupant ~ 1 mm de la pointe et en joignant cette page à un p2 ou p10. Cette astuce va être utilisé pour transférer les tranches de la moelle épinière dans le plat à fond de verre. Un pourboire de 10 ul n&#39;est pas assez large pour ramasser tranches. </li><li> Manteau à l&#39;intérieur de la pointe avec du collagène par pipetage 1 mix collagène ul préparé plus tôt. Laissez pendant 1-2 minutes, puis rincer à l&#39;milieu L15. Cela permettra d&#39;éviter le tissu de coller à l&#39;intérieur de la pointe. </li><li> Détachez tranche de l&#39;embryon en utilisant un microknife et retirer de l&#39;antenne en utilisant un p2 ou p10 munie d&#39;une douille 200 pi et mis à 1 pl. Essayez de prendre place en tant que milieu le moins possible. </li><li> Vortex du mélange de collagène et de goutte 5-8 pi de ce message à l&#39;antenne de poly-L-lysine revêtu. </li><li> ImmediaTely mis tranche embryon dans le collagène et la position en place avec une paire de pinces fines. Tranches doit être placé de sorte que le côté à imager est alignée avec la lamelle. Le tissu doit adhérer au revêtement poly-L-lysine sur la lamelle. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que vous avez plusieurs tranches sur la lamelle. Nous pouvons généralement placer 6-9 tranches sur un plat. </li><li> Une fois toutes les tranches sont en place, couvrir le plat et laissez le collagène de mettre pendant 20 minutes. Certaines des premières collagène placé peut-être déjà commencé à se dessécher. Pour éviter cela, ajoutez une petite quantité de L15 à ces avant de recouvrir. </li><li> Une fois réglé, ajouter prudemment 2ml milieu de culture tranche qui a été équilibrée dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant au moins une heure. Des précautions doivent être prises pour ne pas déloger le collagène de la lamelle. </li><li> Placer dans un 37 ° / 5% de CO 2 incubateur et permettent de récupérer les tranches pendant au moins 3 heures avant l&#39;imagerie. S&#39;il n&#39;ya pas de placer le plat d&#39;humidité, dans un esprit boîte de plexiglasha peu de papier absorbant humide dans un coin. </li></ol> 5. Tranches d&#39;embryons d&#39;imagerie <ol><li> Nous utilisons un Core DeltaVision grand champ microscope équipé d&#39;une chambre de l&#39;environnement StationMeteo à des tranches d&#39;image. La chambre est maintenue constante à 37 ° C, avec un groupe CO 2 Dispositif de perfusion afin de maintenir la platine du microscope à 5% de CO 2/95% d&#39;air. </li><li> L&#39;imagerie est normalement effectuée en utilisant un 40 x / 1,30 lentille à immersion d&#39;huile et de NA images sont capturées avec un HQ2 Coolsnap refroidi caméra CCD. </li><li> Z-sections sont capturés tous les 1,5 um à 45 um tissus. Le temps d&#39;exposition doit être maintenue aussi basse que possible. Nous avons l&#39;habitude d&#39;exposer pour la 5-50 ms pour chaque section en Z. Les images sont capturées toutes les 7 minutes et jusqu&#39;à 9 tranches peuvent être visités en utilisant le système de point précis DeltaVision de visiter fonction. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple en accéléré séquence d&#39;une cellule progénitrice moelle épinière estFig. 2a et Movie 1 correspondant. L&#39;imagerie a été commencé sur une tranche de la moelle épinière de deux jours-vieux (stade HH 12) embryon. Cette cellule a été transfectées avec une construction exprimant GFP-αTubulin. Au cours de ce stade précoce, les cellules progénitrices neurales subissent principalement les divisions de mode géniteur-souches au cours de laquelle les cellules se divisent pour générer deux autres cellules progénitrices du cyclisme. Fig. Film 2b et correspondant 2 montre une cellule transfectée avec GFP-GPI (GPI ancrées GFP), le marquage de la membrane cellulaire. Cette cellule subit une division au cours de laquelle le processus de base se divise en deux et est également hérité par les cellules filles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figure 1. Protocole de culture Tranche d&#39;imagerie time-lapse. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figure 2. B portableehavior au cours du développement normal de la moelle épinière. (a) les cadres sélectionnés à partir de Film 1. Cellule exprimant la GFP-tubuline divise avec un plan de clivage qui est perpendiculaire à la surface apicale (2 h 20 min), générer deux cellules filles qui divisent une fois de plus (24 h 23 min et 25 h 54 min). (B) les cadres sélectionnés à partir de Movie 2. Cellules transfectées avec GFP-GPI subit la division cellulaire au cours de laquelle le processus de base est divisé (flèches blanches) et également hérité par les cellules filles. Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> . Movie 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> .

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
<li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning%2C+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li>
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<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58(2011).</li>
<li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bios+Scientific+Publishers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li>
<li>Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li>
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<li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii%3A+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li>
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<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous présentons ici une analyse de l&#39;imagerie nouvelle time-lapse pour surveiller le comportement des cellules dans la culture tranche de poulet embryonnaire. Ce test permet l&#39;imagerie haute résolution des tissus vivants pour un maximum de 70 heures, bien que les délais entre 24-48 heures sont plus faciles à capturer. L&#39;utilisation d&#39;un objectif NA élevés du pétrole et des intervalles relativement courts entre-temps des points permet l&#39;acquisition d&#39;images à haute résolution, ainsi que ce qui nous permet de surveiller le comportement des cellules qui se produit souvent rapidement, et peuvent facilement passer inaperçus au cours classique imagerie time-lapse en utilisant confocale microscopie. Le principal avantage de ce test est la capacité de cellules d&#39;image sur de longues périodes de temps. L&#39;utilisation de grand champ 6 au lieu de confocale à balayage laser 7 microscopie est essentiel pour cela. La microscopie confocale a traditionnellement offert plusieurs avantages par rapport à champ large microscopie, y compris la capacité à prendre des sections optiques et d&#39;éliminer de l&#39;information sont directement axées <sup&gt; 7, mais l&#39;utilisation d&#39;un trou d&#39;épingle conduit à une perte de lumière au détecteur 8, à l&#39;exclusion d&#39;une quantité importante d&#39;informations, et nécessitant des temps d&#39;exposition plus longue. À grand champ microscopie, d&#39;autre part, utilise illumination à fond plein et toute la lumière passant à travers l&#39;objectif est envoyé au détecteur. Ceci, couplé avec un rendement quantique élevé refroidi dispositif à couplage de (CCD) assure l&#39;imagerie avec un signal haute par rapport au bruit par rapport à la microscopie confocale 9, avec des temps d&#39;exposition très rapides. Dans notre application, nous devons l&#39;image pendant de longues périodes, record piles 3D et finalement résoudre les petits-près-diffraction des structures limitées. Bien que la microscopie confocale empêche l&#39;extérieur de la focalisation de la lumière de jamais atteindre le détecteur, et donc de réduire de façon significative de fond dans épaisseur, à forte densité de marqués échantillons 7, 8, il ne réalise qu&#39;une utilisable signal à bruit d&#39;entrée de lumière avec beaucoup plus grande que large 10 microscopie en champ. Pour sparsel très sensible à la lumièreéchantillons y étiquetés comme nos électroporées tranches de la moelle épinière, par conséquent, la microscopie en champ large est plus performant que la microscopie confocale. Lorsqu&#39;il est combiné avec la restauration d&#39;images par déconvolution, qui élimine de l&#39;information mise au point et améliore le contraste, à champ large est alors particulièrement bonne pour la détection de petits objets faibles 11. Bien que n&#39;étant pas approprié pour toutes les expériences d&#39;imagerie des tissus, cette approche a été très efficace pour notre application d&#39;imagerie cellulaire en direct. Le choix de la protéine fluorescente est un facteur important qui peut influer sur la survie des cellules. Nous constatons que les meilleurs résultats sont obtenus à partir de constructions qui utilisent la protéine fluorescente verte (GFP) 12 en tant que marqueur. Nous sommes en train d&#39;évaluer une gamme de protéines fluorescentes rouges qui peuvent être efficacement utilisés en combinaison avec la GFP pour le canal de temps dual est caduque. Il existe une variété de ces protéines disponibles 13. Bien que de nombreuses protéines sont stables sous forme de fusions avec une protéine fluorescente, Certaines protéines peuvent être rendus instables par fusion, ce qui réduit la viabilité des cellules. Dans de tels cas, l&#39;utilisation de constructions contenant un site d&#39;entrée interne des ribosomes (IRES) est utile pour séparer la protéine d&#39;intérêt de la protéine fluorescente. Lorsque les tranches d&#39;imagerie de la moelle épinière, des précautions doivent être prises pour minimiser l&#39;exposition à la lumière fluorescente. Les oculaires du microscope doit être utilisé uniquement avec la lumière transmise (fond clair) pour localiser la position et les tranches. Images fluorescentes doivent toujours être acquis à l&#39;aide du logiciel microscope en utilisant un minimum de temps d&#39;exposition. Ceux-ci devraient être conservés dans la gamme de 5-50 ms et l&#39;utilisation de filtres de densité neutre devrait être expérimenté. Bien que les temps d&#39;exposition plus longs peuvent produire initialement des images plus claires, les effets phototoxiques de exposition à la lumière fluorescente peut conduire à la mort cellulaire. Les 5-10 premières um de tissu qui est la plus proche de la lamelle ne doit pas être représenté comme cette région contient des tissus qui peut avoir été endommagé pendant letranchage. Bien que les exemples présentés ici sont des embryons au stade électroporés HH 10 et imagées 6-7 heures plus tard, cette méthode peut être utilisée pour les embryons à Son Altesse l&#39;étape 18. Aux stades ultérieurs, la moelle épinière est beaucoup plus grande et est donc difficile de trancher la main. Dans ces cas, l&#39;incorporation des embryons à faible point de fusion d&#39;agarose et la coupe avec un vibratome peut donner de meilleurs résultats. Même si nous présentons cette analyse comme une méthode pour l&#39;imagerie de cellules dans la moelle épinière en développement, cette approche a également été modifié pour d&#39;autres images des tissus embryonnaires, y compris le sensorielle placodes 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> WillCo vaisselle </td><td> WillCo Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% dans du Tris </td></tr><tr><td> Le verre borosilicate capillaires </td><td> Harvard Instruments </td><td> GC100-10 </td><td> 1,0 mm de diamètre externe, 0.58mm diamètre intérieur </td></tr><tr><td> Électrodes (Genetrodes, dans ovo, en forme de L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> Or plaqué 5mm </td></tr><tr><td> ECM 830 carré générateur d&#39;impulsions </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> dans electroopration ovo </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Tapez collagène I de rat </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu L-15 (en poudre) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L dans l&#39;eau distillée pour solution 5x </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> Solution à 7,5% </td></tr><tr><td> Milieu Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> sans rouge de phénol </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> Solution 100x </td></tr><tr><td> B-27 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> La gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Du milieu L15 (liquide 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 pente degré </td></tr><tr><td> Goupilles en acier inoxydable sans tête </td><td> Watkins et Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Format A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 élastomère </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> Système DeltaVision microscope de base </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 caméra CCD </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Le cordon épinière embryonnaire se compose de vélo cellules progénitrices neurales qui donnent lieu à un grand pourcentage des cellules neuronales et gliales du système nerveux central (SNC). Bien que beaucoup est connu au sujet des mécanismes moléculaires qui motif de la moelle épinière et de susciter la différenciation neuronale 1, 2, nous manquons d&#39;une compréhension profonde de ces événements précoces au niveau du comportement des cellules. Il est donc essentiel d&#39;étudier le comportement des progéniteurs neuronaux en temps réel car ils subissent la neurogenèse. Dans le passé, imagerie en temps réel des tissus embryonnaire précoce a été limitée par les cellules / tissus viabilité de la culture ainsi que les effets phototoxiques de l&#39;imagerie de fluorescence. Ici, nous présentons un nouveau test pour l&#39;imagerie des tissus tels pendant de longues périodes de temps, en utilisant un ex vivo roman protocole de culture tranche et à grand champ microscopie à fluorescence (Fig. 1). Cette approche permet d&#39;atteindre à long terme time-lapse de surveillance de poussin embryonnaire scellules progénitrices de la moelle Pinal avec une résolution spatiale et temporelle. Ce test peut être modifiée à l&#39;image de toute une gamme de tissus embryonnaires 3, 4 En plus de l&#39;observation des comportements cellulaires et sub-cellulaire, le développement du roman et des journalistes très sensibles pour l&#39;activité des gènes (par exemple, la signalisation Notch 5) rend ce test un outil puissant permettant de comprendre comment de signalisation régule le comportement des cellules pendant le développement embryonnaire.

L&#39;imagerie des tissus embryonnaires en temps réel est difficile sur de longues périodes de temps. Nous présentons ici une analyse pour surveiller les changements cellulaires et sub-cellulaire de la moelle épinière de poulet pendant de longues périodes avec une résolution spatiale et temporelle. Cette technique peut être adaptée pour d&#39;autres régions du système nerveux et de l&#39;embryon en développement.

Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

La moelle épinière embryonnaire est composée de cellules progénitrices neurales en cycle qui donnent naissance à un pourcentage important de cellules neuronales et gliales du système nerveux central...

L'objectif général de cette procédure est d'observer le comportement cellulaire au sein du tube neural embryonnaire avec une résolution élevée pendant de longues périodes. Cela est réalisé en sectionnant d'abord le tube neural précoce à l'aide d'un vecteur induisant l'expression d'une protéine fluorescente choisie afin de marquer des cellules individuelles. L'étape suivante consiste à réaliser des tranches de l'embryon précoce et à les monter sur des boîtes en verre à fond transparent.Après récupération dans une étuve, les tranches d'embryon sont observées au microscope à grand champ à intervalles réguliers. En fin de compte, cette technique peut être utilisée pour étudier le comportement cellulaire au sein de l'épithélium neuroépithélial en développement sur de longues périodes, avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'imagerie de tissus vivants réside dans sa capacité à observer le comportement individuel des cellules sur de longues périodes, avec une résolution spatiale et temporelle élevée.Cette méthode vous permet d'aborder des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du développement, comme le rôle de l'orientation du fuseau mitotique dans le choix du sulfate, ou la manière dont la dynamique des signaux pourrait réguler le comportement cellulaire avant l'électroporation de plasmides dans le tube neural. Des aiguilles en verre sont préparées à l'aide d'un tireur de microcapillaires sous un microscope stéréo. Utilisez une pince fine pour briser l'extrémité de l'aiguille.L'extrémité de l'aiguille doit être suffisamment pointue pour percer le tube neural, sans être toutefois trop fine au point d'entraver l'injection de la solution d'ADN. Les X de cette expérience ont été incubés à 37 degrés Celsius pendant environ 36 heures jusqu'au stade de hamburger Hamilton. Stade 10.Pour commencer cette procédure, faire une fenêtre dans l’œuf et placer des électrodes à cinq millimètres l’une de l’autre de chaque côté de l’embryon, puis injecter de l’ADN dans le tube neural. L’ADN est coloré avec une faible quantité de vert rapide pour en faciliter la visualisation. Appliquer un courant de 12 à 17 volts avec une durée d’impulsion de 50 millisecondes, répété trois fois, avec un intervalle de 950 millisecondes entre chaque impulsion.Des concentrations faibles d'ADN et des tensions d'électroporation faibles sont utilisées pour obtenir une expression en mosaïque afin que l'on puisse suivre les cellules individuelles. Enfin, recouvrir l'ouverture dans la coquille avec du ruban adhésif imperméable, en veillant à ce qu'elle soit bien scellée. Laisser les embryons se rétablir pendant trois à quatre heures ou toute la nuit à 37 degrés Celsius.Le mélange de collagène et le milieu de culture de tranches doivent être préparés environ une heure avant de découper les embryons. Pour préparer le mélange de collagène, ajouter 100 microlitres de solution d'acide acétique à 0,1 % à 300 microlitres de collagène de type I et mélanger vigoureusement au vortex, puis ajouter 100 microlitres de milieu L 15 à cinq fois la concentration et mélanger à nouveau vigoureusement au vortex. La solution doit de nouveau devenir jaune.Ensuite, ajoutez 15 à 20 microlitres de bicarbonate de sodium à 7,5 % et vortexez soigneusement. La solution doit devenir légèrement rose. Conservez-la sur de la glace.Ce mélange de collagène doit être préparé frais à chaque utilisation. Pour préparer le milieu de culture de tranches, ajoutez à 10 millilitres de milieu neurobasal les suppléments B-27, GlutaMAX et une solution de gentamicine, puis placez le milieu dans un incubateur à 37 degrés Celsius, tamponné à 5 % de dioxyde de carbone. Laissez le couvercle du récipient légèrement desserré afin de permettre l'équilibre avec le dioxyde de carbone pendant au moins une heure.Pour commencer cette procédure, utilisez une petite paire de ciseaux pour découper l'embryon. Retirez l'embryon de l'œuf à l’aide de pinces en le rinçant avec du milieu L 15. Placez l'embryon dans une boîte de culture tissulaire munie d'une couche de Sylgard au fond.Épingler l'embryon à travers les membranes extra-embryonnaires environnantes de manière à tendre ces membranes. À l’aide d’un couteau microchirurgical, sectionner l’embryon aussi droit que possible à travers la région d’intérêt. Pour les tranches de moelle épinière, l’épaisseur doit correspondre à une à deux somites, avec des tranches de tissu latéral attachées à l’embryon afin qu’elles ne soient pas perdues pendant la découpe d’autres embryons.Une micro-pipette personnalisée est nécessaire pour transférer les tranches de moelle épinière dans la boîte à fond de verre. Pour la préparer, fixez un embout de 200 microlitres sur une pipette P2 ou P10 et coupez environ un millimètre à l'extrémité de l'embout. Enduisez l'intérieur de l'embout de collagène en préparant un microlitre du mélange de collagène préparé précédemment.Laisser pendant une à deux minutes, puis rincer avec le milieu L 15. Cela empêchera le tissu de coller à l'intérieur de l'embout. Détacher maintenant une tranche de l'embryon à l'aide d'un microcouteau et retirer la tranche de la boîte à l'aide d'une pipette P deux ou P 10 équipée d'un embout de 200 microlitres.Essayez de prélever le moins de milieu possible. Vortexez le mélange de collagène et déposez cinq à huit microlitres de celui-ci sur une boîte à fond en verre revêtu de polyol-lysine, avec une lamelle comme base. Placez immédiatement la tranche d'embryon dans le collagène et positionnez-la à l’aide d’une pince fine. Les LIC doivent être positionnés de sorte que la face à imager soit bien à fleur de la lamelle.Le tissu doit adhérer au revêtement de polyolysine sur la lamelle. Répétez cette étape jusqu'à ce que vous ayez plusieurs tranches sur la lamelle. Habituellement, six à neuf tranches sont placées dans une même boîte. Lorsque toutes les tranches sont en place, ajoutez deux à trois microlitres de milieu L 15 sur le collagène placé en premier et recouvrez le plat. Laissez le collagène prendre pendant 20 minutes. Une fois le collagène solidifié, ajoutez soigneusement deux millilitres de milieu de culture de tranches préalablement équilibré pendant au moins une heure à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius.Il faut faire attention à ne pas déloger le collagène du lambeau. Placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et laisser les tranches se rétablir pendant au moins trois heures avant l'acquisition d'images. L'observation du comportement cellulaire au sein des tissus sur de longues périodes, avec une résolution temporelle et spatiale élevée, est une tâche difficile. Une combinaison de conditions de culture optimales et l'utilisation de la microscopie en champ blanc sont essentielles pour obtenir de bons résultats.Un microscope à champ large Delta Vision Core équipé d'une chambre environnementale station météorologique est utilisé pour imager les tranches. La chambre est maintenue constamment à 37 degrés Celsius à l'aide d'un appareil de perfusion de dioxyde de carbone, afin de maintenir l'atmosphère sur la platine du microscope à 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'air. L'imagerie est généralement réalisée à l'aide d'un objectif à immersion dans l'huile de 40 fois, NA 1,30, et les images sont capturées avec une caméra CCD Core Snap HQ2. Des sections en Z sont capturées tous les 1,5 micromètres sur une profondeur de 45 micromètres de tissu exposé. La durée d'exposition doit être maintenue aussi faible que possible, par exemple entre cinq et 50 millisecondes.Pour chaque section mentionnée, des images sont capturées toutes les sept minutes. Jusqu'à neuf coupes peuvent être analysées à l'aide des systèmes Delta Vision. La fonction de visite de points précis illustrée ici présente un exemple de séquence en accéléré d'une cellule progénitrice de la moelle épinière transfectée avec un vecteur exprimant la GFP alpha Tubuline ; l'imagerie a été initiée sur une coupe de moelle épinière provenant d'un embryon de stade HH 12 âgé de deux jours.Au cours de ce stade précoce, les cellules progénitrices neuronales subissent principalement des divisions en mode progéniteur-progéniteur, au cours desquelles les cellules se divisent pour produire deux autres cellules progénitrices en cycle. Cette figure montre des images sélectionnées de la séquence en lapse de temps précédemment présentée. À deux heures et vingt minutes, la cellule se divise avec un plan de clivage perpendiculaire à la surface apicale, générant deux cellules filles.Ces deux cellules se divisent une nouvelle fois à 24 heures et 23 minutes, puis à 25 heures et 54 minutes. Cette séquence de microscopie à lapse de temps montre une cellule transfectée avec G-F-P-G-P-I marquant la membrane cellulaire. Cette cellule subit une division au cours de laquelle le processus basal se divise en deux, comme indiqué par les flèches blanches, et est hérité de manière égale par les cellules filles.Des images sélectionnées de cette séquence en accéléré montrent que la division cellulaire a lieu à zéro heure et 49 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de préparer et d’imager des tranches de moelle épinière. N’oubliez pas que si vous débutez avec cette technique, vous pourriez éprouver des difficultés au départ, car de nombreuses étapes techniques délicates doivent être maîtrisées conjointement pour que celle-ci fonctionne.

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