Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la double synchronisation de la thymidine et la microscopie confocale à haute résolution pour étudier les rôles mitotiques des protéines multifonctionnelles qui peuvent posséder des fonctions interphasiques critiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, sur la façon de délimiter les fonctions normales des protéines impliquées dans le cycle cellulaire et la mitose. Les principaux avantages de cette technique sont que les cellules peuvent maintenir leur comportement physiologique normal et que cette méthode est également très facile à réaliser.

La démonstration de cette procédure sera faite par le Dr Mohammed Amin, un post-doctorant de mon laboratoire, qui est un expert dans l’utilisation de cette méthode. Pour l’imagerie cellulaire fixe de la progression des cellules mitotiques, commencez par ensemencer environ deux fois 10 à la cinquième cellules HeLa dans chaque puits d’une plaque à six puits, contenant une lamelle stérilisée à 70 % d’éthanol et d’UV et deux millilitres de milieu DMEM. Après 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire, bloquez les cellules avec deux millilitres de thymidine fraîchement diluée et un milieu frais par puits, et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 18 heures supplémentaires.

Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS et une fois avec un milieu frais à 37 degrés Celsius. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant neuf heures pour libérer les cellules du bloc, suivi de l’ajout de deux millilitres supplémentaires de milieu supplémenté en thymidine par puits. Après la deuxième incubation bloquante, lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS, et une fois avec deux millilitres de milieu frais à 37 degrés Celsius, et ajoutez 100 nanomolaires de siRNA fraîchement préparé dans les puits appropriés.

Après neuf à dix heures, aspirez le surnageant et fixez les cellules sur les lamelles avec quatre pour cent de paraformaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Après le lavage avec du PBS, perméabilisez les cellules fixes avec 0,5 % de détergent pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages de cinq minutes avec du PBS. Bloquez les cellules avec un pour cent de BSA dans du PBS pendant une heure à température ambiante.

Étiquetez ensuite les cellules avec 50 microlitres des anticorps primaires d’intérêt pendant une heure à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules trois fois dans du PBS et marquez-les avec 50 microlitres des anticorps secondaires d’intérêt appropriés. Après une heure à température ambiante, lavez les cellules deux fois dans du PBS pendant cinq minutes à chaque lavage, et étiquetez les cellules avec du DAPI pendant cinq minutes à température ambiante.

Suivez la coloration DAPI avec deux lavages de cinq minutes dans du PBS et utilisez le support de montage approprié pour monter les lamelles de recouvrement sur des lames de microscope transparentes individuelles. Ensuite, à l’aide d’objectifs apochromatiques à immersion dans l’huile DIC à plan d’ouverture numérique de 60 ou 100 X 1,4 montés sur un microscope confocal inversé à haute résolution équipé d’une caméra appropriée, acquérir des images des protéines immunomarquées en piles Z de 0,2 micromètre d’épaisseur. Pour l’imagerie de cellules vivantes de la progression des cellules mitotiques, ensemencez environ 0,5 à une fois 10 à la cinquième cellules HeLa exprimant de manière stable mCherry H2B et GFP alpha-tubuline dans des boîtes à fond de verre de 35 millilitres contenant 1,5 millilitre de milieu DMEM.

Faites pousser les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Ensuite, la thymidine bloque les cellules deux fois comme cela vient d’être démontré, cette fois en lavant les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS et une fois avec un millilitre de milieu DMEM préchauffé à la fin de chaque bloc de thymidine et en traitant les cellules avec siRNA après le premier bloc lors du premier lavage de thymidine. Cultivez les cellules dans un milieu de Leibovitz frais préchauffé, complété par 10 % de FBS et 20 millimolaires HEPES pendant huit heures pour libérer les cellules du deuxième bloc.

Placez ensuite la première plaque dans la chambre à température contrôlée d’un microscope confocal à haute résolution et utilisez l’objectif 60X et l’imagerie en champ clair pour faire la mise au point sur les cellules. Lorsque les cellules sont visibles, ajustez manuellement la position de la plaque à la région de votre choix et utilisez le logiciel d’acquisition d’images pour régler la puissance et l’exposition du laser, les paramètres d’acquisition d’images et la durée de l’expérience. Sélectionnez les filtres GFP et mCherry appropriés et acquérez des images en lumière transmise pulsée et en fluorescence toutes les 10 minutes pendant une période allant jusqu’à 16 heures, afin d’obtenir des images en accéléré du processus de mitose.

Neuf heures après la libération du double bloc de thymidine, acquérez les images dans 12 plans z séparés d’un micromètre. Ensuite, analysez les images en suivant les cellules mitotiques individuelles et utilisez le logiciel source approprié pour assembler un film correspondant. Bien que la plupart des cellules témoins et des cellules siRNA Cdt1 soient au stade de métaphase neuf heures après la libération du double bloc de thymidine, la fixation à 10 heures révèle que la plupart des cellules traitées par Cdt1 siRNA sont toujours arrêtées en fin de prométaphase, tandis que les cellules témoins entrent en anaphase et séparent leurs chromosomes comme prévu.

Le traitement par le froid neuf heures après la libération du double bloc de thymidine facilite la rétention de microtubules kinétochores stables qui sont relativement moins robustes dans les cellules appauvries en Cdt1 par rapport à celles des cellules appauvries en contrôle. La licence d’origine de la réplication de l’ADN n’est pas perturbée dans les cellules appauvries en Cdt1 ou en contrôle pendant la phase G2-M, car ces cellules n’induisent pas l’accumulation de gamma H2AX phosphoralé, un marqueur des dommages à l’ADN, au cours de la phase G2 suivante. Cependant, la transfection de l’ARNi Cdt1 des cultures asynchrones induit l’accumulation de foyers positifs pour le phospho gamma H2AX, peut-être en raison des dommages à l’ADN induits par une licence de réplication de l’ADN inappropriée.

Après la rupture de l’enveloppe nucléaire, les cellules normales entrent en mitose et subissent un début d’anaphase pour sortir de la mitose en 30 à 60 minutes environ. L’inactivation médiée par l’ARNi de Hec1, une protéine kinétochore clé nécessaire à la formation robuste de l’attachement des microtubules kinétochores, retarde toutefois la progression mitotique normale jusqu’au début de l’anaphase ou à la sortie de la mitose, même après plusieurs heures de retard de mitose. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de procédure, il est important de ne pas oublier de dissoudre complètement la thymidine après l’avoir décongelée du congélateur. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le western blot peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : quels sont les modèles d’expression des protéines d’intérêt pendant la mitose par rapport à l’interphase ? Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la biogenèse du cancer dans des modèles de culture de cellules humaines et pour utiliser la microscopie confocale à haute résolution pour identifier les fonctions liées au cycle cellulaire des protéines d’intérêt.

N’oubliez pas que travailler avec des réactifs comme le paraformaldéhyde et le DAPI peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.