Imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale

Commencez par une configuration de microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) avec une chambre d’imagerie couverte contenant une lamelle en verre avec des cellules de neuroblastome humain collées dans un tampon.

Ces cellules expriment des fluorophores spécifiques aux membranes des vésicules synaptiques.

En mode épifluorescence, sélectionnez une cellule pour l’imagerie.

En mode TIRF, à travers l’objectif, dirigez un laser vers l’échantillon, apparaissant comme une tache sur le couvercle.

Ajustez l’angle pour dépasser l’angle critique à l’interface entre la lamelle en verre à indice de réfraction élevé et l’échantillon à indice de réfraction inférieur, provoquant une réflexion interne totale (TIR), considérée comme une ligne mince.

Le TIR génère une onde évanescente qui excite les fluorophores sur la membrane la plus proche.

La fluorescence émise est collectée par l’objectif et captée par une caméra.

Affinez le réglage pour obtenir une image à contraste élevé de la membrane cellulaire près de la lamelle.

Optimisez les paramètres d’acquisition pour minimiser le photoblanchiment et définissez la fréquence d’échantillonnage.

Commencer l’imagerie TIRF pour visualiser les vésicules synaptiques fusionnées.

En mode épifluorescence, concentrez-vous sur la lamelle et choisissez des cellules transfectées placées au centre de la chambre. Sous contrôle logiciel, passez à l’éclairage du gazon en mode direct. Pour régler la configuration du gazon, vérifiez la position du faisceau qui sort de l’objectif sur le couvercle de l’échantillon. Lorsque le faisceau est positionné au centre de la lentille de l’objectif, un point est visible au centre de la couverture de l’échantillon de gazon et la cellule est imagée en mode épifluorescence.

Pour atteindre l’angle critique, déplacez le point focalisé dans la direction Y à l’aide de la vis de réglage de l’angle sur le curseur de gazon. Lorsque le faisceau converge sur le plan de l’échantillon à un angle supérieur à l’angle critique, la tache disparaît et une ligne droite, fine et focalisée est évidente au milieu de la couverture de l’échantillon. Pour affiner l’angle du gazon, utilisez un échantillon de cellule.

Regardez l’image de fluorescence sur la vidéo. À ce stade, une image semblable à l’épifluorescence est encore visible. Déplacez doucement la vis jusqu’à ce que l’état du gazon soit atteint. Ici, un seul plan optique de la cellule est net, ce qui donne une image plate avec un contraste élevé.

Pour effectuer l’imagerie d’échantillons, réglez l’expérience time lapse sur un seul canal. Les temps d’exposition appropriés sont compris entre 40 et 80 millisecondes. Acquérez des images à une fréquence d’échantillonnage de 1 ou 2 Hertz.