Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l'aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

L'objectif général de cette procédure est d'acquérir des images de haute qualité, en fluorescence, en réflexion totale interne ou en champ clair, d'organismes microscopiques possédant une paroi cellulaire. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les lamelles et les cellules. La deuxième étape consiste à aligner précisément le dispositif du microscope afin d'obtenir une qualité d'image optimale.

Ensuite, les incidents, angles et conditions d'imagerie corrects sont choisis pour l'acquisition d'images ou de vidéos. La dernière étape consiste en le traitement post-acquisition des images obtenues. En définitive, la microscopie TURB est utilisée pour étudier la dynamique de la localisation des protéines au niveau du cortex cellulaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes utilisant des métaux excessifs comme la microscopie conventionnelle ou confocale réside dans le fait que le contraste d'image en microscopie est très élevé, permettant des temps d'acquisition rapides et une faible intensité lumineuse. Cette méthode peut ainsi contribuer à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la recherche sur les membranes, telles que les mécanismes de ségrégation latérale des protéines ou la mobilité des protéines membranaires. Les lamelles destinées à la microscopie doivent être nettoyées des particules de poussière avant utilisation.

Étant donné que la pellicule est sensible aux signaux de fond provenant de la poussière sur une lame couvre-objet sale, une lame couvre-objet propre présentant moins de signal de fond est nécessaire pour commencer la procédure de nettoyage des lames couvre-objet. Utilisez une pince pour placer les lames couvre-objet dans un support en céramique muni d'un couvercle.

Ensuite, remplir un récipient en verre avec de l'hydroxyde de sodium à une molarité de un molaire. Cet hydroxyde de sodium peut être réutilisé plusieurs fois. Placer le support en céramique contenant les lamelles dans l'hydroxyde de sodium et incuber les lamelles pendant deux heures sous agitation lente et continue.

Ne pas incuber plus de huit heures, car cela rendra les lamelles opaques après deux heures. Rincer les lamelles deux fois avec de l'eau distillée pendant cinq minutes chaque fois sous agitation lente et continue. Conserver les lamelles propres dans le porte-lamelle en céramique rempli d'éthanol à 100 %. Pour préparer les cellules de bacillus subtilis pour la microscopie en gazon, diluer à une DO 600 de 0,01 à 0,05 dans cinq millilitres de milieu de croissance approprié et faire croître jusqu'à la phase exponentielle. Préparer l'aros à 1,25 % dans un milieu synthétique : dissoudre la poudre d'aros dans un tube plastique de 1,5 millilitre à 95 degrés Celsius, puis conserver dans un bloc chauffant à 72 degrés Celsius.

Ajoutez une petite goutte d'aros au centre d'une lame et, à l’aide d’une seconde lame, appuyez sur l’aros pour former un tampon plat après au moins deux minutes, puis séparez soigneusement les lames. Faites centrifuger 500 microlitres de cellules de Bacillus subtilis dans une microcentrifugeuse à 12 000 tr/min pendant une minute. Jetez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 50 microlitres de milieu.

Ajoutez deux à quatre microlitres de cellules au centre du tampon aros. Ensuite, utilisez une pince pour retirer une lame couvre-objet nettoyée du récipient rempli d'éthanol et séchez-la avec de l'air comprimé. Placez délicatement la lame couvre-objet sur l'échantillon.

Laisser les cellules se déposer pendant au moins deux minutes avant la microscopie. Pour l'imagerie à long terme, sceller les bords de la lame avec une couche chauffée de mélange de vaseline, de lanoline et de paraffine ou de Val app. Pour préparer les cellules de Saccharomyces visi pour la microscopie turf, diluer une pré-culture et les faire croître dans un milieu approprié pendant au moins cinq heures.

Pendant la phase exponentielle, prenez une lame couvre-objet depuis le récipient rempli d'éthanol et séchez-la à l'air comprimé à l'aide d'une pipette. Déposez cinq microlitres d'une solution de con A (concanavaline A) sur la lame couvre-objet, puis séchez à l'air comprimé. La con A se lie aux glucides de la paroi cellulaire des levures et immobilise les cellules de levure.

Ensuite, transférez 4,5 microlitres d'une suspension de cellules de levure sur un côté du con, un lamelle recouverte. Placez délicatement la lamelle, côté échantillon vers le bas, sur une lame de microscope en commençant par un bord et en laissant les gouttes s'étaler lentement. Cela permettra d'éviter la formation de bulles d'air.

Laisser les cellules se déposer pendant au moins deux minutes avant la microscopie ; sceller les bords de la lamelle avec de la vaseline pour une observation prolongée. Toutes les expériences montrées dans cette vidéo sont réalisées sur un dispositif turf personnalisé basé sur une platine IMEX entièrement automatisée, équipée d'un objectif Olympus 100 x, NA 1,45. Les sources lumineuses utilisées sont des lasers à diode pompés en état solide (DPSS) de 75 milliwatts aux longueurs d'onde de 488 nanomètres et 561 nanomètres.

Angles de balayage et fluorescence. La récupération après photoblanchiment ou la position FRAP peut être ajustée instantanément au moyen de deux galvanomètres. Un troisième galvanomètre sert à commuter entre les modes épi, fluorescence, FRAP et balayage.

Les galvanomètres, qui sont directement commandés par le logiciel d'acquisition en temps réel, permettent une mesure simple de la cinétique de localisation pour les objets tracés sur les images de gazon, recueillies à l’aide d’une caméra EM CCD et d’un objectif de deux fois le grossissement placé devant la caméra. L’acquisition est également contrôlée par le logiciel d’acquisition en temps réel. Avant de manipuler le laser, portez des lunettes de protection laser, projetez le laser sur le plafond en mode gazon et étalonnez la position à zéro degré de sorte que le laser forme une ligne droite.

Avec l'objectif, focalisez le point laser à une taille minimale après un réglage optimal ; le profil du laser doit former un point bien défini de forme approximativement ronde. Effectuez l'étalonnage avant chaque séance. Pour obtenir une qualité d'image optimale, l'alignement du microscope turf est essentiel à la réussite de cette procédure.

L'incidence, les angles et les paramètres corrects pour l'acquisition d'images doivent être soigneusement ajustés afin d'obtenir une qualité d'image optimale. Pour commencer l'acquisition d'images, repérez la position des cellules à l'aide de l'éclairage en champ clair. Les LED rouges sont particulièrement adaptées car elles n'induisent pas de dommages photo-induits significatifs.

Passer à l'éclairage laser et sélectionner les lasers et combinaisons de filtres appropriés pour exciter les fluorophores choisis, en veillant à ce que l'angle de rasage soit sous-critique. Sinon, les signaux provenant des protéines de fusion GFP ne seront pas détectés. Localiser la section supérieure de la cellule, qui correspond au côté de la cellule tourné vers la lame couvre-objet.

Augmentez progressivement l'angle d'incidence du faisceau laser jusqu'à la disparition des signaux, puis diminuez lentement l'angle jusqu'au point où la fluorescence à la surface de la cellule réapparaît. Ajustez à nouveau le focus en Z pour obtenir une position optimale à la surface. Les angles d'incidence acceptables ne doivent pas produire de halo flou au bord de la cellule, comme illustré par cet exemple de protéine de levure.

PMA un GFP imagé avec des angles d'incidence décroissants, du haut à gauche au bas à droite. Les images montrent une perte soudaine du signal à l'angle critique et une diminution progressive des informations structurales ainsi que du rapport signal sur bruit. Ajustez les intensités du laser et le gain de la caméra pour maximiser la plage dynamique. En général, les caméras E-M-C-C-D sont optimales pour détecter des signaux très faibles avec un rapport signal sur bruit élevé.

La microscopie en coupe est très sensible aux faibles variations de hauteur. Les différences d'épaisseur du couvre-objet entraînent l'observation simultanée d'un nombre réduit de cellules. Cette image d'une suspension dense de billes fluorescentes illustre un champ de vision irrégulier, où seule une partie du champ est en netteté.

Par conséquent, pour les petites cellules, la région d'acquisition peut souvent être réduite à une sous-région contenant l'objet choisi. Dans les expériences double couleur turf, le recouvrement des fluorophores doit être minimisé pour les paires RFP-GFP. Utilisez des filtres d'émission séparés, car la RFP est faiblement excitée par une lumière de 488 nanomètres.

Un flux de travail typique permettant d’éviter les interférences et l’imagerie double couleur est illustré ici. Après avoir acquis les images des cellules à l’aide de jeux de filtres distincts, les images sont désentrelacées et alignées à l’aide de billes fluorescentes avant d’être fusionnées. Pour l’analyse, un paramètre critique influant sur la qualité de l’image est l’alignement du laser et la propreté de l’objectif. Après avoir aligné le laser et mis au point sur la position Z utilisée pour l’imagerie en tuft, retirez l’échantillon et nettoyez soigneusement l’objectif de tout excès d’huile.

L'huile résiduelle entraînera une diffraction de la lumière laser et des taches de speckle dans le profil du faisceau. La microscopie TURB peut être utilisée pour visualiser la distribution des homologues de l'actine et des enzymes de la paroi cellulaire dans les cellules bactériennes. Dans ce résultat représentatif, des cellules de Bacillus subtilis exprimant des fusions GFP de l'homologue de l'actine Mbl ou de la transpeptidase PbpH ont été observées par microscopie TURB et par microscopie de fluorescence épifluorescente classique.

Les images présentées ici représentent des projections moyennes d'une série temporelle afin d'indiquer la zone couverte par les patchs mobiles de MBL surveillés à l'aide de différents modes d'imagerie. Le contour bleu dans l'image superposée indique la limite cellulaire visualisée à partir d'une image en champ clair.

La transpeptidase PBPH exprimée hebdomadairement se localise dans des plaques corticales à peine visibles en épifluorescence, mais clairement discernables en TURF. La pénétration réduite peut être observée de manière optimale pour le signal P-B-P-H-G-F-P au niveau des septa, indiqués par les flèches, qui apparaît sous forme de lignes en épifluorescence, mais comme des points en TURF. Ce prochain ensemble d'images montre une comparaison entre l'épifluorescence et l'illumination TURF du composant du complexe TOR, Bit61 chez Saccharomyces visi.

Cette protéine est exprimée faiblement et forme de petites plaques corticales contenant seulement quelques copies de la protéine par plaque. En fluorescence épifluorescente, seules quelques plaques sont visibles au-dessus d'un fond intense, tandis que les plaques peuvent être imagées avec un très bon rapport signal sur bruit en TURB. Une amélioration supplémentaire du contraste de l'image peut être obtenue par diverses étapes de traitement d'image, telles que la soustraction d'images floues par filtre gaussien ou médian, tandis que la soustraction locale du fond élimine le bruit et accentue les structures de forte intensité.

Cela se fait souvent au détriment d'une perte de structures fines et d'une amplification exagérée des régions de forte intensité. Comme l'indique la flèche, une procédure supérieure est la déconvolution 2D, qui peut être réalisée à l'aide de logiciels gratuits ou commerciaux. L'augmentation du contraste après déconvolution est illustrée par ce film en accéléré de GFP RAs deux montrant alternativement des images brutes et des images déconvoluées.

Étant donné que la protéine GFP RAs deux est une protéine à migration rapide, des temps d'acquisition courts sont essentiels pour bien résoudre son comportement dynamique. Le traitement d'image est particulièrement important pour les analyses de colocalisation, comme illustré dans ce film en double fluorescence et en accéléré montrant les protéines chez la levure, FET 3G FP et PMA one RFP.

Les dix premières images représentent des images brutes et les images restantes sont des images traitées. Pour permettre l'analyse, il est essentiel d'augmenter le contraste et de rendre plus nettes les images brutes floues. Turf et frap offrent une combinaison puissante pour étudier la dynamique des protéines corticales. L'utilisation de cette technique dans des cellules B subtilis exprimant G-F-P-M-B-L a permis d'exclure le phénomène de treadmilling comme mécanisme à l'origine de la mobilité observée des zones contenant MBL.

Le graphique chm du patch mobile et le profil d'intensité le long du graphique chm indiqué par la ligne pointillée sont présentés de manière analogue au turf frap de la membrane plasmique de la levure. Une TPAs PMA a révélé les réarrangements lents des protéines de la membrane plasmique de la levure, qui se distribuent en des domaines en réseau couvrant toute la surface cellulaire après son développement. Cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine de la biologie cellulaire des bactéries afin d'explorer le mécanisme de synthèse de la paroi cellulaire chez BA subtilis.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'acquérir des images de type « turf » de micro-organismes tels que les levures et les bactéries, et de la façon dont cette technique peut aider à l'étude des propriétés dynamiques des protéines corticales.