Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l'aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

L’objectif global de cette procédure est d’acquérir des images de haute qualité, par réflexion interne totale, en fluorescence ou en gazon, de micro-organismes porteurs de la paroi cellulaire. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les lamelles et les cellules. La deuxième étape consiste à aligner avec précision la configuration du microscope pour une qualité d’image optimale.

Ensuite, les incidents, les angles et les conditions d’imagerie corrects sont choisis pour l’acquisition d’images ou de vidéos. La dernière étape est le post-traitement d’imagerie des images acquises. En fin de compte, la microscopie sur gazon est utilisée pour étudier la dynamique de la localisation des protéines au niveau du cortex cellulaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux métaux supérieurs comme conventionnel ou confocal pour la microscopie, est que le contraste d’image en microscopie est très élevé, ce qui permet des temps rapides et une faible lumière. En tant que telle, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche membranaire, telles que les mécanismes de ségrégation latérale des protéines, ou la mobilité des protéines membranaires. Les lamelles de recouvrement pour la microscopie du gazon doivent être nettoyées des particules de poussière avant utilisation.

Étant donné que le gazon est sensible aux signaux de fond provenant de la poussière sur une lamelle sale. Une lamelle de protection nettoyée avec moins de fond est nécessaire pour commencer la procédure de nettoyage des lamelles. À l’aide d’une pince, placez les lamelles dans un support en céramique muni d’un couvercle.

Ensuite, remplissez un récipient en verre avec une molaire d’hydroxyde de sodium. Cet hydroxyde de sodium peut être réutilisé plusieurs fois. Placez le support en céramique contenant les lamelles dans l’hydroxyde de sodium et incubez les lamelles pendant deux heures sous une rotation lente et continue.

N’incubez pas pendant plus de huit heures, car cela créerait des lamelles opaques au bout de deux heures, lavez les lamelles à l’eau distillée deux fois pendant cinq minutes à chaque fois sous rotation lente et continue, rangez les lamelles nettoyées dans le support en céramique recouvert à 100 % d’éthanol. Pour préparer les cellules du bacille les plus subtiles pour la microscopie du gazon, diluer à une DO 600 de 0,01 à 0,05 dans cinq millilitres de milieu de croissance approprié et croître jusqu’à la phase exponentielle. Préparez 1,25 % d’aros dans un milieu synthétique, dissolvez la poudre d’aros dans un tube en plastique de 1,5 millilitre à 95 degrés Celsius, puis conservez-la dans un bloc chauffant à 72 degrés Celsius.

Ajoutez une petite goutte d’aros au milieu d’une diapositive et avec une deuxième diapositive, appuyez sur les aros dans un pad plat après au moins deux minutes, séparez soigneusement les diapositives. Faites tourner 500 microlitres de cellules de bacille les plus subtiles dans une micro-centrifugeuse à 12 000 tr/min pendant une minute. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un milieu de 50 microlitres.

Ajoutez deux à quatre microlitres de cellules au centre du tampon aros. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez une lamelle nettoyée du récipient rempli d’éthanol et séchez-la à l’air comprimé. Placez soigneusement la lamelle sur l’échantillon.

Laissez les cellules se stabiliser pendant au moins deux minutes avant la microscopie. Pour une imagerie à long terme, scellez les bords de la lamelle avec le mélange chauffé de vaseline, de lanoline et de paraffine ou l’application Val. Pour préparer les cellules de Saccharomyces visi à la microscopie du gazon, diluez une pré-culture et cultivez-la dans un milieu approprié pendant au moins cinq heures.

En phase exponentielle, prenez une lamelle du récipient rempli d’éthanol et séchez-la à l’air comprimé avec une pipette étalée. Cinq microlitres, conval et une solution ou con a sur le couvercle. Glisser et sécher avec de l’air comprimé sous pression A se lie aux glucides de la paroi cellulaire de la levure et immobilise les cellules de levure.

Ensuite, transférez 4,5 microlitres d’une suspension de cellule de levure d’un côté de la pâte, une lamelle enrobée. Placez soigneusement la lamelle, côté échantillon vers le bas, sur une lame de microscope, en commençant par un bord et en laissant tomber lentement. Cela évitera la formation de bulles d’air.

Laissez les cellules reposer pendant au moins deux minutes avant que la microscopie ne scelle les bords de la lamelle de recouvrement avec l’application val pour une imagerie à long terme. Toutes les expériences présentées dans cette vidéo sont réalisées sur une configuration de gazon personnalisée basée sur un support IMEX entièrement automatisé avec un objectif Olympus 100 x 1,45 NA. Les sources lumineuses utilisées sont des lasers à diode de 75 milliwatts, à semi-conducteurs pompés ou DPSS à 488 nanomètres et 561 nanomètres.

Angles de gazon et fluorescence. La récupération après le photoblanchiment ou la position de la frat peut être ajustée instantanément via deux galvanomètres. Un troisième galvanomètre est utilisé pour basculer entre l’épi, la fluorescence, le frap et le gazon.

Les galvanomètres, qui sont directement contrôlés à partir du logiciel d’acquisition en direct, permettent de mesurer simplement la cinétique de localisation des objets tracés dans les images de gazon collectées avec une caméra CCD EM et un objectif de grossissement deux x devant la caméra. L’acquisition est également contrôlée par le logiciel d’acquisition en direct. Avant de travailler avec le laser, mettez des lunettes de sécurité laser, projetez le laser sur le plafond en mode gazon et calibrez la position zéro degré de sorte que le laser soit en ligne droite.

Avec l’objectif, focalisez le point laser à une taille minimale après un réglage optimal, le profil laser doit former un point bien défini avec une forme grossièrement ronde. Effectuez l’étalonnage avant chaque session. Pour obtenir une qualité d’image optimale, l’alignement du microscope à gazon est essentiel pour le succès de cette procédure.

L’incidence, les angles et les paramètres corrects pour l’acquisition d’images doivent être soigneusement ajustés pour une qualité d’image optimale. Pour commencer l’acquisition d’images, identifiez la position des cellules à l’aide de l’éclairage en fond clair. Les LED rouges sont particulièrement efficaces car elles n’induisent pas de dommages photographiques importants.

Passez à l’éclairage laser et sélectionnez les lasers et les combinaisons de filtres appropriés pour exciter les fluorophores de votre choix, assurez-vous que l’angle du gazon est sous-critique. Sinon, les signaux provenant des protéines de fusion GFP ne seront pas détectés. Trouvez la partie supérieure de la cellule, qui se trouve sur le côté de la cellule faisant face à la lamelle.

Augmentez progressivement l’angle d’incidence du faisceau laser jusqu’à ce que les signaux disparaissent, puis diminuez lentement l’angle jusqu’au point où la fluorescence à la surface de la cellule réapparaît. Ajustez à nouveau la mise au point Z pour une position optimale sur la surface. Des angles de gazon acceptables ne créent aucun halo flou au bord de la cellule, comme l’illustre cet exemple de protéine de levure.

PMA une GFP imagée avec des angles d’incidence décroissants du haut à gauche vers le bas à droite. Les images montrent une perte soudaine du signal à l’angle critique et une diminution progressive des informations structurelles et du rapport signal/bruit, ajustent les intensités laser et le gain de la caméra pour maximiser la plage dynamique. En règle générale, les caméras E-M-C-C-D sont optimales pour détecter des signaux très faibles à des rapports signal/bruit élevés.

La microscopie du gazon est très sensible à la petite taille. Différences de la lamelle de couverture, ce qui fait que seules quelques cellules peuvent être imagées en même temps. Cette image d’une suspension dense de billes fluorescentes est un exemple de champ de vision inégal où seule une partie du champ de vision est nette.

Par conséquent, pour les petites cellules, la région d’acquisition peut souvent être réduite à une sous-région contenant l’objet du choix. Pour les expériences de gazon à double couleur, le saignement des fluorophores doit être minimisé pour les paires R-F-P-G-F-P. Utilisez des filtres d’émission séparés car la RFP est excitée chaque semaine par une lumière de 488 nanomètres.

Un flux de travail typique pour éviter les fuites et l’imagerie en double couleur est présenté ici. Après avoir imager les cellules avec des jeux de filtres séparés, les images sont décentralisées et alignées à l’aide de billes fluorescentes avant d’être fusionnées. Pour l’analyse, un paramètre critique influençant la qualité de l’image est l’alignement laser et un objectif propre. Après avoir aligné le laser et fait la mise au point sur la position Z utilisée pour l’imagerie du gazon, retirez l’échantillon et nettoyez l’objectif de toute l’huile.

L’huile résiduelle entraînera une diffraction de la lumière laser et des taches dans le profil du faisceau. La microscopie du gazon peut être utilisée pour visualiser la distribution des homologues d’actine et des enzymes de la paroi cellulaire dans les cellules bactériennes. Dans ce résultat représentatif, les cellules subtiles du bacille exprimant les fusions GFP de l’actine hoog MBL ou de la transpeptidase PBPH ont été imagées par gazon et épifluorescence régulière.

Les images ici représentent des projections moyennes d’une série chronologique pour indiquer la zone couverte par le motile. Patchs MBL surveillés avec différents modes d’imagerie. Le contour bleu de l’image de superposition indique la limite de la cellule visualisée à partir d’une image en fond clair.

La transpeptidase PBPH exprimée chaque semaine se localise dans des taches corticales qui sont à peine visibles par l’épifluorescence, mais qui peuvent être clairement distinguées par le gazon. La meilleure façon d’observer la pénétration réduite est le signal P-B-P-H-G-F-P au niveau de la SEPTA indiquée par les flèches, qui apparaît sous forme de lignes en épifluorescence, mais sous forme de points dans le gazon. Cette prochaine série d’images montre une comparaison entre l’épifluorescence et l’éclairage du gazon du composant du complexe TOR, bit 61 dans Saccharomyces visi.

Cette protéine est exprimée chaque semaine et forme de petites plaques corticales avec seulement quelques copies de protéines par plaque. En épifluorescence, seules quelques taches sont visibles au-dessus du fort arrière-plan, tandis que les taches peuvent être imagées avec un très bon rapport signal/bruit dans le gazon. Une amélioration supplémentaire du contraste de l’image peut être obtenue grâce à diverses étapes de traitement d’image, telles que la soustraction d’images floues gaussiennes ou médianes, tandis que la soustraction locale de l’arrière-plan supprime le bruit et accentue les structures de haute intensité.

Cela se fait souvent au prix d’une perte de structures fines et d’une amplification exagérée des régions de haute intensité. Comme l’indique la flèche, une procédure supérieure est la déconvolution 2D, qui peut être effectuée avec des progiciels gratuits ou disponibles dans le commerce. L’augmentation du contraste après la déconvolution est illustrée par cette vidéo en accéléré de GFP RA deux qui montre une alternance d’images brutes et de gazon décentralisé.

Étant donné que la GFP RAs deux est une protéine se déplaçant rapidement, il est important de résoudre des temps d’acquisition rapides. Son comportement dynamique. Le traitement d’image est particulièrement important pour les analyses de colocalisation, comme illustré dans ce film double couleur en accéléré de protéines de levure, FET 3G FP et PMA one RFP.

Les 10 premières images représentent des images brutes et les images restantes sont des images décentralisées Pour rendre l’analyse possible, il est essentiel de maximiser le contraste et d’affiner les images brutes floues. Le gazon et le frap offrent une combinaison puissante pour étudier la dynamique des protéines corticales. L’utilisation de cette technique dans des cellules B subtiles exprimant G-F-P-M-B-L a exclu le tapis roulant comme mécanisme de la motilité observée des plaques contenant des MBL

Le graphique chm de la plaque mobile et le profil d’intensité le long du graphique chm indiqué par la ligne pointillée sont représentés de la même manière que la membrane plasmique de levure. Un TPAs PMA a révélé les réarrangements lents des protéines de la membrane plasmique de levure, qui se distribuent dans des domaines de type réseau couvrant toute la surface cellulaire après son développement. Cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine de la biologie cellulaire des bactéries pour explorer le mécanisme de synthèse de la paroi cellulaire chez BA subtilis.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’acquérir des images de micro-organismes comme les levures et les bactéries, et comment cette technique peut aider à étudier les propriétés dynamiques des protéines corticales.