Microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour la visualisation d’événements exocytaires

Commencez avec une parabole à fond de verre contenant des neurones corticaux embryonnaires sur une platine de microscope à fluorescence à réflexion interne totale ou TIRF.

Ces neurones expriment une protéine fluorescente verte sensible au pH ou un marqueur de vésicule marqué par la GFP qui devient fluorescent dans le pH extracellulaire neutre mais reste non fluorescent dans les vésicules acides.

Lors de la fusion des vésicules avec la membrane plasmique, l’exposition au pH extracellulaire induit la fluorescence, marquant l’événement d’exocytose.

Sélectionnez l’objectif et réglez l’indice de réfraction pour qu’il corresponde au neurone.

Dirigez le faisceau laser à un angle par rapport au verre, ce qui provoque une réflexion interne totale et génère une onde évanescente. Cette onde excite sélectivement les marqueurs GFP près de la membrane plasmique.

Réglez la profondeur de pénétration TIRF pour exclure les marqueurs GFP au-dessus du champ évanescent.

Tout d’abord, utilisez un éclairage d’épifluorescence à champ large pour localiser les neurones exprimant la GFP.

Ensuite, passez à l’éclairage TIRF pour une excitation spécifique à la membrane.

Acquérez des images en accéléré pour enregistrer l’événement de fusion des vésicules et visualiser l’exocytose.

Après avoir configuré le microscope TIRF et l’échantillon et trouvé un plan focal neuronal selon le protocole de texte, démarrez le logiciel laser et connectez-vous au logiciel de contrôle laser. Réglez l’éclairage sur champ large et sélectionnez l’objectif. Réglez ensuite l’indice de réfraction de l’échantillon et ajustez l’intensité du laser en décochant TTL pour le laser 491.

L’optimisation des paramètres d’imagerie est importante lors de l’imagerie de vésicules exocytaires intactes au sol pour éviter la dérive de la mise au point et la phototoxicité tout en produisant des images dont le rapport signal/bruit est élevé et qui permet l’analyse.

Réglez le curseur sur 100, puis rabaissez-le à une valeur comprise entre 20 et 40. Vérifiez ensuite à nouveau la durée de vie. Ensuite, concentrez-vous à nouveau sur l’échantillon en éclairage en lumière transmise.

Ensuite, dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez l’éclairage laser 491 et ouvrez l’obturateur. Placez le condenseur à l’envers sur le banc optique afin de ne pas rayer l’objectif. Ajustez avec précision le point focal du laser au plafond.

Et avec le condenseur retiré, centrez le point au centre du diaphragme à champ fermé. Remplacez ensuite le condenseur. Et dans le logiciel TIRF, réglez la profondeur de pénétration à 110 nanomètres. Passez ensuite de l’éclairage à grand champ au mode d’éclairage TIRF pour l’imagerie.

Maintenant, à l’aide de l’épifluorescence à champ large, trouvez les cellules exprimant le florin VAMP2 à travers les oculaires. Ensuite, pour réduire le photoblanchiment et la phototoxicité, ajustez les paramètres d’imagerie pour maximiser le rapport signal/bruit et la plage dynamique en utilisant un temps d’exposition minimal et une intensité laser. Réglez l’autofocus continu par cellule. Acquérez ensuite un ensemble d’images en accéléré avec une acquisition toutes les 0,5 seconde pendant 5 minutes.