Pourquoi la microscopie TIRF améliore-t-elle la validation des cibles dans les études sur l'exocytose neuronale ?

La microscopie TIRF excite sélectivement les fluorophores situés près de la membrane plasmique, permettant la visualisation directe des événements de fusion des vésicules. Cela fournit des informations mécanistiques sur les cibles régulant l'exocytose, soutenant ainsi la validation fonctionnelle dans des modèles neuronaux pertinents pour les maladies.

Comment l'isolement de la membrane plasmique comme plan d'imagerie soutient-il les objectifs du pipeline de découverte ?

En limitant l'excitation à l'onde évanescente, la microscopie TIRF isole les événements proches de la membrane, réduisant le fond cytoplasmique. Cela augmente la spécificité du test pour l'exocytose, permettant des lectures plus claires dans les flux de travail de découverte précoce.

Quelles mesures quantitatives l'imagerie TIRF en temps réel permet-elle pour l'analyse de l'exocytose ?

L'imagerie en laps de temps en microscopie de fluorescence par réflexion totale interne permet la mesure de la fréquence, du moment et de la distribution spatiale des événements d'exocytose. Ces données quantitatives permettent l'analyse cinétique et l'évaluation de l'effet de composés dans le cadre de campagnes de criblage.

Pourquoi la réplication et la standardisation des paramètres sont-elles importantes pour la collaboration interfonctionnelle dans les tests basés sur l'imagerie ?

Des paramètres d'imagerie constants et la réplication assurent la fiabilité et la comparabilité des données entre utilisateurs et expériences. Cela permet une mise en œuvre standardisée des tests dans des projets de découverte collaboratifs.

Quelles sont les capacités d'analyse statistique nécessaires pour interpréter les données d'exocytose dérivées de la microscopie TIRF avant la mise en œuvre ?

Les équipes doivent être en mesure d'analyser la fréquence, le moment et la répartition des événements à l'aide de tests statistiques appropriés. Cela permet de prendre des décisions fondées sur les données concernant la modulation ciblée ou les effets des composés dans les modèles neuronaux.

Microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour la visualisation d’événements exocytaires

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurosciences

0 vues • 3:54 min • June 17th, 2025

Commencez avec une parabole à fond de verre contenant des neurones corticaux embryonnaires sur une platine de microscope à fluorescence à réflexion interne totale ou TIRF.

Ces neurones expriment une protéine fluorescente verte sensible au pH ou un marqueur de vésicule marqué par la GFP qui devient fluorescent dans le pH extracellulaire neutre mais reste non fluorescent dans les vésicules acides.

Lors de la fusion des vésicules avec la membrane plasmique, l’exposition au pH extracellulaire induit la fluorescence, marquant l’événement d’exocytose.

Sélectionnez l’objectif et réglez l’indice de réfraction pour qu’il corresponde au neurone.

Dirigez le faisceau laser à un angle par rapport au verre, ce qui provoque une réflexion interne totale et génère une onde évanescente. Cette onde excite sélectivement les marqueurs GFP près de la membrane plasmique.

Réglez la profondeur de pénétration TIRF pour exclure les marqueurs GFP au-dessus du champ évanescent.

Tout d’abord, utilisez un éclairage d’épifluorescence à champ large pour localiser les neurones exprimant la GFP.

Ensuite, passez à l’éclairage TIRF pour une excitation spécifique à la membrane.

Acquérez des images en accéléré pour enregistrer l’événement de fusion des vésicules et visualiser l’exocytose.

Après avoir configuré le microscope TIRF et l’échantillon et trouvé un plan focal neuronal selon le protocole de texte, démarrez le logiciel laser et connectez-vous au logiciel de contrôle laser. Réglez l’éclairage sur champ large et sélectionnez l’objectif. Réglez ensuite l’indice de réfraction de l’échantillon et ajustez l’intensité du laser en décochant TTL pour le laser 491.

L’optimisation des paramètres d’imagerie est importante lors de l’imagerie de vésicules exocytaires intactes au sol pour éviter la dérive de la mise au point et la phototoxicité tout en produisant des images dont le rapport signal/bruit est élevé et qui permet l’analyse.

Réglez le curseur sur 100, puis rabaissez-le à une valeur comprise entre 20 et 40. Vérifiez ensuite à nouveau la durée de vie. Ensuite, concentrez-vous à nouveau sur l’échantillon en éclairage en lumière transmise.

Ensuite, dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez l’éclairage laser 491 et ouvrez l’obturateur. Placez le condenseur à l’envers sur le banc optique afin de ne pas rayer l’objectif. Ajustez avec précision le point focal du laser au plafond.

Et avec le condenseur retiré, centrez le point au centre du diaphragme à champ fermé. Remplacez ensuite le condenseur. Et dans le logiciel TIRF, réglez la profondeur de pénétration à 110 nanomètres. Passez ensuite de l’éclairage à grand champ au mode d’éclairage TIRF pour l’imagerie.

Maintenant, à l’aide de l’épifluorescence à champ large, trouvez les cellules exprimant le florin VAMP2 à travers les oculaires. Ensuite, pour réduire le photoblanchiment et la phototoxicité, ajustez les paramètres d’imagerie pour maximiser le rapport signal/bruit et la plage dynamique en utilisant un temps d’exposition minimal et une intensité laser. Réglez l’autofocus continu par cellule. Acquérez ensuite un ensemble d’images en accéléré avec une acquisition toutes les 0,5 seconde pendant 5 minutes.