Microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour la visualisation d’événements exocytaires

Commencez avec une parabole à fond de verre contenant des neurones corticaux embryonnaires sur une platine de microscope à fluorescence à réflexion interne totale ou TIRF.

Ces neurones expriment une protéine fluorescente verte sensible au pH ou un marqueur de vésicule marqué par la GFP qui devient fluorescent dans le pH extracellulaire neutre mais reste non fluorescent dans les vésicules acides.

Lors de la fusion des vésicules avec la membrane plasmique, l’exposition au pH extracellulaire induit la fluorescence, marquant l’événement d’exocytose.

Sélectionnez l’objectif et réglez l’indice de réfraction pour qu’il corresponde au neurone.

Dirigez le faisceau laser à un angle par rapport au verre, ce qui provoque une réflexion interne totale et génère une onde évanescente. Cette onde excite sélectivement les marqueurs GFP près de la membrane plasmique.

Réglez la profondeur de pénétration TIRF pour exclure les marqueurs GFP au-dessus du champ évanescent.

Tout d’abord, utilisez un éclairage d’épifluorescence à champ large pour localiser les neurones exprimant la GFP.

Ensuite, passez à l’éclairage TIRF pour une excitation spécifique à la membrane.

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