Les changements d'équilibre dans la structure de l'ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer comment les molécules d’ARN se replient en utilisant l’empreinte des radicaux hydroxyles. Ceci est réalisé par le marquage final, la purification du gel et le pré-repliement de l’ARN, ce qui garantit l’intégrité de confirmation de l’ARN avant le repliement médié par le magnésium, comme étape suivante, les réactifs Fenton sont mélangés pour générer des radicaux hydroxyles, qui peuvent ensuite cliver le squelette de l’ARN en fonction de son accessibilité au solvant. Ensuite, les produits de clivage de l’ARN sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant, et visualisés par autoradiographie.

Les intégrales de bande sont quantifiées par un logiciel d’analyse d’empreinte semi-automatisé. L’objectif ultime est de générer des isothermes de repliement reflétant la formation de la structure tertiaire de l’ARN. Ceci est accompli en mettant à l’échelle les intégrales de bande normalisées à la saturation fractionnelle.

Les isothermes peuvent ensuite être ajustés à l’équation de colline. Le principal avantage de l’empreinte hydroxy est que vous obtenez des informations sur la structure tertiaire de l’ARN à l’aide de produits chimiques peu coûteux en raison de l’activité plus élevée des radicaux hydroxyles de petite taille. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale de l’ARN.

Par exemple, comment les ribosomes utilisent-ils des ions métalliques pour atteindre leur confirmation active ? L’empreinte des radicaux hydroxyles peut être utilisée pour comprendre les principes fondamentaux de la spécificité et de la reconnaissance de l’ARN. En plus de révéler des informations sur la structure tertiaire de l’ARN, cette méthode peut être utilisée pour déterminer les sites de liaison précis des protéines dans l’ARN ou dans les molécules d’ADN.

Les défis majeurs de cette méthode sont d’empêcher la dégradation de l’échantillon par la ribonucléase et d’optimiser la concentration en fer afin d’obtenir la bonne quantité de clivage de l’ARN. De plus, l’analyse détaillée des intervalles de bande peut être assez délicate. Le principal avantage de cette vidéo est d’aider le public à comprendre les étapes de planification et l’exécution réussie de l’expérience d’empreinte de radical hydroxylique Avant le début de ce protocole, préparez toute l’empreinte dans les réactifs comme décrit dans le protocole écrit.

Accompagnant cette vidéo, l’ARN peut être produit par les quatre DFO apparentés et étiquetés comme indiqué ici. Purifier l’ARN marqué radioactivement à l’aide d’électrophérèse sur gel dénaturant. Récupérer l’ARN purifié par deux extractions ultérieures sur gel à l’aide d’acétate de sodium 0,3 molaire.

Ensuite, précipitez l’ARN en mélangeant 0,5 millilitre de solution aqueuse avec un millilitre d’éthanol. Incuber le mélange pendant une minute sur de la glace carbonique Après avoir essoré l’échantillon, jetez le supinate. Lavez la pastille d’ARN avec de l’éthanol à 70 %.

Retirez le supinate après une centrifugation supplémentaire et séchez le granulé sous vide. Ensuite, dissolvez les échantillons d’ARN purifiés marqués au P 32. Dans 330 microlitres de tampon de réaction unique, pipetez 30 microlitres de la solution d’ARN dans un nouveau tube de réaction.

Précipitez l’ARN avec de l’éthanol, puis séchez la pastille sous vide une fois séchée, cette pastille peut être utilisée pour générer l’échelle de référence comme décrit dans la procédure écrite pour naturer la solution d’ARN tamponnée restante en chauffant à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Appelez les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes et poursuivez avec une rotation rapide pour ramener le condensat en solution. Pour commencer l’expérience d’empreinte, installez 27 tubes de réaction pour suffisamment d’échantillons pour remplir un gel d’électrophorèse de 30 puits.

Après avoir inclus les échelles et le témoin clivé, déterminez les concentrations finales de magnésium et de fer de manière à ce qu’elles soient uniformément espacées sur une échelle logarithmique sur plusieurs ordres de grandeur autour du point médian de titrage La préparation des ions magnésium en une seule fois le tampon de réaction est décrite séparément dans le texte. Incuber les solutions d’ARN et d’ions magnésium à 50 degrés Celsius pendant cinq minutes. Mélangez ensuite 10 microlitres de la solution d’ARN avec 90 microlitres de la quantité correspondante de solution de magnésium et de fer.

Pour atteindre un volume final de 100 microlitres, incubez chaque mélange pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius. Par la suite, laissez les solutions s’équilibrer à 25 degrés Celsius pendant une heure pendant que le repliement de l’ARN se produit. Comme pendant ce temps, immédiatement avant d’initier l’empreinte du radical hydroxyle en réaction, préparez le mélange de réaction fantôme comme décrit dans le protocole écrit.

Préparez la réaction de peroxydation en pipetant deux gouttelettes d’un microlitre de fer, d’EDTA, d’ascorbate de sodium et de peroxyde d’hydrogène en haut à l’intérieur du tube réactionnel contenant la solution d’ARN afin que les gouttelettes ne se touchent pas. Démarrez la réaction d’empreinte en mélangeant vigoureusement. Après 15 secondes, arrêtez la réaction en ajoutant 300 microlitres d’éthanol froid pur.

Tournez les tubes trois à cinq fois. Enfin, précipitez, lavez et séchez la pastille comme cela a été fait précédemment comme alternative à la réaction oxydative, la réaction hydroxyle oxydative serait effectuée en ajoutant cinq microlitres du mélange de réaction Fenton fraîchement préparé aux échantillons. Incuber la réaction oxydative pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite 300 microlitres d’éthanol froid pur pour éteindre la réaction et mélangez en tournant les tubes. Encore une fois, précipitez. Lavez et séchez le granulé à la fin de la réaction oxydative ou oxydative.

Dissoudre les granules d’ARN séchées dans huit microlitres de colorant de chargement de gel deux. Confirmez que l’ARN marqué au P 32 est remis en suspension à l’aide d’un compteur geer pour préparer un gel de séquençage dénaturant à 8 % de poly acrylamide conformément aux protocoles standard. À l’aide d’un peigne de 30 puits, chargez les échantillons, y compris deux références et un contrôle clivé.

Séparez les fragments d’ARN à 60 à 75 watts pendant deux heures et demie. Exposez le gel séché à un écran phospho de stockage pendant la nuit. Scannez l’écran phospho avec un système d’imagerie pour une autoradiographie sans film.

Transférez ensuite le fichier d’image du gel sur l’ordinateur pour analyse. Pour commencer l’analyse des données, ouvrez Safa et un logiciel open source pour l’ajustement et la quantification d’une seule bande. Chargez la séquence d’ARN sous la forme d’un fichier TXT à points, suivie de l’image du gel sous forme de fichier gel à points.

Définissez les voies et ajustez les intensités des bandes. Ensuite, choisissez une voie d’ancrage et effectuez une attribution d’alignement de gel des bandes aux nucléotides se produit en référence à l’échelle de digestion des ARN T. Quantifiez l’intensité des bandes et utilisez la fonction de tracé de couleur de la barre oblique de normalisation pour normaliser et attribuer des résidus potentiellement invariants.

Enregistrez la sortie sous forme de fichier txt. SFA produit une feuille de calcul contenant des colonnes, représentant des couloirs sur le gel et des lignes représentant les intégrales de bande individuelles correspondant au fragment d’ARN. Tout d’abord, les sites de protection qui présentent un changement notable dans l’accessibilité au solvant doivent être identifiés en comparant le profil de protection dérivé de l’échantillon sans ions magnésium au profil de la concentration en ions magnésium du point final.

Plus la valeur est faible, plus le nucléotide est protégé contre l’attaque des radicaux hydroxyles et vice versa. Ensuite, créez des courbes de transition de bande, des intensités individuelles ou des groupes de nucléotides en fonction de la concentration en magnésium-fer à l’aide d’un tableur et mettez individuellement à l’échelle ces transitions à la fonction de saturation fractionnaire, comme décrit dans la partie texte de ce protocole. Comme dernière étape, ajustez les données à l’équation de Hill.

Cette analyse évalue la transition vers la saturation fractionnelle, détermine le point médian de la transition et fournit un test phénoménologique pour déterminer si une transition est sigmoïdale démontrée. Voici les résultats représentatifs des expériences d’empreinte du radical hydroxyle P quatre P six ARNRi. Les isothermes ont été dérivées des gels de séquençage analysés par Safa, puis ajustées comme décrit dans la section d’analyse.

L’image en gel indique que le clivage de fond est minime et que l’affectation d’un seul nucléotide est possible grâce à des bandes bien définies dans la voie T un. La fragmentation de l’ARN induite par le radical hydroxyle est bien au-dessus du niveau de référence. La transition d’ions magnésium faibles à élevés est sélectivement associée à une intensité décroissante des individus et des groupes de bandes, indiquant la formation d’ARN.

La protection de la structure tertiaire fait référence à un seul ou à des groupes de nucléotides contigus dont les changements de clivage concomitants Les intensités de bande sont quantifiées et normalisées par l’analyse de safran. Le résultat est un graphique thermique visualisant le degré de protection contre les radicaux hydroxyles. La transition de couleur décrit le changement d’accessibilité lors de l’ajout de magnésium et de fer, le blanc au rouge montre des nucléotides plus accessibles, tandis que le blanc au bleu montre des nucléotides plus protégés.

Chaque degré d’ombrage est associé à une valeur numérique, qui peut être tracée sous la forme d’une courbe de protection et analysée par un modèle de liaison tel que l’équation de Hill. Dans cet exemple, la constante de dissociation à l’équilibre de affilié à la protection 1 5 3 à 1 5 5 est à peu près le double de celle de la valeur correspondante de la protection 1 6 3 à 1 6 4. Cette expérience d’empreinte de radical hydroxy peut être réalisée en un jour et demi si elle est effectuée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de porter des gants et une blouse de laboratoire pour éviter toute contamination par les ARN. De plus, la concentration finale en fer dépend du système expérimental. Par conséquent, nous vous recommandons d’effectuer une expérience dose-réponse avant le footprinting en suivant cette procédure.

D’autres méthodes, telles que l’empreinte radicalaire hydroxyle résolue en temps, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, à quel moment critique les molécules d’ARN atteignent-elles une confirmation mal repliée ou active après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale pour explorer les interactions moléculaires tertiaires inter et intermédiaires des acides nucléiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la formation de la structure tertiaire des molécules d’ARN. N’oubliez pas que le caate et le phosphore de deuxième stade sont des précautions dangereuses, telles que le port de gants et de lunettes de protection, ainsi que l’utilisation d’un écran en plexiglas sont recommandés lors de l’exécution de cette procédure.