Name: Les changements déquilibre dans la structure de lARN de surveillance par peroxydation et oxydatif Hydroxyl Footprinting Radical (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Découvrez le footprinting radical hydroxyle pour quantifier la formation de la structure tertiaire de l'ARN dépendante du Mg(II). Cette méthode utilise le marquage d'extrémité et l'électrophorèse pour analyser l'accessibilité au solvant.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health RO1-GM085130 et la National Science Foundation MCB0929394. Nous remercions le Dr Marion Schmidt pour son hospitalité et pour nous permettre de filmer dans son laboratoire.

1. Préparation des réactifs Footprinting <ol><li> Préparer un tampon de réaction 10x contenant 100 mM cacodylate de sodium, EDTA 1 mM, et 1 M KCl. Ajuster le pH à 7,4. Filtrer le tampon en utilisant un dispositif de filtre acétate de 0,2 pM (Nalgene). Remarque: ne pas ARN pipette directement dans la mémoire tampon 10x. </li><li> Préparer le mélange réactif de titrage pour chaque réaction, comme indiqué dans le tableau 1. Le volume du mélange de titration (1x tampon et Mg (II) à la concentration souhaitée) doit être de 90 ul, avant d'ajouter 10 ul d'ARN dans un tampon de 1x. </li><li> Préparer un tampon de digestion RNAse T1 contenant de l'urée 6.63M, citrate de sodium 20 mM, 1 mM EDTA, 0,25 pg / ul ARNt, cyanol xylène 0,025%, et le bleu de bromophénol 0,025%. Ce tampon peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois. </li><li> La réaction de Fenton nécessite fraîchement préparés solutions aqueuses de 250 mM de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA et 500 mM de sodium L-ascorbate. Les concentrations indiquées dans le chapitre 10.5 sont optimales pour des expériences de l'équilibre dans un tampon de cacodylate de sodium, comme cela ne veut pas piéger les radicaux et divers concentrations en ions divalents. </li><li> Réactifs pour la réaction empreinte (1.5.2) peroxydante (1.5.1) et oxydante. <ol><li> La réaction de Fenton peroxydante nécessite fraîchement préparés solutions aqueuses de 100 mM de Fe-EDTA et 50 mM de sodium L-ascorbate et de 1,5% H 2 O 2. La solution Fe-EDTA est préparée en mélangeant Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 avec de l'EDTA à avoir 1,1 fois plus de l'EDTA sur le fer. </li><li> Juste avant d'initier la réaction de clivage oxydatif (3.4.2), de créer le mélange réaction de Fenton en combinant 2 pi de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 mm), 2,2 l de EDTA (250 mM), 62,5 ul L-ascorbate de sodium (500 mM), 22,5 pi de tampon de réaction 10x et 135,5 ul de H 2 O pour atteindre les concentrations finales dans le mélange réactionnel empreinte (3.4.2) de 0.10 mM, 0,11 mM et 6,61 mM, respectivement. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de l'ARN pour l'expérience d'empreintes <ol><li> L'ARN peut être produite par la norme de transcription in vitro de 6 modèles de l'ADN ou, si courte que 50 nucléotides, être achetés (par exemple chez Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). Suivez les procédures recommandées pour la propreté de laboratoire afin de maintenir l'intégrité des échantillons d'ARN au cours des expériences empreintes 7. </li><li> La déphosphorylation 8 du transcrit in vitro d'ARN est nécessaire avant d'étiquetage P 32 de l'extrémité 5 'de l'ARN. 10 pmol d'ARN sont marqués aux extrémités par des kinasing 9. La solution devrait être nuageux après inactivation de la phosphatase succès. </li><li> Purifier l'ARN radiomarqué en utilisant l'électrophorèse sur gel dénaturant. L'ARN est récupéré par deux extractions ultérieures gel en utilisant l'acétate de sodium 0,3 M (pH 5,5). L'ARN est précipité en mélangeant 0,5 ml de solution aqueuse à 1 ml d'éthanol et ultérieuresd'incubation de 1 minute sur la glace sèche. Spin échantillon à 4 ° C, 12 500 rpm pendant 0,5 heure. Jeter le surnageant et laver avec de l'éthanol culot d'ARN de 70%. Retirer le surnageant après centrifugation supplémentaire et culot sec dans le vide. </li><li> Dissoudre le 32 P-étiqueté les échantillons d'ARN dans 330 ul de 1x Buffer.Pipet 30 pl de la solution de l'ARN dans un tube de réaction, un précipité avec l'éthanol et de l'ARN à sec dans le vide; garder ce tube pour générer l'échelle de référence (étape 3.5). Dénaturer la solution tamponnée ARN par chauffage à 95 ° C pendant 2 min. Refroidir les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes et donner un tour rapide pour faire baisser les condensats sur les couvercles des tubes dans la solution. </li></ol> 3. L'expérience d'empreintes <ol><li> Le peigne électrophorèse détermine le nombre maximal de points de données par gel analytique. Nous utilisons un peigne à 30 puits. L'échelle de référence occupe 2 puits et le contrôle non clivée. Préparer 27 tubes de réaction. La finale Mg (II) concentrations doivent être espacés uniformément sur une échelle logarithmique couvrant plusieurs ordres de grandeur autour du point médian de titrage. </li><li> Par ailleurs, incuber l'ARN et le Mg (II) des solutions à 50 ° C pendant 5 min. Mélanger 10 ul de la solution d'ARN avec 90 ul de la quantité correspondante de Mg (II) en 1x tampon pour atteindre un volume final de 100 pl. Incuber les solutions pendant 30 min à 50 ° C. </li><li> Laissez les solutions s'équilibrer à 25 ° C pendant 1 heure tout en pliage se produit. </li><li> Peroxydante (3.4.1) ou oxydatif (3.4.2) hydroxyle réaction empreinte radicale. <ol><li> Démarrer la réaction peroxydante en plaçant des gouttelettes de 2 pl Fe-EDTA (100 mm), 2 ul de sodium L-ascorbate (50 mm) et 2 ul H 2 O 2 (1,5%), séparés les uns des autres à l'intérieur haut de la réaction tube contenant la solution d'ARN et de démarrer la réaction empreinte en mélangeant vigoureusement. Arrêter la réaction après 15 secondes en ajoutant 300 ul d'éthanol froid absolu. Tournez les tubes 3-5 fois. Précipité, lavez etsèche le culot comme à l'étape 2.4. </li><li> Démarrez le oxydatif footprintingreaction radical hydroxyle en ajoutant 5 ul du mélange de réaction de Fenton fraîchement préparés (1,6). Incuber pendant 30 min à 25 ° C. Ajouter 300 ul d'éthanol absolu froid pour stopper la réaction et mélanger en tournant les tubes 3-5 fois. Précipité, laver et sécher le culot, comme indiqué dans l'étape 2.4. </li></ol></li><li> Générer un échantillon de référence RNase T1 digérer, conformément aux procédures standard de 10 en utilisant la solution préparée à l'étape 1.3. </li><li> Dissoudre culots d'ARN dans les 8 ul du gel de chargement II colorant (Ambion) et confirmer l'ARN est remis en suspension par l'aide du compteur Geiger. </li><li> Préparer une dénaturation, un gel de polyacrylamide 8% séquençage selon des protocoles standard. 11 Charger les échantillons dont deux références et un contrôle. Séparer des fragments d'ARN à 60 W - 75 W pendant 2,5 heures. Exposer gel séché sur un écran de phosphore de stockage pendant la nuit. Balayage écran phosphorique avec un système d'imagerie pour autoradiographie sans film, par exemple,. Tempête 865 (GE Healthcare) ou Typhoon (GE Healthcare). Transfert de fichier image du gel sur votre ordinateur. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> La réactivité du radical hydroxyle de chaque nucléotide est déterminé par la quantification de l'intensité de chaque bande sur le gel analytique. Téléchargez, installez et ouvert SAFA, un outil facile à utiliser un logiciel open source pour le montage et la quantification seule bande. 12, 13 Suivez les instructions du manuel utilisateur. Brièvement, la charge de la séquence d'ARN sous. Txt suivie par l'image gel comme. Gel de fichier. Ajustez intensités des bandes, de définir les voies, choisissez une voie d'ancrage, et d'effectuer un alignement de gel. Attribution des bandes de nucléotides se produit en référence à l'échelle de digestion RNase T1. Quantifier les intégrales bande et utiliser la fonction de normalisation / colorplot à normaliser et à attribuer des résidus potentiellement invariant. Enregistrez le résultat dans un fichier. Txt. </li><li> SAFA sorties d'un tableur contenant des colonnes représentant voies sur le gel et des lignes représentant l'enINTÉGRÉ densité de la bande des bandes individuelles correspondant au fragment d'ARN. Tout d'abord, identifier les sites de protection qui affichent un changement notable dans l'accessibilité de solvant en comparant le profil de protection dérivée de la non Mg (II) de l'échantillon avec le profil du point de fin de Mg (II) de concentration (50 mM dans notre exemple). La baisse de la valeur, le plus protégé le nucléotide est contre l'attaque des radicaux hydroxyles et vice versa. </li><li> Créer isothermes pliage de la bande normalisée de intégrales ou des groupes de nucléotides par rapport Mg (II) de concentration. Les isothermes sont individuellement mis à l'échelle de la saturation fractionnelle par fi = L + (U - L) • <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> où f représente la densité intégrée de la bande (s) en cours d'analyse, L et U représentent les limites inférieures et supérieures à la transition et <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y"> est la saturation fractionnelle. 14 Les données sont adaptées en utilisant un L non-linéaireprogramme d'analyse de l'Est carrés (Nous utilisons soit l'origine (OriginLab) ou GraphPad (GraphPad Software, Inc.)) à l'équation de Hill (1), <img alt="Équation 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 1"> où K d est la constante de dissociation d'équilibre, [M] correspond à la concentration de la variable qui intervient dans la réaction de repliement, Mg (II) dans cet exemple, et n H est le coefficient de Hill. Cette procédure d'échelles de la transition vers la saturation fractionnelle, détermine son milieu et fournit un test phénoménologique de savoir si une transition est sigmoïde. Isothermes dérivées de gels de séquençage (figure 3A) qui ont été analysés par la SAFA (figure 3B) et ajustement tel que décrit ci-dessus sont présentés dans la figure 3C. Les isothermes de saturation fractionnelle montre la figure 3 ont été générés par l'échelonnement dans un tableur les valeurs générées par la SAFA contre le meilleur ajustement des limites supérieure et inférieure (U et L) en utilisant la fraction équation de valeur = / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La figure 3 montre des résultats représentatifs de P4 à P6 ARN • expériences empreinte OH. L'image du gel (à gauche) indique que le clivage de fond) est minime (voie de droite), b) l'affectation simple nucléotide est possible grâce à des bandes bien définies dans la voie de T1 (T1 RNase clive à chaque G), et c) du radical hydroxyle la fragmentation induite par l'ARN est bien au-dessus de fond. La transition de faible à haute Mg (II) est affiliée à diminuer la densité intégrée de la bande individuels et les groupes de bandes indiquant la formation d'ARN structure tertiaire. Simple ou des groupes de nucléotides contigus dont le clivage des changements de façon concomitante sont considérés comme une «protection». Les protections • OH caractéristique du Mg (II) la médiation de pliage de l'ARN P4-P6 correspondent étroitement aux régions inaccessibles solvant de la molécule observée dans sa structure cristalline. 15 Plié molécules d'ARN c une ont des degrés très différents (à savoir, comment proche de fond le déclin bande de densité) de protection contre les contacts tertiaires qui n'ont pas été corrélés avec phénomène structurel ou dynamique claire. Ainsi, certaines molécules d'ARN se montrent bien défini des transitions structurelles, comme le montre la figure 3, et d'autres non. Intensités des bandes sont quantifiés et normalisés par SAFA 12 analyse (figure 3B). La sortie est un "thermique" complot visualiser le degré relatif de protection contre • OH. La transition de couleur décrit les changements d'accessibilité lors de Mg (II) plus. Blanc à rouge ou bleu montre nucléotides plus accessible ou plus protégés, respectivement. Chaque degré d'ombrage est affilié à une valeur numérique qui peut être tracée comme une courbe de protection (figure 3C) et analysées par un modèle de liaison tels que l'équation de Hill (1). La constante d'équilibre de dissociation affilié à la protection de 153 à 155 est à peu près le double de la valeur correspondante de protection 163-164. ONTENU "&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Production de radicaux hydroxyles et P4-P6 pliage ARN. A) le Fe (II) catalyse la production de radicaux hydroxyles par le peroxyde d'hydrogène. L'ascorbate réduit le Fe (III) Retour au fer ferreux. B) En l'absence de Mg (II), aucune structure P4-P6 tertiaire est formé, ce qui permet de pénétrer les radicaux hydroxyles et cliver toutes les positions armature accessible. L'addition de Mg (II) initie pliage de P4 à P6, permettant seulement l'épine dorsale accessible au solvant à être clivée par les radicaux hydroxyles. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma pour une expérience empreinte radical hydroxyle. Un Dephophorylation) et 32 P-5'-end d'étiquetage de l'ARN. B) Purification de 32 P-ARN marqué sur un gel de polyacrylamide dénaturant. C) L'excision de la bande de l'ARN, après l'extraction d'ARN, et précipitation à l'éthanol. D) et Prefoldingrepliement de l'ARN. E) Ajout d'fraîchement préparés mélange réaction de Fenton pour générer les radicaux hydroxyles. F) la séparation fragment d'ARN par électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide. G) La quantification de fragments d'ARN par un logiciel de SAFA. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Analyse de fragments d'ARN après réaction empreinte peroxydante Fenton. (A) L'ARN a été exposé à des radicaux hydroxyles et les produits de clivage ont été résolues en utilisant l'électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE). La photo montre des produits de clivage peroxydante avec une concentration croissante de Mg (II). Voies de référence et de contrôle sont étiquetés. Ce fichier image est l'entrée pour le programme SAFA, qui quantifie le volume de chaque bande. (B) Le «thermique» intrigue générée par la SAFA. (C) Un tableur des valeurs relatives densité de la bande intégrés à la sortie du numéro de nucléotides SAFA est analysée par un modèle de liaison tels que la Colline equatisur (1). Régions de protection ont été choisis en fonction de l'augmentation de la densité de la bande intégrale comme une fonction de Mg (II) de concentration. Le Kd est le Mg (II) la concentration à laquelle la moitié de l'ARN est plié sur le site à surveiller. Le coefficient de Hill, n H, est une mesure de la pente de la courbe qui donne des informations sur la coopérativité de liaison et fournit une estimation plus faible pour le nombre d'ions magnésium impliquée dans le pliage de ce site particulier. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Volumes Représentant pour générer des échantillons d'ARN contenant différents Mg (II) sur les concentrations.

<ol><li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+%22footprinting%22%3A+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%28II%29-ethylenediaminetetraacetic+acid+catalyzed+cleavage+of+RNA+and+DNA+oligonucleotides%3A+similar+reactivity+toward+single-+and+double-stranded+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms.</a> Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+higher+order+folding+of+a+catalytic+RNA+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule.</a> Science. 251, 401-407 (1991).</li>
<li>Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+folding+at+millisecond+intervals+by+synchrotron+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting.</a> Science. 279, 1940-1943 (1998).</li>
<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+footprinting%3A+a+high-resolution+method+for+mapping+protein-DNA+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts.</a> Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementing+global+measures+of+RNA+folding+with+local+reports+of+backbone+solvent+accessibility+by+time+resolved+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting.</a> Methods. 49, 142-147 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).</li>
<li>Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+endoribonuclease+activity+of+the+Tetrahymena+ribozyme%3A+enhanced+cleavage+of+certain+oligonucleotide+substrates+that+form+mismatched+ribozyme-substrate+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes.</a> Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).</li>
<li>Knapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+approaches+to+probing+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).</li>
<li>Slatko, B. E., Albright, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+gel+electrophoresis+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Denaturing gel electrophoresis for sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).</li>
<li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAFA%3A+semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> RNA. 11, 344-354 (2005).</li>
<li>Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+%2AOH+radical+footprinting+data+using+SAFA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li>
<li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li>
<li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain%3A+principles+of+RNA+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li>
<li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nucleic+acids+footprinting%3A+thermodynamic+and+kinetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li>
<li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+RNA+compaction%3A+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li>
<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+DNase+footprint+titration%3A+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Hydroxyle empreinte radicale est un outil précieux pour évaluer la surface accessible au solvant des acides nucléiques. La formation quantitative et qualitative de la structure tertiaire 14 peut être suivie en fonction de paramètres tels que le type et la concentration d'ions, pH, température, protéines de liaison ou de pliage des co-facteurs. La combinaison convaincante d'un protocole simple et peu coûteux et l'accessibilité résultant de solvant et de l'information pliage sur un seul niveau nucléotidique ren...

<table><tbody><tr><td>Nom</td><td>Société</td><td>Réf.</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium (Attention ! Toxique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée au DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate de sodium-L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d'hydrogène (30 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

les changements d&#39;équilibre dans la structure de l&#39;arn de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» hydroxyl footprinting radical

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

Molécules d&#39;ARN jouent un rôle essentiel dans la biologie. En plus de transmettre l&#39;information génétique, l&#39;ARN peut incorporer uniques structures tertiaires remplir un rôle de régulateur biologiques spécifiques, liant ou de catalyseur. Information sur la formation de contacts tertiaire est essentielle pour comprendre la fonction des molécules d&#39;ARN. Les radicaux hydroxyles (OH •) sont des sondes unique de la structure des acides nucléiques en raison de leur grande réactivité et une petite taille. 1 Lorsqu&#39;il est utilisé comme une sonde d&#39;empreinte, les radicaux hydroxyles cartographier la surface accessible au solvant de l&#39;squelette phosphodiester de l&#39;ADN et l&#39;ARN 1 2 avec aussi fine que la résolution seul nucléotide. Hydroxyle empreinte radical peut être utilisé pour identifier les nucléotides au sein d&#39;une surface de contact intermoléculaires, par exemple en ADN-protéines et d&#39;ARN une teneur en protéines complexes. Equilibre et cinétique 3 4 transitions peut être déterminé en effectuant des empreintes hydroxyles radicaux en fonction d&#39;une solutisur la variable ou l&#39;heure, respectivement. Une caractéristique clé de l&#39;empreinte est que l&#39;exposition limitée à la sonde (par exemple, &quot;la cible unique cinétiques») des résultats de l&#39;échantillonnage uniforme de chaque nucléotide du polymère. 5 Dans cet article, vidéo, nous utilisons le domaine P4-P6 du ribozyme de Tetrahymena pour illustrer la préparation des échantillons d&#39;ARN et la détermination d&#39;un Mg (II)-médiée isothermes pliantes. Nous décrivons l&#39;utilisation du protocole bien connu l&#39;empreinte de radicaux hydroxyles qui nécessite H 2 O 2 (nous appelons cela la &quot;peroxydante« protocole) et une valeur, mais pas très connu, alternative qui utilise naturellement dissous O 2 (nous appelons cela «l&#39; oxydatif &quot;protocole). Un aperçu de la réduction des données, la transformation et les procédures de l&#39;analyse est présentée.

Ce protocole décrit comment quantifier les Mg (II)-dépendante de la formation de l&#39;ARN structure tertiaire par deux méthodes d&#39;empreinte radical hydroxyle.

Les changements d&#39;équilibre dans la structure de l&#39;ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical

Les molécules d'ARN jouent un rôle essentiel en biologie. En plus de transmettre l'information génétique, l'ARN peut se replier en structures tertiaires uniques remplissant...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer comment les molécules d'ARN se replient à l'aide d'une empreinte de radicaux hydroxyles. Cette approche repose sur le marquage en extrémité, la purification sur gel et le pré-repliement de l'ARN, ce qui garantit l'intégrité conformationnelle de l'ARN avant l'étape suivante de repliement induit par le magnésium. Ensuite, les réactifs de Fenton sont mélangés afin de générer des radicaux hydroxyles, capables de cliver la chaîne principale de l'ARN en fonction de son accessibilité au solvant. Puis, les produits de clivage de l'ARN sont séparés par électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie.Les intégrales des bandes sont quantifiées à l'aide d'un logiciel d'analyse de footprinting semi-automatisé. L'objectif ultime est de générer des isothermes de repliement reflétant la formation de la structure tertiaire de l'ARN. Cela est réalisé en ajustant les intégrales des bandes normalisées à la saturation fractionnaire.Les isothermes peuvent ensuite être ajustées à l'équation de Hill. Le principal avantage du footprinting hydroxyle est que vous obtenez des informations sur la structure tertiaire de l'ARN en utilisant des produits chimiques peu coûteux, car les radicaux hydroxyles de petite taille, très réactifs, constituent des sondes idéales pour distinguer les nucléotides accessibles au solvant de ceux qui sont enterrés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale de l'ARN.Par exemple, comment les ribosomes utilisent-ils les ions métalliques pour atteindre leur conformation active ? L'empreinte par radical hydroxyle peut être utilisée pour comprendre les principes fondamentaux de la spécificité et de la reconnaissance de l'ARN. En plus de révéler des informations sur la structure tertiaire de l'ARN, cette méthode peut servir à déterminer précisément les sites de fixation des protéines sur les molécules d'ARN ou d'ADN.Les principaux défis de cette méthode consistent à prévenir la dégradation de l'échantillon par les ribonucléases et à optimiser la concentration en fer afin d'obtenir un niveau approprié de clivage de l'ARN. En outre, l'analyse détaillée des intervalles de bandes peut s'avérer assez délicate. Le principal avantage de cette vidéo est d'aider le public à comprendre les étapes de planification et la réalisation réussie d'une expérience de cartographie par empreintes de radicaux hydroxyles. Avant le début de ce protocole, préparez tous les réactifs nécessaires à la cartographie conformément aux instructions du protocole écrit.Conjointement à cette vidéo, l'ARN peut être produit à partir de quatre DFO apparentés et marqués à l'extrémité comme décrit ci-bas. Purifiez l'ARN marqué radioactivement par électrophorèse sur gel dénaturant. Récupérez l'ARN purifié par deux extractions successives du gel à l'aide d'acétate de sodium 0,3 molaire.Ensuite, précipitez l'ARN en mélangeant 0,5 millilitre de la solution aqueuse avec un millilitre d'éthanol. Incubez le mélange pendant une minute sur de la glace sèche. Après centrifugation de l'échantillon, jetez le surnageant. Lavez le culot d'ARN avec de l'éthanol à 70 %.Éliminer le surnageant après une centrifugation supplémentaire et sécher le culot sous vide. Ensuite, dissoudre les échantillons d'ARN purifiés marqués au P 32. Dans 330 microlitres de tampon de réaction à une fois, pipeter 30 microlitres de la solution d'ARN dans un nouveau tube de réaction.Précipitez l'ARN avec de l'éthanol, puis séchez le culot en vide. Une fois sec, ce culot peut être utilisé pour générer l'échelle de référence comme décrit dans la procédure écrite. Dénaturez la solution d'ARN tamponnée restante en chauffant à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Ramenez les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes, puis effectuez une courte centrifugation pour ramener le condensat en solution. Pour commencer l'expérience d'empreinte, préparez 27 tubes à réaction afin d'obtenir suffisamment d'échantillons pour remplir un gel d'électrophorèse de 30 puits.Après avoir inclus les échelles et le témoin clivé, déterminez les concentrations finales en ions magnésium et fer de manière à ce qu'elles soient espacées uniformément sur une échelle logarithmique, sur plusieurs ordres de grandeur autour du point médian de la titration. La préparation des ions magnésium dans un tampon réactionnel à une fois est décrite séparément dans le texte. Incubez les solutions d'ARN et d'ions magnésium à 50 degrés Celsius pendant cinq minutes. Mélangez ensuite 10 microlitres de la solution d'ARN avec 90 microlitres de la quantité correspondante de solution d'ions magnésium et fer.Pour obtenir un volume final de 100 microlitres, incuber chaque mélange pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius. Ensuite, laisser les solutions s'équilibrer à 25 degrés Celsius pendant une heure, temps durant lequel se produit le repliement de l'ARN. Pendant ce temps, immédiatement avant d'initier la réaction d'empreinte par les radicaux hydroxyles, préparer le mélange de réaction témoin comme décrit dans le protocole écrit.Préparez la réaction de peroxydation en pipetant deux gouttes de deux microlitres chacune d'EDTA ferreux, d'ascorbate de sodium et de peroxyde d'hydrogène en haut de l'intérieur du tube à réaction contenant la solution d'ARN, de sorte que les gouttes ne se touchent pas. Démarrez la réaction de footprinting par un mélange vigoureux. Après 15 secondes, arrêtez la réaction en ajoutant 300 microlitres d'éthanol froid pur.Retournez les tubes trois à cinq fois. Enfin, précipitez, lavez et séchez le culot comme effectué précédemment. En alternative à la réaction oxydative par, la réaction hydroxyle oxydative serait réalisée en ajoutant cinq microlitres du mélange de réaction de Fenton fraîchement préparé aux échantillons. Incubez la réaction oxydative pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius.Ensuite, ajouter 300 microlitres d'éthanol pur et froid pour arrêter la réaction et mélanger en retournant les tubes. Précipiter à nouveau. Laver et sécher le culot une fois la réaction péri-oxidative ou oxydative terminée.Resuspendez les pastilles d'ARN sèches dans huit microlitres de colorant de charge pour gel 2. Vérifiez que l'ARN marqué au P 32 est bien en suspension à l'aide d'un compteur Geiger. Préparez un gel de séquençage dénaturant à 8 % de polyacrylamide selon les protocoles standard. À l'aide d'un peigne à 30 puits, chargez les échantillons, y compris deux références et un témoin clivé.Séparer les fragments d'ARN à 60 à 75 watts pendant deux heures et demie. Exposer le gel séché à un écran phosphorimager pendant la nuit. Analyser l'écran phosphorimager à l'aide d'un système d'imagerie pour une autoradiographie sans film.Ensuite, transférez le fichier image du gel vers l'ordinateur pour analyse. Pour commencer l'analyse des données, ouvrez Safa, un logiciel open source destiné à l'ajustement et à la quantification de bandes uniques. Chargez la séquence d'ARN sous forme de fichier texte (.txt), puis l'image du gel sous forme de fichier (.gel).Définissez les bandes et ajustez les intensités des bandes. Ensuite, choisissez une bande de référence et effectuez une attribution d'alignement sur gel des bandes aux nucléotides en vous référant à l'échelle de digestion d'ARN T1. Quantifiez les intensités des bandes et utilisez la fonction de traçage par couleur ou de normalisation pour normaliser et attribuer les résidus potentiellement invariants.Enregistrez le résultat sous forme de fichier txt. SFA génère un tableau contenant des colonnes, représentant les bandes sur le gel, et des lignes représentant les intégrales individuelles des bandes correspondant au fragment d'ARN. Tout d'abord, les sites protégés qui présentent un changement notable de l'accessibilité au solvant doivent être identifiés en comparant le profil de protection obtenu à partir de l'échantillon sans ion magnésium au profil correspondant à la concentration finale en ion magnésium.Plus la valeur est faible, plus le nucléotide est protégé contre l'attaque des radicaux hydroxyles, et inversement. Ensuite, créez des courbes de transition des bandes, des intensités des nucléotides individuels ou groupés en fonction de la concentration en ions magnésium, en utilisant un format de feuille de calcul ; mettez individuellement à l'échelle ces transitions selon la fonction de saturation fractionnaire, comme décrit dans la partie textuelle de ce protocole. Comme étape finale, ajustez les données à l'équation de Hill.Cette analyse met à l'échelle la transition vers la saturation fractionnelle, détermine le point médian de la transition et fournit un test phénoménologique permettant de vérifier si une transition est sigmoïde. Voici des résultats représentatifs d'expériences d'empreinte par radical hydroxyle sur l'ARNr P quatre P six. Les isothermes ont été obtenus à partir de gels de séquençage analysés par Safa, puis ajustés comme décrit dans la section d'analyse.L'image du gel indique que le clivage de fond est minimal et qu'une attribution au niveau du nucléotide unique est possible grâce à des bandes bien définies dans la piste T. La fragmentation de l'ARN induite par les radicaux hydroxyles est nettement supérieure au niveau du fond. La transition entre faibles et fortes concentrations d'ions magnésium est spécifiquement associée à une diminution de l'intensité de bandes individuelles ou de groupes de bandes, ce qui indique la formation de l'ARN.La protection de la structure tertiaire fait référence à un nucléotide unique ou à des groupes de nucléotides contigus dont le clivage modifie simultanément les intensités des bandes, quantifiées et normalisées par analyse saffer. Le résultat est un graphique thermique visualisant le degré de protection contre les radicaux hydroxyles. La transition de couleur décrit le changement d'accessibilité après l'ajout de fer magnésique : du blanc au rouge indique des nucléotides plus accessibles, tandis que du blanc au bleu indique des nucléotides plus protégés.Chaque degré d'ombrage est associé à une valeur numérique, qui peut être représentée sous forme de courbe de protection et analysée à l'aide d'un modèle de liaison tel que l'équation de Hill. Dans cet exemple, la constante d'association à l'équilibre associée à la protection 1 5 3 à 1 5 5 est approximativement deux fois plus élevée que la valeur correspondante de la protection 1 6 3 à 1 6 4. Cette expérience d'empreinte par radical hydroxyle peut être réalisée en un jour et demi si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de porter des gants et une blouse de laboratoire afin d'éviter toute contamination par les ARN. De plus, la concentration finale en fer dépend du système expérimental. Par conséquent, nous recommandons de réaliser une expérience de réponse à la dose avant la réalisation du footprinting selon cette procédure.D'autres méthodes, telles que l'empreinte du radical hydroxyle résolue en temps réel, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, à quel moment critique les molécules d'ARN atteignent-elles une conformation incorrectement repliée ou active après leur formation ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie structurale pour explorer les interactions tertiaires intermoléculaires ainsi qu'intramoléculaires des acides nucléiques.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer la formation de la structure tertiaire des molécules d'ARN. N'oubliez pas que le caate et l'étape au phosphore présentent des risques ; des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection, ainsi que l'utilisation d'un blindage en plexiglas, sont recommandées lors de la réalisation de cette procédure.

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