Name: Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez l'évaluation de la migration des cellules souches du cancer en utilisant des dispositifs microfluidiques compartimentés et l'imagerie en temps réel. Cette méthode permet d'observer les étapes morphologiques de la migration cellulaire et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles.

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PAC est financée en partie par une subvention du NIH T32 à l&#39;Université de Wisconsin cellules souches Programme de formation (PA Clark). La JSK a été partiellement financé par le professeur HEADRUSH recherche sur le cerveau tumeur, Roger Loff Memorial GBM Research Fund et la Fondation Centraide / United Way recherche sur les tumeurs du cerveau et neurochirurgie Fonds pour l&#39;éducation. JCW et YH sont partiellement pris en charge par NIH NIBIB 1R01EB009103-01.

1. BTSC cellule de dissociation BTSCs proviennent préexistantes cultures cultivées dans un milieu sans sérum de cellules souches tel neurosphères. culture dont on décrit précédemment 10, 11. <ol><li> Préparer une suspension cellulaire à partir BTSC dérivés neurosphères. BTSC neurosphères dérivées sont recueillies dans un tube conique de 15 ml et centrifugé à 900 tours par minute pendant 5 minutes. Plus rapide centrifugation peut cisaillement et / ou d'endommager l'neurosphères. Surnageant est aspiré et la culture de neurosphères est remis en suspension dans 0,5 ml de pré-chauffé Accutase. Cette solution est incubée pendant 5-10 minutes à 37 ° C permet de desserrer les neurosphères. Les cellules sont mécaniquement désagrégé avec 10-20 caresses d'une pipette P100, puis 1,5 ml de milieu de cellules souches est ajouté aux cellules pour neutraliser la Accutase. </li><li> Les BTSCs sont ensuite centrifugés à 1300 rpm pendant 5 minutes, et remis en suspension dans 1 ml de milieu de cellules souches. </li><li> Une aliquote de 50 ul est retiré des suspension et placé dans un microtube pour le comptage des cellules. 50 l de bleu trypan est ajouté au tube Eppendorf et la suspension est placée dans un hémocytomètre pour le comptage des cellules. </li><li> Si nécessaire, après le comptage des cellules, les cellules souches moyen supplémentaire est ajouté à la suspension BTSC pour donner une densité cellulaire de 20.000 cellules vivantes / ul médias. </li></ol> 2. Fabrication de bi-couches su-8 maître et le moulage de PDMS timbre (voir figure 1) Nous utilisons la lithographie optique et la lithographie douce pour la fabrication de SU-8 maître et PDMS timbre, qui sont essentielles pour le montage des dispositifs microfluidiques. Légèrement différent de la procédure standard de 12, notre maître su-8 est composé de deux couches. Les microcanaux 3-um-hauts sont coulés dans la première couche / bas plus tôt dans le processus, alors que les chambres 250-um-hauteur d'ensemencement et de réception sont dans la deuxième couche / supérieur. Pour une connexion correcte entre les deux compartiments de la culture (microcanauxs et chambres), les deux couches doivent être alignées avec précision en position. Cependant, l'épaisseur et l'opacité de la deuxième couche sont assez grands pour bloquer l'alignement fiducial / optique d'accéder aux caractéristiques du fond. Ici, nous concevons des masques avec des marqueurs fiduciaires étant positionné à distance. Ainsi, ces marqueurs dans la première couche peut être sélectivement blindé tout en faisant tourner la seconde couche. En conséquence, les deux couches de fonctionnalités sont réalisés en une seule maître et prêt pour le moulage en bas-relief du timbre en PDMS. <ol><li> Concevoir et préparer deux photo-masques. Un masque constitué de deux marqueurs de référence et un réseau de micro-canaux (400 m de long et 10-50 um de large) de la première couche. Un autre masque est constitué de chambres de réception de l'ensemencement et (2 mm de long et 600 um de large) de la deuxième couche. Les deux masques sont conçus dans Illustrator (Adobe, Californie), imprimée au laser sur films transparents (Pièces métalliques minces, Colorado), nettoyés avec de l'isopropanol et séché à l'air. </li><li> Faire la première couche avecsu-8 photosensible (MicroChem, Massachusetts) selon le manuel produit auprès du fournisseur. Tout d'abord, la couche de spin-plaquette de manipulation (WRS matériaux, Californie) avec du 3-um d'épaisseur de résine photosensible SU-8 (5), suivie de la cuisson douce. La résine photosensible est ensuite exposée aux ultraviolets et durci avec le masque correspondant en gros de contact, suivie de post-cuisson et en développement. </li><li> Spin-couche de la seconde couche de 250 um d'épaisseur SU-8 (2100). Afin d'éviter de photorésist épais de blocage des marqueurs de référence de la première couche, on couvrir ces zones avec du scotch en avant centrifugation de la seconde couche. La bande est ensuite enlevée pour révéler les marqueurs à des fins d'alignement. </li><li> UV-exposer la seconde couche avec le deuxième masque. Avec les repères d'alignement a révélé, il est facile de les aligner sur ceux du second masque à l'aide d'alignement de masque optique. La deuxième couche de résine photosensible est ensuite exposée aux ultraviolets et durci en gros de contact, suivie de post-cuisson et en développement. &lt;/ Li&gt; </li><li> Anti-adhérent manteau du maître abouti. À aider au retrait du PDMS durci, le maître SU-8 peut être silanisée par dépôt en phase vapeur pour rendre la surface d'un revêtement anti-adhérent de type. Il suffit de le placer dans un dessiccateur pendant au moins une heure, avec quelques gouttes d'trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) solution de silane sous vide. </li><li> Mouler PDMS avec le maître. Mélanger la base de prépolymère et guérisseur de PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) en fond de 10:1. Placez-le dans un dessiccateur de dégazage sous vide jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air est visible. Verser le mélange sur le masque et dégazer de nouveau si une nouvelle bulle d'air est introduit. Guérir le moule sur une plaque chauffante niveau pendant 2 heures à 90 ° C. Après refroidissement à température ambiante, relâchez doucement le timbre en PDMS. Ainsi, les chaînes de culture sont gravés dans PDMS et prêt pour l'assemblage de l'appareil. Le maître est réutilisable pour le moulage jusqu'à ce qu'il est fissuré ou usé. Le revêtement anti-adhésif doit être exécutée à nouveau lorsque la viscosité reprend. </li></ol> 3.Assemblée des dispositifs microfluidiques et de culture cellulaire (figure 2) Pour des cellules en culture, dispositif-tampon gravé PDMS est fixée à une lamelle de verre pour former des canaux fermés. Entrées et les sorties sont créés pour le chargement de la culture / médias. Pendant ce temps, le nettoyage et d'autres procédures sur le substrat de verre et tampon de PDMS sont nécessaires pour assurer la cellule-compatibilité. <ol><li> Assurez-réservoirs à travers le tampon de PDMS en utilisant perforatrice biopsie. Nous avons choisi d'être leur diamètre 6 mm. Ces réservoirs servent à deux fins. La première consiste à tenir des nutriments supplémentaires pour la croissance cellulaire. L'autre est pour l'accès de chargement pipette et l'aspiration. </li><li> Faire tremper le tampon de PDMS dans 70% d'éthanol pendant 30 minutes, puis rincez avec de l'eau désionisée pendant 10 min. Le but est de dégager potentiels résidus organiques introduites au cours du processus de fabrication, et non réticulé contamination PDMS. Procédés de nettoyage plus intenses et plus approfondie, comme l'extraction organique 13 14 ont été utilisés ailleurs. Cependant, nous avons constaté qu'il n'était pas nécessaire dans la culture BTSC. </li><li> Stériliser le timbre de PDMS en utilisant autoclave (121 ° C, 35 min). Cette étape achève la réaction de réticulation plus de PDMS. A partir de cette étape et jusqu'à l'étape 3.6, toutes les procédures sont prises de manière stérile. </li><li> Le timbre de PDMS est ensuite posé sur une lamelle de verre, préalablement recouvertes de poly-L-lysine. 15-17 Le dispositif est ensuite revêtue de laminine en remplissant le canal avec la laminine solution pendant une nuit à 37 ° C. Laminine est aspiré à partir de l'appareil et l'appareil est lavé avec du milieu de cellules souches. </li><li> Chargez suspension cellulaire de l'étape 1 dans des réservoirs et des canaux. 11 pl de cellules dissociées sont placés dans un réservoir de semence. Aspiration sous vide est utilisée pour forcer les cellules dans la chambre d'ensemencement, si nécessaire. Un montant supplémentaire de 7 pi de cellules sont placées le réservoir attenant ensemencement. Remarque: la densité cellulaire moyenne est de 20.000 cellules / ul médias. À l'arrièreer cinq minutes, l'ensemencement et les réservoirs de réception sont inondées avec les médias. </li><li> Placez un 0,5-1 mm pré-stérilisé à l'autoclave feuille de PDMS sur le dessus. L'adhérence à la surface naturelle s'est produite entre deux morceaux de PDMS fera de la culture cellulaire étanche et prêt pour le transport, l'incubation et l'imagerie microscopique. </li></ol> 4. À long terme imagerie time-lapse de la migration BTSC avec BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, Etats-Unis). La combinaison de caméra, le logiciel et l'incubateur dans une seule boîte, ce système microscopique permet à la culture de cellules d'image sans perturbation pendant des jours. En outre, sa conception unique du moteur déplace la lentille de l'objectif et maintient étape d'échantillonnage fixe dans la fonction de point de visite. Il est donc pratique pour les expériences d'image parallèles et la locomotion cellulaire piste à haut débit de dosage. <ol><li> Pré-équilibrer l'IM Biostation pendant 45 minutes pour stabiliser l'alimentation en température, d'humidité et de l'air. L'addition d'eau-cont plusieursplats ained en chambre d'échantillon est utilisé pour maintenir une humidité adéquate. </li><li> Chargez l'appareil cellulaire contenu dans la chambre échantillon de microscope, et le centre à l'aide des pinces micro. </li><li> Réglez l'orientation, la position des points et du temps-points dans le logiciel Biostation et démarrer le time-lapse. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Des exemples de l'inspection visuelle et la caractérisation de la migration des cellules cancéreuses en utilisant un dispositif microfluidique cloisonnement sont illustrés dans la Figure 3 et Figure 4. La lignée cellulaire est BTSC. Avec notre configuration actuelle, images de phase de culture cellulaire peuvent être enregistrées en continu aussi longtemps que 5 jours (Figure 3) et aussi fréquemment que toutes les 2 secondes (Figure 4). Au-delà de 5 jours, les milieux de culture doivent être remplacés pour la reconstitution des éléments nutritifs et les déchets enlevés. À long terme, time-lapse identifie une séquence tournante de six stades cellulaires au cours de sa migration sur la base des changements morphologiques. Comme illustré à la figure 3, nous les décrivent comme (i) de pré-migration, (ii) l'initiation, (iii) de chemin d'exploration, (iv) de croisière, (v) de destination exloration et (vi) de post-migration. Dans la chambre de réception, en forme de fuseau cellules restent dans l'étape (i) en vrac dans des tumeurs qui sont capables de se développer, diviser et migrer progressivement. À l'approche de l'entrée de microcanaux, quelques cellules procéder à l'étape (ii) quand ils se développer et générer saillie adhésif. Seulement une d'entre elles est susceptible d'occuper l'entrée et passer à l'étape (iii), qui peut explorer la direction de migration. Une fois la cellule détermine la direction de migration, il passe à l'étape (iv) pour une croisière à travers le microcanal à une vitesse constante et élevée, ce qui se fait à travers le microcanal entier. À la fin de microcanaux, produit des cellules à l'étape (v) pour explorer l'espace ouvert de la chambre de réception, puis à l'étape (vi). En microcanal, la puissance migration est principalement généré par l'activité blebbing comme illustré à la figure 4, similaire à celle de amiboïde cell. Bourgeonnement cellulaire et déformation de la membrane sont entièrement enregistrée ici. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma de fabrication de dispositif microfluidique. L'ensemble du processus est réalisée sur une tranche de silicium 3-pouces poignée grâce à une technique de lithographie douce modifiée. 3-um-haut microcanaux et les marqueurs d'alignement sont réalisés comme dans la première couche. Puis 250-pm d'épaisseur SU-8 est appliquée par centrifugation, tandis que les repères d'alignement sont recouverts de ruban adhésif, de telle sorte qu'elles peuvent ultérieurement être accessible pour masquer aligneur sans blocage de la vue par photorésist épais. Ainsi, les caractéristiques de la chambre ne peut se faire que la seconde couche alignés avec précision et à la première couche. Timbre PDMS est finalement moulé hors le maître qui en résulte. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma d'ensemble du dispositif et le processus de l'ensemencement des cellules. Enfermée dans PDMS et gllamelle âne, l'espace de culture 3D est composé de chambres, des réservoirs et des microcanaux. La chambre est remplie d'ensemencement de culture de cellules, tandis que la chambre de réception est initialement rempli d'un milieu sans cellule. Les microcanaux qui relient entre eux fournissent piste cellules migrent d'un côté semis à côté de la réception. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. BTSC la migration à travers microcanal. Supérieur: des instantanés de time-lapse montrer une seule cellule (surligné en vert) migre plus de 400 um de côté ensemencement sur le côté de réception. Le voyage entier prend environ 2 jours, impliquant une séquence de changements morphologiques cellulaires. La barre d'échelle est de 40 um. Abaissez: une représentation dessinée de six étapes de migration. Pré-migration (i): Dans la chambre d'ensemencement, les cellules en forme de fuseau et divisible migrer progressivement le long de l'autre. Les cellules proches de l'entrée de microcanaux course à l'autre par polarisation corps cellulaire et e xerting saillie lamellipodes. Initiation (ii): La cellule migratoire avec la plus grande capacité occupe l'entrée du canal tandis que ses concurrents vont battre en retraite. Chemin d'exploration (iii): Les modifications des cellules migratoires vers un mode de polarité peu amiboïdes. Ce mode de migration est extrêmement mobiles et capables d'explorer chemin dans toutes les directions par blebbing petites protrusions membranaires. Croisière (iv): Une fois le chemin de migration est déterminée, la cellule se transforme en un mode amiboïde adapté par le maintien d'une saillie supplémentaire importante rubrique de l'avant. Ainsi, la cellule maintient une grande mobilité et une direction constante et la vitesse. Destination d'exploration (v): À la fin de parcours, la cellule ralentit et se développe filopodias d'explorer la chambre de réception pour toute cible invasion. Post-migration (vi): Après être entré dans la chambre de réception, la cellule se transforme en forme d'étoile et conserve la motilité élevée, mais pas de direction déterminée. "/&gt; . Figure 4 Instantanés de time-lapse montrer le cycle de déformation blebbing activité et de la membrane d'un BTSC: (AB). initiation; (BD). Extension; (DF). Rétraction. Les flèches et les lignes courbes représentent la direction et l'emplacement de déformation de la membrane, respectivement. Les instantanés sont collectées toutes les 8 secondes.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le dispositif microfluidique et d&#39;enregistrement des images technique présentée ici permet une caractérisation visuelle de la morphologie cellulaire lors de la migration. Par rapport aux méthodes conventionnelles existantes, la plate-forme microfluidique présente des avantages de coût-efficacité, un débit élevé et une flexibilité de conception. Le système de visualisation microscopique présentée permet d&#39;étudier et d&#39;enregistrement de migration à long terme de cellules vivantes. La fonction d&#39;objectif motorisé, il est possible de suivre plusieurs voies de migration dans une image haute résolution, sans perturber l&#39;échantillon. Lors de l&#39;assemblage du dispositif, le tampon est PDMS non collée de façon permanente à la lamelle de verre pour la commodité de revêtement PDL (étape 3,4). Il est essentiel de réaliser une bonne étanchéité à la réussite de ce protocole. Contamination introduite à partir de la fabrication du dispositif, tel que bulle d&#39;air dans le tampon ou la poussière / débris sur le substrat, peuvent compromettre l&#39;adhérence et entraîner des fuites de fluide. Par conséquent, TREATIng le dispositif d&#39;une manière exempte de poussière est important de prévenir défaillance de l&#39;appareil. Avant la PDL-revêtement, les lamelles de verre sont l&#39;acide nitrique et la solution traitée PDL est centrifugé pour éliminer les poussières / débris. Nous trouvons scotch, rinçage à l&#39;alcool et bain d&#39;eau très utile pour enlever la poussière / débris du timbre en PDMS, si une salle blanche n&#39;est pas accessible. Après le tampon PDMS en contact avec la lamelle de verre, en tapant le tampon délicatement avec une pince facilite le joint d&#39;étanchéité. BTSCs peut être enrichi de l&#39;homme spécimens salle d&#39;opération par la culture sphère dans un milieu de cellules souches, semblable à la culture des cellules souches neurales normales 10. BTSCs enrichis de cette manière démontrer de cellules souches comme des propriétés, telles que l&#39;expression des marqueurs des cellules souches (CD133, la nestine), la différenciation de plusieurs lignées de neurones (cellules gliales et neuronales), et l&#39;initiation tumorale dans un modèle de souris immunodéficiente orthotopique avec aussi peu que 100 18 cellules. Même si un débat existe au sujet de purificationcation et l&#39;entretien des BTSCs 1, 19-21, sphère cultivés BTSCs mieux maintenir le phénotype et le génotype de la tumeur parentale 22-24. L&#39;espace compartimenté imite l&#39;environnement physiologique pour la migration cellulaire. Dans notre dispositif, BTSC présentent une forte capacité de migration à travers un espace de taille contraint par la réglementation de la morphologie cellulaire. Notre caractérisation des modifications morphologiques des cellules indique-mode transformations dans une séquence de six étapes qui peuvent modéliser une éventuelle nouvelle description détaillée de l&#39;invasion BTSC du cerveau adjacent. Dans les stades précoces, les cellules acquérir une quantité importante de polarité et de générer des protubérances adhésives à s&#39;ancrer efficacement à l&#39;intérieur du microcanal. Une fois la cellule d&#39;occupation dans le microcanal est établie, elle se transforme en un mode de croisière et maintient ce mode pour tout le parcours à travers un micro-canal. A ce stade, BTSC maintenir la motilité élevée et une orientation uniforme, mais conserver l&#39;énergie. Enterestingly, il semble que un micro-canal est limitée à une seule cellule de croisière à la fois, de sorte que lorsque un produit unicellulaires à ce stade, d&#39;autres cellules de la retraite microcanal. Ce mécanisme garantit l&#39;efficacité probable de la tumeur diffusion et empêche la surconsommation de nutriments dans microcanal. Après avoir terminé la migration à travers le microcanal, une cellule retrouve sa propension à protubérances multidirectionnelles et d&#39;exploration supplémentaire pour objectifs d&#39;invasion ou de nouvelles voies de migration. Le dispositif de cloisonnement microfluidique offre un roman in vitro moyens de créer un micro-environnement pour étudier l&#39;infiltration BTSC du parenchyme cérébral. Cette méthode peut facilement être adapté à l&#39;étude des cellules souches du cancer (SCC) et des lignées de cellules migratoires provenant d&#39;autres types de tumeurs. La culture de cellules dans le dispositif microfluidique peut être réalisé dans n&#39;importe quel laboratoire de biologie moderne qui est équipé d&#39;un incubateur de culture tissulaire et l&#39;expertise. Equipé d&#39;un su-8 maître PDMSfonderies, montage appareil sont réalisables avec une formation fondamentale en lithographie douce. En outre, cette plate-forme peut également être étendue à d&#39;autres applications à l&#39;intégration d&#39;autres modules fonctionnels tels que mélangeur de gradient, la structuration de surface, contrôle des fluides et de microélectrodes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Dulbecco modifié Eagle (DMEM), le glucose à haute </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> F12 de Ham </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> B27 supplément de vitamine A moins </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycotique (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> Facteur de croissance épidermique (EGF), humaine recombinante </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) humain recombinant </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> Sel de sodium d&#39;héparine, de la muqueuse intestinale de porc </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> Laminin (souris naturel) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC) Fournitures de culture </td></tr><tr><td> Tige milieu cellulaire </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% Hams F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> 1% d&#39;antibiotique, antifongique </li><li> 2% B27 sans vitamine A </li><li> EGF (20 ng / ml) et bFGF / héparine (20 ng/ Ml de bFGF, 5 mg / ml d&#39;héparine) Mélanger les ingrédients et filtre stérile avant utilisation </li></ul></td></tr><tr><td> Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) / héparine </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentration aliquote de 20 pg / ml </li><li> Pour 25 ug: Ajouter 1,25 ml d&#39;héparine 5MG/ML à 25 mg bFGF. </li><li> Pour 250 pg: Ajouter 1 ml d&#39;héparine 5MG/ML à 250 mg de bFGF. Transfert à 15 ml conique et ajouter 11,5 ml à 5 ​​mg / ml d&#39;héparine à conique. </li><li> Magasin de 50 ul ou 250 aliquotes à -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Facteur de croissance épidermique (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentration aliquote de 20 pg / ml </li><li> Pour 200 pg: Ajouter 1 mL stérile DMEM (Gibco 11965-118) à 200 mg FEM. Transfert à 15 ml conique et ajouter 9 ml de DMEM. </li><li> Pour 500 ug: Ajouter 1 mL stérile DMEM (Gibco 11965-118) à 200 mg FEM. Transfert à conique de 50 ml et ajouter 24 ml de DMEM. <li> Stockez jusqu&#39;à 50 &amp; mu, L ou 250 aliquotes à -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> L&#39;héparine </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentration aliquote de 5 mg / ml </li><li> Peser 100 mg d&#39;héparine. </li><li> Ajouter 100 mg d&#39;héparine à 20 mL (70%) du DMEM-(30%) F12-(1%) PSA (14 ml DMEM, 6 ml F12, 200 ul PSA) </li><li> Filtre stérile </li><li> Magasin de 50 ul ou 250 aliquotes à -80 ° C </li></ul></td></tr><tr><td> su-8 photosensible </td><td> MicroChem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plaquette poignée en silicone </td><td> Matériaux WRS </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminine </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> 50 pg /ml dans du tampon PBS à la concentration finale </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> Nikon Instruments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Au cours des 40 dernières années, les États-Unis ont investi plus de 200 milliards de dollars sur la recherche sur le cancer, ce qui entraîne une baisse de seulement 5% du taux de mortalité. Un obstacle majeur à l&#39;amélioration des résultats pour les patients est la mauvaise compréhension des mécanismes qui sous-tendent la migration cellulaire associée à des cellules cancéreuses invasion agressive, les métastases et la résistance thérapeutique 1. Le glioblastome multiforme (GBM), la plus fréquente tumeur maligne primaire du cerveau adulte 2, illustre cette difficulté. Malgré la chirurgie, la radiothérapie standard et la chimiothérapie, la médiane de survie des patients n&#39;est que de quinze mois, en raison de l&#39;infiltration agressive GBM dans le cerveau adjacent et la récidive du cancer rapide 2. Les interactions entre les mécanismes cellulaires aberrantes migratoires et le microenvironnement tumoral susceptible de différencier un cancer des cellules normales 3. Par conséquent, l&#39;amélioration des approches thérapeutiques pour GBM exigera une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires du cancer de migration. Des travaux récents suggèrent thata petite sous-population de cellules dans GBM, les cellules souches de tumeur cérébrale (BTSC), peut être responsable de la résistance thérapeutique et la récurrence. Mécanismes sous-jacents BTSC capacité migratoire commencent seulement à être caractérisés 1,4. En raison d&#39;une limitation de l&#39;inspection visuelle et la manipulation géométrique, les essais de migration conventionnels 5 sont limités à quantifier l&#39;ensemble des populations de cellules. En revanche, les dispositifs microfluidiques permettre l&#39;analyse unicellulaire des raisons de compatibilité avec la microscopie moderne et le contrôle des micro-environnement 6-9. Nous présentons une méthode pour la caractérisation détaillée de la migration BTSC utilisant le cloisonnement des dispositifs microfluidiques. Ces dispositifs PDMS faites couler le milieu de culture des tissus en trois compartiments connectés: ensemencement chambre, chambre de réception et la réduction de microcanaux. Nous avons conçu ce dispositif de sorte que les deux chambres contenir des médias suffisantes pour soutenir BTSC viable pour les 4-5 days sans média d&#39;échange. BTSCs très mobiles initialement introduit dans la chambre d&#39;ensemencement sont isolés après migration de pontage si microcanaux parallèles à la chambre de réception. Cette migration cellulaire simule le cancer propagation à travers les espaces interstitiels du cerveau. Les images de phase en direct de la morphologie des cellules au cours de la migration sont enregistrées sur plusieurs jours. BTSC grands migrateurs peut donc être isolé, remises en culture, et une analyse plus poussée. Microfluidique compartimentage peut être une plate-forme polyvalente pour étudier le comportement migratoire des BTSCs et d&#39;autres cellules souches cancéreuses. En combinant les générateurs de gradient, la manipulation des fluides, des micro-électrodes et d&#39;autres modules microfluidiques, ces appareils peuvent également être utilisés pour le dépistage des drogues et 6 diagnostic de la maladie. L&#39;isolement d&#39;un sous-population de cellules migratrices agressive permettra des études de mécanismes sous-jacents moléculaires.

Un dispositif de cloisonnement microfluidique pour étudier la migration des cellules souches du cancer est décrit. Cette nouvelle plate-forme crée un microenvironnement cellulaire viable et permet la visualisation microscopique de locomotion de cellules vivantes. Très mobiles cellules cancéreuses sont isolées pour étudier les mécanismes moléculaires de l&#39;infiltration agressive, pouvant conduire à des thérapies plus efficaces futures.

Au cours des 40 dernières années, les États-Unis ont investi plus de 200 milliards de dollars dans la recherche sur le cancer, ce qui n'a entraîné qu'une diminution de 5 % du taux de mortalité. Un aspect majeur...

L'objectif général de cette procédure est d'observer visuellement et de caractériser la migration de cellules cancéreuses à l'aide d'un dispositif microfluidique compartimenté. Cela est réalisé en dissociant d'abord des neurosphères préexistantes de cellules souches de tumeurs cérébrales cultivées dans un milieu sans sérum. La deuxième étape consiste à fabriquer un master en SU-huit bicouche et à utiliser un moule en A-P-D-M-S réalisé par lithographie douce, présentant un design compartimenté.Ensuite, assemblez le dispositif microfluidique et chargez-le avec des cellules souches de tumeur cérébrale. Enfin, une imagerie en laps de temps à long terme de la migration des cellules souches de tumeur cérébrale est réalisée à l’aide d’un système microscopique tout-en-un. En définitive, les résultats montrent que les cellules souches de tumeur cérébrale présentent une séquence rotative de stades morphologiques au cours de leur migration à travers des espaces ultra-confinés.Le principal avantage de cette technique par rapport aux dispositifs existants comme la chambre Transwell Boyton réside dans le fait que le microdispositif permet l'inspection visuelle du processus de migration, le positionnement contrôlé des cellules et l'administration précise de facteurs. Par conséquent, la technologie microforic offre des caractéristiques de sélection et de guidage cellulaire unique fiables, efficaces et rentables. Les implications de cette technique s'étendent au traitement des métastases et de la récidive du cancer, car l'analyse de cellules uniques hautement migratrices pourrait identifier des cibles chimiothérapeutiques potentielles futures.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le comportement migratoire des systèmes cancéreux, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que le développement embryonnaire, les réponses immunitaires, la cicatrisation des plaies et la régénération d'organes. Commencez par la suspension cellulaire de neurosphéroïdes dérivés de BTSC. Rassemblez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-les à 900 tr/min pendant cinq minutes, mais pas plus vite.Aspirez le surnageant. Ensuite, laissez les neurosphères se détacher en les incubant dans 0,5 millilitre d'Accutase préchauffé pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, dissocierez mécaniquement les cellules à l'aide de 10 à 20 mouvements doux avec une pipette P100.Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de milieu pour cellules souches pour neutraliser l'Accutase, centrifugez la suspension cellulaire à 1300 tr/min pendant cinq minutes et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu pour cellules souches. Vérifiez la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité à 20 000 cellules par microlitre. Pour commencer la fabrication du moule maître en SU-8, préparez deux masques photo à l’aide d’Adobe Illustrator et d’un film transparent imprimé au laser avec un Image Setter intégré.Le masque photo de la première couche comprend deux marqueurs fiduciaux et un réseau de microcanaux, tandis que la deuxième couche du masque photo comporte les chambres de positionnement et de réception. Nettoyez les deux couches du masque avec de l'isopropanol et laissez-les sécher à l'air. Appliquez ensuite par rotation un photo-résist SU eight d'une épaisseur de trois microns sur une galette support, suivie d'une cuisson douce.Ensuite, à l’aide du premier masque photolithographique en contact étroit avec les rayons UV, exposer la photo-résine et laisser durcir. Puis effectuer une cuisson postérieure et développer la plaquette durcie. Recouvrir les zones des marqueurs de repérage de la plaquette de manipulation avec du ruban adhésif Scotch.Ensuite, appliquez par centrifugation une résine photosensible d'une épaisseur de 250 micromètres sur la plaquette. Puis, retirez le ruban adhésif afin de faire apparaître les marques servant à l'alignement. Appliquez une deuxième couche de résine photosensible et alignez les marques de repère.Ensuite, exposer sous UV et durcir le masque photo de la deuxième couche, puis effectuer une cuisson postérieure et un développement. Procéder maintenant au silanisation du moule en SU-8 par dépôt en phase vapeur afin de réduire l'adhérence de surface. Placer les plaquettes dans un dessiccateur contenant plusieurs gouttes de solution de trichlorosilane sous vide pendant au moins une heure.La matrice sera alors prête à être utilisée pour mouler le PDMS. Commencez par mélanger soigneusement la base de prépolymère avec le réactif de réticulation dans un rapport de 10 à 1. Ensuite, placez le mélange dans un dessiccateur sous vide pour dégazer, jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air ne soit visible.Verser le mélange sur le masque et dégazer à nouveau. Si de nouvelles bulles d'air apparaissent, durcir le moule sur une plaque chauffante de niveau pendant deux heures à 90 degrés Celsius. Après refroidissement à température ambiante, retirer délicatement le tampon en PDMS.Ainsi, les canaux de culture sont gravés dans le PDMS et prêts pour l'assemblage du dispositif microfluidique. Le modèle peut être réutilisé pour le moulage jusqu'à ce qu'il se fende ou s'use. Lorsque le modèle devient collant, le revêtement anti-adhésif peut être réappliqué.Commencez par créer des entrées et des sorties dans le dispositif microfluidique à l’aide du tampon en PDMS. À l’aide d’un poinçon de biopsie, nettoyez le tampon en PDMS en l’immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes, puis rincez-le à l’eau déionisée pendant 10 minutes. Stérilisez le tampon en PDMS et terminez les réactions de réticulation par autoclavage.Placez maintenant le tampon en PDMS sur une lamelle en verre revêtue de poly-L-lysine. Le dispositif est ensuite revêtu d'une couche de laminine en remplissant les chambres avec une solution de laminine par les entrées des réservoirs et en incubant toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez la laminine du dispositif.Ensuite, lavez l'appareil en l'inondant deux fois avec du milieu pour cellules souches. Chargez maintenant 11 microlitres de cellules dissociées dans l'un des réservoirs d'ensemencement. Si nécessaire, utilisez une aspiration sous vide pour forcer les cellules dans la chambre. Chargez ensuite un volume supplémentaire de sept microlitres de cellules dans le réservoir d'ensemencement adjacent.Après cinq minutes, les compartiments d'administration et de réception seront remplis de milieu. Placez maintenant une feuille stérile de PDMS d'une épaisseur comprise entre 0,5 et un millimètre sur le dispositif. L'adhésion naturelle de surface du PDMS sur lui-même scellera le dispositif ; une fois scellé, il est prêt à être transporté, incubé et observé en microscopie.Pré-équilibrez le biot, IM en le faisant fonctionner pendant 45 minutes. Pour stabiliser sa température, son humidité et son apport d'air, ajoutez plusieurs boîtes de Petri contenant de l'eau dans la chambre d'échantillonnage afin d'obtenir l'humidité appropriée. Chargez le dispositif préparé dans la chambre d'échantillonnage du microscope.Centre l'appareil à l'aide de pinces microscopiques. Définis maintenant les points de mise au point et les points temporels à l'aide du logiciel Biot et démarre les enregistrements en laps de temps si nécessaire. Après cinq jours de culture, remplace le milieu de culture.Les BTC semées dans le dispositif ont été enregistrées en continu par imagerie en contraste de phase. Pendant cinq jours dans la chambre de sédimentation, les cellules en forme de fuseau sont restées au stade pré-migratoire. Lorsqu'elles se sont approchées de l'entrée du microcanal, quelques cellules se sont étendues et ont formé des protrusions adhésives.Une seule cellule pouvait occuper l'entrée et explorer la direction de migration. Une fois que la cellule avait déterminé la direction de migration, elle progressait à vitesse élevée et constante à travers tout le microcanal. À l'extrémité du microcanal, la cellule continuait d'explorer l'espace ouvert de la chambre de réception avant d'y pénétrer finalement.En observant les cellules avec des intervalles d'imagerie de deux secondes, la puissance semblait être générée principalement par une activité de bourgeonnement similaire à celle des cellules OID. Lors de la réalisation de la procédure, il est important de se rappeler que la conception du dispositif est suffisamment souple pour que les dimensions des microcanaux puissent être modifiées afin d'obtenir un degré souhaité de migration cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de créer un dispositif microfluidique compartimenté unique, adapté à la culture de vos cellules d'intérêt, puis de réaliser un suivi en lapse de temps à long terme afin de définir qualitativement et quantitativement les caractéristiques migratoires de ces cellules selon cette procédure.D'autres méthodes, comme le séquençage de nouvelle génération ou la puce à ADN, peuvent être appliquées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le degré de différence génétique des cellules cancéreuses hautement migratrices.

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Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

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