Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

L’objectif global de cette procédure est d’inspecter visuellement et de caractériser la migration des cellules cancéreuses à travers un dispositif microfluidique compartimentant. Ceci est accompli en dissociant d’abord les neurosphères préexistantes de cellules souches de tumeurs cérébrales cultivées dans un milieu libre de sérum. La deuxième étape consiste à fabriquer un SU huit maître bicouche et à utiliser un moule de lithographie souple A-P-D-M-S tampon qui a un design compartimentant.

Ensuite, assemblez le dispositif microfluidique et chargez-le de cellules souches de tumeurs cérébrales. Enfin, l’imagerie à long terme de la migration des cellules souches de tumeurs cérébrales est réalisée à l’aide d’un système microscopique tout-en-un. En fin de compte, les résultats montrent que les cellules souches de tumeurs cérébrales présentent une séquence tournante d’étapes morphologiques lors de leur migration dans un espace ultra confiné.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux masses existantes comme la chambre de Boyton Transwell, est que le micro-dispositif permet une inspection visuelle du processus de migration, un placement contrôlé des cellules et l’administration précise des facteurs. Par conséquent, la technologie micro foric présente les caractéristiques d’une sélection et d’une navigation fiables, efficaces et rentables de cellules uniques. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des métastases cancéreuses et de la récidive, car l’analyse de cellules uniques de cellules hautement migratrices peut identifier de futures cibles chimiothérapeutiques potentielles.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du comportement de migration du système cancéreux, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le développement embryonnaire, les réponses immunitaires, la cicatrisation des plaies et la régénération des organes. En commençant par la suspension cellulaire de lances neurologiques dérivées de BTSC. Regroupez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-les à 900 tr/min pendant cinq minutes, mais pas plus vite.

Aspirez le super natin. Laissez ensuite les neurosphères se détacher en les incubant dans 0,5 millilitre d’Accutane préchauffé pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, perturber mécaniquement les cellules avec 10 à 20 coups doux d’une pipette P 100.

Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de milieu de cellules souches pour neutraliser la centrifugeuse Accutane, la suspension cellulaire à 1300 tr/min pendant cinq minutes et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de cellules souches. Vérifiez la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité à 20 000 cellules par microlitre. Pour commencer la fabrication du master SU huit, préparez deux masques photo à l’aide d’Adobe Illustrator et d’un film transparent d’impression laser avec Image Setter incorporé.

La première couche du masque photo se compose de deux marqueurs repères et d’un réseau de microcanaux, et la deuxième couche du masque photo comporte les chambres d’assise et de réception. Nettoyez les deux couches du masque avec de l’isopropanol et laissez-les sécher à l’air. Maintenant, appliquez une couche de poignée avec une résine photo SU huit de trois microns d’épaisseur, suivie d’une cuisson douce.

Ensuite, avec la première couche de masque photo en contact étroit avec les uv, exposez la photo, résistez et laissez-la durcir. Ensuite, post-cuisson et développez la gaufrette durcie. Couvrez les zones de repère de la plaquette de la poignée avec du scotch.

Ensuite, enduisez la plaquette d’une résine photo de 250 microns d’épaisseur. Ensuite, décollez le ruban adhésif pour révéler les marqueurs à des fins d’alignement. Placez la deuxième couche de résine photosensible et alignez les repères.

Ensuite, exposez aux UV et durcissez le masque photo de la deuxième couche, suivi de la post-cuisson et du développement. Zéz maintenant le SU huit maître par dépôt en phase vapeur pour réduire l’adhérence de surface. Placez les hosties dans un desiccate avec plusieurs gouttes de solution de Tri Chloro cline sous vide pendant au moins une heure.

Le maître sera alors prêt à être utilisé pour mouler le PDMS avec le maître. Commencez par bien mélanger la base de prépolymère avec durcissement dans un rapport de 10 pour un. Placez ensuite le mélange dans un dessiccateur pour le dégazage sous vide jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air ne soit visible.

Versez le mélange sur le masque et dégazez à nouveau. Si de nouvelles bulles d’air sont introduites, faites durcir le moule sur une plaque chauffante plane pendant deux heures à 90 degrés Celsius. Une fois qu’il a refroidi à température ambiante, relâchez doucement le tampon PDMS.

Ainsi, les canaux de culture sont gravés dans le PDMS et prêts pour l’assemblage du dispositif microfluidique. Le master est réutilisable pour le moulage jusqu’à ce qu’il soit fissuré ou usé. Lorsque le master devient collant, le revêtement antiadhésif peut être réappliqué.

Commencez par faire des entrées et des sorties dans le dispositif microfluidique à l’aide du tampon PDMS. À l’aide d’une perforation de biopsie, nettoyez le tampon PDMS en le trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes, puis en le rinçant à l’eau désionisée pendant 10 minutes. Stérilisez et complétez les réactions de réticulation du tampon PDMS par autoclavage.

Posez maintenant le tampon PDMS sur une lamelle en verre recouverte de lysine poly L. L’appareil est ensuite recouvert d’un stratifié en remplissant les chambres d’une solution de stratifié à travers les entrées du réservoir et incubé pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez le stratifié de l’appareil.

Ensuite, lavez l’appareil en l’inondant deux fois de milieu de cellules souches. Chargez maintenant 11 microlitres de cellules dissociées dans l’un des réservoirs d’ensemencement Si nécessaire, utilisez l’aspiration sous vide pour forcer les cellules dans la chambre. Chargez ensuite sept microlitres supplémentaires de cellules dans le réservoir d’assise adjacent.

Au bout de cinq minutes, les réservoirs de sièges et de réception seront inondés de fluides. Placez maintenant une feuille PDMS stérile de 0,5 à un millimètre d’épaisseur sur l’appareil. L’adhérence naturelle de surface du PDMS avec lui-même scellera l’appareil une fois scellé, il est prêt pour le transport, l’incubation et l’imagerie microscopique.

Pré-équilibrez le biot, IM en le faisant fonctionner pendant 45 minutes. Pour stabiliser sa température, son humidité et son alimentation en air, ajoutez plusieurs plats d’eau dans la chambre d’échantillonnage pour obtenir la bonne humidité. Chargez l’appareil préparé dans la chambre d’échantillonnage du microscope.

Centrez l’appareil à l’aide d’une micro-pince à épiler. Réglez maintenant les points de position de mise au point et les points temporels à l’aide du logiciel Biot et lancez les enregistrements en accéléré si nécessaire. Après cinq jours de culture, remplacez le milieu de culture.

Les BTC ensemencés dans l’appareil ont été enregistrés en continu par image de phase. Pendant cinq jours dans la chambre d’assise, les cellules en forme de fuseau sont restées au stade de pré-migration. À l’approche de l’entrée du microcanal, quelques cellules se sont dilatées et ont généré des protubérances adhésives.

Une seule cellule a pu occuper l’entrée et explorer la direction de la migration. Une fois que la cellule a déterminé la direction de migration, elle a commencé à naviguer à travers l’ensemble du microcanal à une vitesse élevée et constante. À la fin du Microchannel, la cellule a commencé à explorer l’espace ouvert de la chambre réceptrice avant d’y entrer finalement.

En observant les cellules avec des intervalles d’imagerie de deux secondes, la puissance de migration semblait être générée principalement par une activité de bavardage similaire à celle d’une cellule OID. Lors de la tentative de la procédure, il est important de se rappeler que la conception du dispositif est si flexible que les dimensions des microcanaux peuvent être manipulées pour atteindre le degré souhaité de migration cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer un dispositif microfluidique compartimentant unique adapté à la culture de vos cellules d’intérêt, puis à la réalisation d’une imagerie à long terme pour définir qualitativement et quantitativement les caractéristiques migratoires de ces cellules en suivant cette procédure.

D’autres méthodes, comme le séquençage de nouvelle génération ou les puces à ADN, peuvent être appliquées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la différence génétique des cellules cancéreuses hautement migratoires.