Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

L’objectif global de cette expérience est de rapporter et de comparer les deux tests utilisés pour étudier l’invasion et la migration cellulaires, le test en chambre Boyden et un test optimisé de plaie par égratignure au microscope vidéo in vitro. Ces expériences peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine d’étude de l’invasion et de la migration, telles que le choix de la méthode la plus pertinente. Le principal avantage de ce test de plaie par égratignure basé sur la microscopie vidéo in vitro optimisée est qu’il fournit une comparaison reproductible et précise entre les conditions de traitement.

Bien que cette méthode puisse évaluer la migration et l’invasion cellulaires, elle peut également être appliquée à d’autres domaines d’étude tels que la cicatrisation ou la régénération tissulaire. Préparez les cellules SQ20B 72 heures avant le premier jour de l’essai en enchaînant deux fois 10 cellules 1/6 dans 25 millilitres de milieu de culture dans une fiole de 175 centimètres carrés. Laissez les cellules croître jusqu’à 80 % de confluence cellulaire à 37 degrés Celsius.

Le premier jour après la trypsinisation et le comptage cellulaire, ensemencez les cellules dans un flacon de 25 centimètres carrés à une densité cellulaire de six fois 10 pour 1/5 cellules dans trois millilitres de milieu de culture pour chaque condition à évaluer. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, affamez les cellules en remplaçant le milieu dans chaque flacon par trois millilitres de sérum bovin à faible teneur fœtale.

Affamez les cellules de l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour l’essai d’invasion, préparez les chambres de Boyden revêtues 12 heures après le début de la famine cellulaire. Placez chaque chambre Boyden dans l’assiette d’accompagnement.

Ajouter 500 microlitres de milieu de cellule de famine dans chaque chambre enrobée. Le lendemain, le troisième jour, utilisez l’assiette d’accompagnement pour préparer le chimioattractant. Remplissez chaque puits de la plaque d’accompagnement de 24 puits avec 750 microlitres de milieu complet avec 10 % de FBS, de l’hydrocortisone, de la pénicilline et de la streptomycine.

Transférez la chambre supérieure dans la plaque d’accompagnement préremplie en prenant soin d’éviter les bulles. Pour l’essai d’invasion, retirer avec précaution 450 microlitres de milieu de culture de chaque chambre Boyden. Après trypsinisation et comptage des cellules SQ20B affamées, ensemencez trois fois 10 pour les cellules 1/4 dans 500 microlitres de milieu à 0,1 % BSA donnant une dilution finale de six fois 10 pour 1/4 cellules par millilitre.

Placez la chambre Boyden dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le quatrième jour, retirez chaque insert de la plaque d’accompagnement et retirez soigneusement les cellules de la chambre supérieure à l’aide d’un coton-tige. Par la suite, fixez et teignez chaque insert individuellement pour obtenir une coloration May-Grunwald Giemsa à l’aide d’un kit de coloration selon les instructions du fabricant.

Effectuez une analyse microscopique le cinquième jour. Insérez la plaque d’accompagnement avec les inserts dans un microscope à contraste de phase 20X et comptez chaque cellule migrée sur la partie inférieure de la membrane. 72 heures avant le premier jour de l’essai, semer deux fois 10 cellules 1/6 SQ20B dans 25 millilitres de milieu de culture dans une fiole de 175 centimètres carrés et laisser les cellules croître jusqu’à 80 % de confluence cellulaire.

Le premier jour après la trypsinisation et le comptage des cellules, générez un échantillon pré-dilué des cellules SQ20B à une densité de quatre fois 10 à 1/5 de cellules par millilitre. Distribuez 100 microlitres de la solution cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour donner une densité finale de quatre fois 10 aux 1/4 cellules par 100 microlitres dans chaque puits. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et laissez les cellules adhérer à la plaque pendant 12 à 16 heures.

Le lendemain, apportez la plaque au capot pour la blessure à l’aide d’un dispositif de blessure commercial. Retirez le haut de l’enrouleur et placez-le dans la solution de lavage du bateau. Insérez la plaque dans le support de plaque de base et retirez le couvercle de la plaque.

Replacez le bloc de goupille en guidant les chevilles arrière du bloc de goupille dans les trous arrière de la plaque de base. Poussez et maintenez le levier noir et soulevez le bloc de goupille tout en continuant à maintenir le levier noir enfoncé. À l’aide d’une pipette à pointe conique adaptée, prélevez immédiatement le milieu de chaque puits en prenant soin de ne pas toucher la plaie.

Lavez les cellules en ajoutant à chaque puits 100 microlitres de milieu cellulaire chauffé à 37 degrés Celsius. Après le deuxième lavage, utilisez une pipette avec une pointe conique adaptée pour aspirer le milieu cellulaire. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu spécifique pour chaque condition de traitement à chaque puits en veillant à éviter de créer des bulles dans les puits.

Placez la plaque à 96 puits dans le support adapté du microscope vidéo. À l’aide du logiciel de microscope vidéo, programmez le calendrier des balayages à raison d’une image par puits. Pour une expérience d’invasion migratoire, un intervalle maximal de deux heures est requis.

Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle maximum de 30 minutes est privilégié. Surveiller et vérifier la migration cellulaire pendant au moins 24 heures et jusqu’à cinq jours à l’aide d’un masque cellulaire approprié et adapté à chaque type de cellule pour analyser la migration cellulaire. Pour obtenir un masque cellulaire adapté à chaque lignée cellulaire, générez une définition de traitement cellulaire à partir du logiciel à partir d’une collection d’images cellulaires spécifique.

Tracez les courbes et exportez les données vers une feuille de calcul qui peut être utilisée pour analyser et comparer les résultats. Pour se préparer à l’essai d’invasion cellulaire, amorcer les cellules SQ20B de la même manière que pour l’essai de migration cellulaire et incuber la plaque à 96 puits dans l’incubateur. Le deuxième jour du test, préparez la matrice extracellulaire.

Dégivrez la matrice à quatre degrés Celsius pendant au moins 12 heures avant de l’utiliser et assurez-vous qu’aucun agrégat n’est visible. Réfrigérez les tubes de microcentrifugation sur de la glace pendant cinq minutes. Diluez la matrice avec des pointes coniques pré-refroidies à quatre degrés Celsius dans les tubes de microcentrifugation pré-refroidis avec un milieu cellulaire refroidi à quatre degrés Celsius pour obtenir une concentration finale de 300 microgrammes par millilitre.

Conservez les tubes de microcentrifugation avec matrice pré-diluée au réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Récupérez la plaque à 96 puits de l’incubateur. Sous le capot, faites la plaie à l’aide du dispositif de plaie commercial selon le protocole du fabricant, comme démontré précédemment.

À l’aide d’une pipette avec une pointe conique adaptée, prélever immédiatement le milieu de chaque puits et faire attention de ne pas toucher la plaie. Lavez les cellules deux fois à l’aide de 100 microlitres de milieu cellulaire chauffé à 37 degrés Celsius. Après le deuxième lavage, placez l’assiette sur de la glace pendant cinq minutes pour équilibrer sa température.

Retirez le milieu froid de chaque puits en prenant soin de pipeter soigneusement par le bord et d’éviter de toucher la plaie. À l’aide d’embouts coniques pré-refroidis à quatre degrés Celsius, ajoutez 50 microlitres de matrice pré-diluée dans chaque puits. Placez l’assiette dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, ajoutez 100 microlitres du milieu cellulaire adapté à chaque puits, comme indiqué pour chaque condition de traitement. Placez la plaque dans le support adapté du microscope vidéo. Par la suite, programmez les balayages et effectuez une analyse de microscopie vidéo, comme démontré pour le test de migration cellulaire.

Les résultats représentatifs d’une membrane de Boyden après fixation cellulaire sont montrés. La membrane sous-optimale présente des amas de cellules sur la face supérieure de la membrane et des résultats ininterprétables. En revanche, la membrane optimale a des cellules dénombrables dans la partie inférieure de la membrane colorées en bleu.

Un résultat optimal du dosage de la plaie par égratignure est illustré par ces images de cicatrisation de la plaie à l’heure zéro, à 15 heures et à 30 heures. Les critères d’une expérience de qualité sont une plaie linéaire, aucun fragment cellulaire observé dans la plaie et une confluence cellulaire optimale. La confluence de 90 % est la densité cellulaire optimale pour le test de cicatrisation des plaies, comme le montre le panneau A.Le panneau C montre un exemple de faible densité cellulaire et le panneau B montre des amas de cellules causés par un lavage insuffisant de la pastille cellulaire.

Cette représentation graphique de la cicatrisation des plaies obtenue à l’aide du logiciel de microscope vidéo montre la quantification des paramètres de confluence des cellules de la plaie en fonction du temps pour quatre conditions de traitement. Il a été observé que le traitement combiné diminue considérablement la migration cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer le processus de migration et d’invasion cellulaire.