Name: Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Découvrez deux méthodes d'évaluation de l'invasion et de la migration cellulaires : le test de chambre de Boyden et le test de rayure optimisé par vidéomicroscopie. Ces protocoles permettent des comparaisons reproductibles pour la recherche en biologie cellulaire.

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Ces techniques ont été développées avec l’appui du LabEx nombres premiers (ANR-11-LABX-0063), le Contrat de Plan Etat-région (CPER) dans le cadre scientifique de l’ETOILE (CPER 2009-2013) et lyrique Grant INCa-DGCD-4664.

Remarque : Les dosages de chambre et d’éraflure de Boyden sans inclusion de l’ECM sont appelés le test de migration, et les mêmes dosages avec l’ECM est dénommé le dosage de l’invasion.
1. Boyden chambre Assay
Remarque : Ce protocole est adapté pour la cellule SQ20B, qui est dérivé d’un cancer laryngé récurrent, tête et cou Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) et a été obtenue de John Little (Boston, MA, USA).
Jour 1
<ol><li>
Cellule de semis
	<ol>
<li>Graine 2 106 SQ20B cellules dans 12 mL de milieu de culture (CM) dans une fiole de2 175 cm 72 h avant le premier jour et laisser les cellules à confluence de cellule de 80 %.<ol>
<li>Pour préparer les cellules SQ20B CM, Supplément le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et la streptomycine 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 2,5 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,5 g/L) de la trypsine. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C et puis arrêter la réaction en ajoutant 12,5 mL de CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.</li>
		<li>Les semences des cellules dans une fiole de2 25 cm à une densité cellulaire des cellules5 6 10 pour chaque condition à évaluer. Incuber les cellules pendant 24 h dans 3 mL de CM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jour 2
<ol start="2"><li>
Famine de cellules et préparation des chambres à couché
	<ol>
<li>Affamer les cellules en remplaçant le milieu dans chaque fiole avec 3 mL de milieu de sérum basse-fœtal (SVF) à l’aide de 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) au lieu de FBS. Affamer les cellules pendant 24 h dans l’incubateur.<ol>
<li>Pour préparer la famine CM (s-CM), Supplément DMEM avec 0,1 % de BSA, hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour le test de migration, passez à l’étape 1.3.</li>
		<li>Pour le dosage de l’invasion, 12 h avant le jour 3, préparer les chambres Boyden couchés en ajoutant 500 μL de s-CM à chaque chambre couché. Utilisation préparés commercialement enduit Boyden chambers et les conserver à 4 ° C avant utilisation. Placer chaque chambre de Boyden dans la plaque de compagnon et mettez-le dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jour 3
<ol start="3"><li>
Cellule de semis dans la chambre de Boyden
	<ol>
<li>La plaque de compagnon permet de préparer le facteur chimiotactique. Remplir chaque puits de la plaque 24 puits compagnon avec 750 μl de milieu complet avec 10 % FBS, hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.<ol>
<li>Adapter le facteur chimiotactique pour chaque ligne de la cellule et chaque condition de traitement. Pour préparer le facteur chimiotactique CM (ca-CM), Supplément DMEM avec 10 % FCS, hydrocortisone de 0,4 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transvaser la chambre supérieure dans la plaque de compagnon préremplie, en prenant soin d’éviter les bulles.</li>
		<li>Pour le dosage de l’invasion, retirez soigneusement 450 μL de CM dans chaque chambre de Boyden.</li>
		<li>Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS stérile, ajouter 0,5 mL de trypsine EDTA (0,5 g/L) et puis incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.</li>
		<li>Les semences 3 104 SQ20B cellules de 500 μl de milieu de 0,1 % de BSA, donnant une dilution finale de 6 104 cellules/mL. NOTE : Il convient d’adapter la concentration cellulaire de chaque lignée cellulaire.</li>
		<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C pendant 24 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jour 4
<ol start="4"><li>
Fixation de la cellule et coloration
	<ol>
<li>Fixer les cellules avant le temps de doublement spécifique à cette lignée de cellules. Difficulté SQ20B cellules avant 24h.</li>
		<li>Retirer chaque insert de la plaque de compagnon et retirer délicatement les cellules de la chambre haute à l’aide d’un coton-tige. Il est particulièrement important d’éliminer toutes les cellules situées dans la chambre haute.</li>
		<li>Difficulté et colorer chaque insert individuellement pour obtenir mai-Grunwald Giemsa coloration9 à l’aide de la trousse de coloration fournie. Alternativement, utilisez paraformaldéhyde à 4 % dans une autre plaque de compagnon pour une fixation de 30 min.</li>
		<li>Garder les insertions dans une assiette vide 24 puits compagnon sous une hotte de laboratoire à sécher chaque chambre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jour 5
<ol start="5"><li>
Analyse au microscope
	<ol>
<li>Insérer la plaque de compagnon avec les inserts sur un microscope à contraste de phase 20 et compter chaque cellule migré sur la partie inférieure de la membrane. Optimiser la position de foyer droite en déplaçant l’objectif du bas vers le haut et la position de cuisson sur la partie inférieure de la membrane.</li>
		<li>Calculer le ratio entre le nombre de cellules migrés et cellules ensemencées. Répétez chaque chef d’accusation pour chaque condition de traitement en trois exemplaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. zéro blessure Assay : La Migration cellulaire
Remarque : Les Instructions doivent être adaptées pour chaque type de cellule.
Jour 1
<ol><li>
Cellule de semis
	<ol>
<li>Graine 2 x 106 SQ20B cellules dans 12 mL de CM dans une fiole de2 175 cm 72 h avant le premier jour et laisser les cellules à confluence de cellule de 80 %.</li>
		<li>Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS stérile, ajouter 2,5 mL de trypsine EDTA (0,5 g/L) et incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 12,5 mL de CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.</li>
		<li>Générer un échantillon dilué à une densité de 4 x 105/ml, ce qui donne une densité finale de 4 104 cellules par 100 μl à chaque puits. Cette concentration doit être adaptée pour chaque lignée cellulaire et devrait être de l’ordre de 1 x 104 6 104 cellules.</li>
		<li>Cellules de semences dans chaque puits d’une plaque 96 puits de dépôt 100 μL de la solution préparée à l’étape 2.1.2.</li>
		<li>Laisser la plaque à température ambiante pendant 5 min disperser les cellules uniformément sur le fond des puits.</li>
		<li>Placer la plaque dans l’incubateur et de permettre aux cellules d’adhérer à la plaque pour 12 à 16 h (maximum) à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jour 2
<ol start="2"><li>
Gratter la plaie dosage
	<ol>
<li>Enlever les plaques préparées à l’étape 2.1 de l’incubateur.</li>
		<li>Sous le capot, faire une blessure en utilisant le dispositif commercial blessant selon le protocole du fabricant.</li>
		<li>Retirez immédiatement le milieu de chaque bien en utilisant une pipette avec une pointe conique adaptée, en prenant soin de ne pas pour toucher la plaie.</li>
		<li>Laver les cellules deux fois en répétant l’aspiration en utilisant 100 μL de CM chauffé à 37 ° C pour chaque puits.</li>
		<li>Enlevez le CM à l’aide d’une pipette avec une pointe conique adaptée après les étapes de lavage.</li>
		<li>Ajouter 100 μl de milieu spécifique pour chaque condition de traitement dans chaque puits.</li>
		<li>Essayez d’éviter de créer des bulles dans les puits. Une technique de pipetage inverse peut être utile ici. Vous pouvez également enlever les bulles avec une aiguille de seringue.</li>
		<li>Placer la plaque dans le rack adapté du microscope vidéo.</li>
		<li>Afin d’améliorer la qualité de l’image, laissez la plaque au chaud pendant au moins 15 minutes avant que le premier balayage pour éviter la condensation sur la face inférieure de la plaque.</li>
		<li>Programme de la planification des analyses, en utilisant le logiciel de vidéo microscope à une seule image par puits. Il faut un intervalle de 2 h maximum pour une expérience de l’immigration-invasion. Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle de 30 min maximum est préféré.</li>
		<li>À la fin de l’expérience, laver l’appareil blessant soigneusement et suivre chacune des quatre étapes de lavage indiquées par le fabricant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jours 3, 4 et 5
<ol start="3"><li>
Analyse de la migration à l’aide du microscope vidéo
	<ol>
<li>Pour un minimum de 24 h et jusqu'à 5 jours, surveiller et vérifier la migration cellulaire.</li>
		<li>Un masque de cellule approprié adapté pour chaque type de cellule permet d’analyser la migration cellulaire. Pour obtenir un masque cellulaire adapté pour chaque lignée cellulaire, générer une cellule traitement définition tirée du logiciel à l’aide d’une collection d’images de cellules spécifiques.</li>
		<li>Tracer les courbes et exporter les données dans une feuille de calcul, qui peut être utilisé pour analyser et comparer les résultats.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. zéro blessure Assay : Invasion des cellules
Remarque : Les Instructions doivent être adaptées pour chaque type de cellule.
Jour 1
<ol><li>
Cellule de semis
	<ol>
<li>Utiliser le même protocole pour cellule semis comme indiqué au point 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jour 2
<ol start="2"><li>
Préparation de l’ECM
	<ol>
<li>Décongeler la matrice pendant au moins 12 h avant de l’utiliser à 4 ° C. S’assurer qu’aucun agrégat n’est visibles. Si les agrégats sont visibles, garder la matrice à 4 ° C pendant une période prolongée jusqu'à disparaissent des agrégats. Garder la matrice sur la glace. Utiliser des pointes de pipette jetable. Remarque : La matrice consolidera sinon conservés à 4 ° C.</li>
		<li>Faites refroidir les tubes de microcentrifuge sur glace pendant 5 min.</li>
		<li>Prenez CM refroidi à 4 ° C du réfrigérateur et diluer la matrice dans les tubes de microcentrifuge rafraîchies pour obtenir une concentration finale de 300 μg/mL.</li>
		<li>Retourner les tubes de microcentrifuge avec matrice calibrant au réfrigérateur à 4 ° C. Remarque : Une grille adaptée pour les tubes de microcentrifuge est utile pour maintenir les tubes à 4° C tout au long de l’expérience.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jour 2
<ol start="3"><li>
Dosage zéro blessure et le traitement de l’ECM
	<ol>
<li>Retirez la plaque préparée à l’étape 3.1 de l’incubateur.</li>
		<li>Sous le capot, faites la plaie en utilisant le dispositif commercial blessant selon le protocole du fabricant.</li>
		<li>Retirez immédiatement le milieu de chaque bien en utilisant une pipette avec une pointe conique adaptée prenant soin de ne pas pour toucher la plaie.</li>
		<li>Laver les cellules deux fois en répétant la procédure d’aspiration en utilisant 100 μL de CM chauffé à 37 ° C.</li>
		<li>Après le deuxième lavage, placer la plaque sur l’incubateur de 4 ° C à équilibrer sa température pendant 5 min.</li>
		<li>Enlever le milieu froid de chaque puits avec la pipette d’aspiration avec une pointe conique, en prenant soin de Pipetter soigneusement le bord et pour éviter de toucher la plaie.</li>
		<li>Ajouter 50 μL de matrice pré-dilué dans chaque puits à l’aide de pointes coniques rafraîchies à 4 ° C.</li>
		<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C pendant 30 min. Remarque : Une grille de soutien préchauffée à 37 ° C est utile pour accélérer le réchauffement de la plaque à 96 puits.</li>
		<li>Retirez la plaque de l’incubateur et ajouter 100 μL de la CM adaptée à chaque puits comme il est indiqué pour chaque condition de traitement.</li>
		<li>Essayez d’éviter de créer des bulles dans les puits. Une technique de pipetage inverse peut être utile ici. Vous pouvez également enlever les bulles avec une aiguille de seringue.</li>
		<li>Placer la plaque dans le rack adapté dans le microscope vidéo.</li>
		<li>Afin d’améliorer la qualité de l’image, laissez la plaque au chaud pendant au moins 15 minutes avant que le premier balayage pour éviter la condensation sur la face inférieure de la plaque.</li>
		<li>Programmer l’horaire de numérisations, utilisant le logiciel de vidéo microscope à une seule image par puits, dans le mode de balayage Scratch enroulés. Un intervalle de 2 h maximum dans requis pour une expérience de l’immigration-invasion. Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle de 30 min maximum est préféré.</li>
		<li>À la fin de l’expérience, laver l’appareil blessant soigneusement et suivre chacune des quatre étapes de lavage indiquées par le fabricant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Jours 3, 4 et 5
<ol start="4"><li>
Analyse d’invasion des cellules à l’aide d’un microscope vidéo.
	<ol>
<li>Répétez l’étape 2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
<li>Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+cancer+stem%28-like%29+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).</li>
<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
<li>Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).</li>
<li>Chen, H. -C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/922b/e08c04a3ad311a32ca0fc52644681f1bf8b7.pdf">Boyden chamber assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous rapportons deux modalités différentes d’étudier le processus d’invasion et de la migration des cellules. L’analyse de ce processus est importante pour comprendre les facteurs de récidive métastatique, qui pourrait s’expliquer par la motilité accrue d’une sous-population de cellules cancéreuses appelé cancer cellules souches10,11.
L’expérience de chambre de Boyden est celle utilisée le plus souvent invasion et migration des cellule...

Migration et invasion des cellules sont impliqués dans la dissémination des cellules cancéreuses, qui est la principale cause de la résistance au traitement1 et peuvent conduire à locorégional ou récidive métastatique après traitement de cancer2. La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) est le processus initial de la migration-invasion cellulaire dans lequel le cancer cellules passer d’un épithélium à un phénotype mésenchymateux. E-cadhérine est un marqueur extracellulaire du phénotype épithéliales3, et une expression accrue de la N-cadhérine et la vimentine est caractéristique du phénotype mésenchymateuses4. Migration dépend aussi de la capacité intrinsèque des cellules cancéreuses à envahir la matrice extracellulaire (ECM) sous l’action des métalloprotéases de matrice5.
Ce mécanisme d’invasion – migration a été décrite pour le cancer dans de nombreux endroits, notamment dans la tête et du cou, du cancer6. De nombreux chercheurs ont mis l’accent sur les processus de migration et invasion de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses diffusent dans l’espoir que cette connaissance conduira à nouvelles stratégies de traitement. Il est crucial que ces études sont réalisées à l’aide de tests fiables et reproductibles.
L’analyse in vitro de la motilité cellulaire peut être difficile. Mis au point il y a de nombreuses années, le test de chambre de Boyden est considéré comme la norme pour l’invasion – migration analyse7. Cependant, il prend beaucoup de temps et est souvent inexacte. Un deuxième essai est la cicatrisation test8, qui consiste à faire une égratignure sur la culture cellulaire monocouche et capturer des images de l’invasion cellulaire et migration à intervalles de temps fixes. Cette technique a été largement critiquée en raison des grandes variations entre les résultats de deux tests successifs. Cependant, l’application des technologies modernes, notamment en microscopie, a amélioré la reproductibilité du dosage zéro blessure. Microscopes vidéo peuvent être facilement introduits en couveuse et peuvent générer des images en temps réel de la migration cellulaire. Ces appareils enregistrent des données microscopiques et fournissent une analyse automatique de confluence cellulaire plaie au fil du temps. Cet article vise à décrire le test de chambre de Boyden et le dosage optimisé plaie de grattage et de discuter les avantages et les faiblesses de chaque approche.

<table><tbody><tr><td>Sérum de veau fœtal Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone soluble dans l’eau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Mélange de noix (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>La solution doit être préparée juste avant utilisation car elle est très instable</td></tr><tr><td>Particule de soc Z1</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Olympus&nbsp ;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B Lignée cellulaire</td><td>Don de John Little' s Fabricant</td> <td>de</td><td></td> plaies de laboratoire</tr> <tr><td></td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>Conserver dans un endroit sûr et sec</td></tr><tr><td>Plaque ImageLock à 96 puits</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox 96F Système avec CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox avec système M30</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Insert</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Insert Enduit</td><td>Dominique Dutcher</td><td>354483</td><td>Se vendent à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Companion Plaque 24 puits</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel standard</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>Stocker à -20&deg ;C.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de coloration RAL 555</td><td>RAL Diagnostics</td><td>&nbsp ; 361550</td><td>Stocker dans un endroit sûr et sec</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’invasion des cellules et le processus de migration : une comparaison de la rayure axée sur le microscope vidéo blessure test et le test de chambre de boyden

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Les capacités d’invasion et de la migration des cellules tumorales sont les principaux contributeurs à la progression du cancer et de la récurrence. De nombreuses études ont exploré les capacités de migration et invasion de comprendre comment les cellules cancéreuses diffusent, dans le but de développer de nouvelles stratégies de traitement. Analyse des fondements cellulaires et moléculaires de ces capacités a conduit à la caractérisation de la mobilité de la cellule et les propriétés physico-chimiques du cytosquelette et microenvironnement cellulaire. Pendant de nombreuses années, le test de chambre de Boyden et le dosage zéro blessure ont été les techniques standards d’étudier la migration et l’invasion des cellules. Toutefois, ces deux techniques ont des limites. L’essai de chambre de Boyden est longue et difficile, et le dosage zéro blessure a faible reproductibilité. Développement des technologies modernes, notamment en microscopie, a augmenté la reproductibilité du dosage zéro blessure. À l’aide de systèmes d’analyse puissants, un microscope video de « en-incubateur » peut être utilisé pour fournir une analyse automatique et en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion. L’objectif de cette communication est de déclarer et de comparer les deux essais utilisés pour étudier l’invasion cellulaire et migration : le dosage de chambre de Boyden et une optimisée en vitro vidéo axée sur le microscope scratch enroulés dosage.

Nous présentons ici deux méthodes différentes pour analyser les migrations et l’invasion des cellules. La figure 1 montre la Boyden expérience en chambre. Les inserts sont placées dans une assiette de compagnon avec chemoattractant moyen, et les cellules sont ensemencées en CM. La membrane peut être non couchée (test de migration) ou couché (dosage de l’invasion). Les cellules sont ensemencées dans la chambre haute en s-CM. La chambre basse est remplie de CM ...

Cette étude rend compte de deux méthodes différentes pour l’analyse de l’invasion cellulaire et migration : le test de chambre de Boyden et l’essai in vitro vidéo axée sur le microscope cicatrisation avec. Les protocoles de ces deux expériences sont décrites, et leurs avantages et leurs inconvénients sont comparés.

Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

L’objectif global de cette expérience est de rapporter et de comparer les deux tests utilisés pour étudier l’invasion et la migration cellulaires, le test en chambre Boyden et un test optimisé de plaie par égratignure au microscope vidéo in vitro. Ces expériences peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine d’étude de l’invasion et de la migration, telles que le choix de la méthode la plus pertinente. Le principal avantage de ce test de plaie par égratignure basé sur la microscopie vidéo in vitro optimisée est qu’il fournit une comparaison reproductible et précise entre les conditions de traitement.Bien que cette méthode puisse évaluer la migration et l’invasion cellulaires, elle peut également être appliquée à d’autres domaines d’étude tels que la cicatrisation ou la régénération tissulaire. Préparez les cellules SQ20B 72 heures avant le premier jour de l’essai en enchaînant deux fois 10 cellules 1/6 dans 25 millilitres de milieu de culture dans une fiole de 175 centimètres carrés. Laissez les cellules croître jusqu’à 80 % de confluence cellulaire à 37 degrés Celsius.Le premier jour après la trypsinisation et le comptage cellulaire, ensemencez les cellules dans un flacon de 25 centimètres carrés à une densité cellulaire de six fois 10 pour 1/5 cellules dans trois millilitres de milieu de culture pour chaque condition à évaluer. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, affamez les cellules en remplaçant le milieu dans chaque flacon par trois millilitres de sérum bovin à faible teneur fœtale.Affamez les cellules de l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour l’essai d’invasion, préparez les chambres de Boyden revêtues 12 heures après le début de la famine cellulaire. Placez chaque chambre Boyden dans l’assiette d’accompagnement.Ajouter 500 microlitres de milieu de cellule de famine dans chaque chambre enrobée. Le lendemain, le troisième jour, utilisez l’assiette d’accompagnement pour préparer le chimioattractant. Remplissez chaque puits de la plaque d’accompagnement de 24 puits avec 750 microlitres de milieu complet avec 10 % de FBS, de l’hydrocortisone, de la pénicilline et de la streptomycine.Transférez la chambre supérieure dans la plaque d’accompagnement préremplie en prenant soin d’éviter les bulles. Pour l’essai d’invasion, retirer avec précaution 450 microlitres de milieu de culture de chaque chambre Boyden. Après trypsinisation et comptage des cellules SQ20B affamées, ensemencez trois fois 10 pour les cellules 1/4 dans 500 microlitres de milieu à 0,1 % BSA donnant une dilution finale de six fois 10 pour 1/4 cellules par millilitre.Placez la chambre Boyden dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le quatrième jour, retirez chaque insert de la plaque d’accompagnement et retirez soigneusement les cellules de la chambre supérieure à l’aide d’un coton-tige. Par la suite, fixez et teignez chaque insert individuellement pour obtenir une coloration May-Grunwald Giemsa à l’aide d’un kit de coloration selon les instructions du fabricant.Effectuez une analyse microscopique le cinquième jour. Insérez la plaque d’accompagnement avec les inserts dans un microscope à contraste de phase 20X et comptez chaque cellule migrée sur la partie inférieure de la membrane. 72 heures avant le premier jour de l’essai, semer deux fois 10 cellules 1/6 SQ20B dans 25 millilitres de milieu de culture dans une fiole de 175 centimètres carrés et laisser les cellules croître jusqu’à 80 % de confluence cellulaire.Le premier jour après la trypsinisation et le comptage des cellules, générez un échantillon pré-dilué des cellules SQ20B à une densité de quatre fois 10 à 1/5 de cellules par millilitre. Distribuez 100 microlitres de la solution cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour donner une densité finale de quatre fois 10 aux 1/4 cellules par 100 microlitres dans chaque puits. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et laissez les cellules adhérer à la plaque pendant 12 à 16 heures.Le lendemain, apportez la plaque au capot pour la blessure à l’aide d’un dispositif de blessure commercial. Retirez le haut de l’enrouleur et placez-le dans la solution de lavage du bateau. Insérez la plaque dans le support de plaque de base et retirez le couvercle de la plaque.Replacez le bloc de goupille en guidant les chevilles arrière du bloc de goupille dans les trous arrière de la plaque de base. Poussez et maintenez le levier noir et soulevez le bloc de goupille tout en continuant à maintenir le levier noir enfoncé. À l’aide d’une pipette à pointe conique adaptée, prélevez immédiatement le milieu de chaque puits en prenant soin de ne pas toucher la plaie.Lavez les cellules en ajoutant à chaque puits 100 microlitres de milieu cellulaire chauffé à 37 degrés Celsius. Après le deuxième lavage, utilisez une pipette avec une pointe conique adaptée pour aspirer le milieu cellulaire. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu spécifique pour chaque condition de traitement à chaque puits en veillant à éviter de créer des bulles dans les puits.Placez la plaque à 96 puits dans le support adapté du microscope vidéo. À l’aide du logiciel de microscope vidéo, programmez le calendrier des balayages à raison d’une image par puits. Pour une expérience d’invasion migratoire, un intervalle maximal de deux heures est requis.Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle maximum de 30 minutes est privilégié. Surveiller et vérifier la migration cellulaire pendant au moins 24 heures et jusqu’à cinq jours à l’aide d’un masque cellulaire approprié et adapté à chaque type de cellule pour analyser la migration cellulaire. Pour obtenir un masque cellulaire adapté à chaque lignée cellulaire, générez une définition de traitement cellulaire à partir du logiciel à partir d’une collection d’images cellulaires spécifique.Tracez les courbes et exportez les données vers une feuille de calcul qui peut être utilisée pour analyser et comparer les résultats. Pour se préparer à l’essai d’invasion cellulaire, amorcer les cellules SQ20B de la même manière que pour l’essai de migration cellulaire et incuber la plaque à 96 puits dans l’incubateur. Le deuxième jour du test, préparez la matrice extracellulaire.Dégivrez la matrice à quatre degrés Celsius pendant au moins 12 heures avant de l’utiliser et assurez-vous qu’aucun agrégat n’est visible. Réfrigérez les tubes de microcentrifugation sur de la glace pendant cinq minutes. Diluez la matrice avec des pointes coniques pré-refroidies à quatre degrés Celsius dans les tubes de microcentrifugation pré-refroidis avec un milieu cellulaire refroidi à quatre degrés Celsius pour obtenir une concentration finale de 300 microgrammes par millilitre.Conservez les tubes de microcentrifugation avec matrice pré-diluée au réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Récupérez la plaque à 96 puits de l’incubateur. Sous le capot, faites la plaie à l’aide du dispositif de plaie commercial selon le protocole du fabricant, comme démontré précédemment.À l’aide d’une pipette avec une pointe conique adaptée, prélever immédiatement le milieu de chaque puits et faire attention de ne pas toucher la plaie. Lavez les cellules deux fois à l’aide de 100 microlitres de milieu cellulaire chauffé à 37 degrés Celsius. Après le deuxième lavage, placez l’assiette sur de la glace pendant cinq minutes pour équilibrer sa température.Retirez le milieu froid de chaque puits en prenant soin de pipeter soigneusement par le bord et d’éviter de toucher la plaie. À l’aide d’embouts coniques pré-refroidis à quatre degrés Celsius, ajoutez 50 microlitres de matrice pré-diluée dans chaque puits. Placez l’assiette dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après 30 minutes, ajoutez 100 microlitres du milieu cellulaire adapté à chaque puits, comme indiqué pour chaque condition de traitement. Placez la plaque dans le support adapté du microscope vidéo. Par la suite, programmez les balayages et effectuez une analyse de microscopie vidéo, comme démontré pour le test de migration cellulaire.Les résultats représentatifs d’une membrane de Boyden après fixation cellulaire sont montrés. La membrane sous-optimale présente des amas de cellules sur la face supérieure de la membrane et des résultats ininterprétables. En revanche, la membrane optimale a des cellules dénombrables dans la partie inférieure de la membrane colorées en bleu.Un résultat optimal du dosage de la plaie par égratignure est illustré par ces images de cicatrisation de la plaie à l’heure zéro, à 15 heures et à 30 heures. Les critères d’une expérience de qualité sont une plaie linéaire, aucun fragment cellulaire observé dans la plaie et une confluence cellulaire optimale. La confluence de 90 % est la densité cellulaire optimale pour le test de cicatrisation des plaies, comme le montre le panneau A.Le panneau C montre un exemple de faible densité cellulaire et le panneau B montre des amas de cellules causés par un lavage insuffisant de la pastille cellulaire.Cette représentation graphique de la cicatrisation des plaies obtenue à l’aide du logiciel de microscope vidéo montre la quantification des paramètres de confluence des cellules de la plaie en fonction du temps pour quatre conditions de traitement. Il a été observé que le traitement combiné diminue considérablement la migration cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer le processus de migration et d’invasion cellulaire.

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Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

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Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

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