Évaluer la motilité Neural Stem Cell utilisant un gel d'agarose à base dispositif microfluidique

Bonjour, je m’appelle Kevin et j’ai gagné. Je suis étudiante à la maîtrise en génie au laboratoire de biofluides de l’Université Cornell. Et aujourd’hui, je vais parler de l’utilisation d’un dispositif microfluidique basé sur l’agros pour étudier l’effet du facteur de croissance épidermique EGF sur les cellules souches neurologiques de Maureen.

Le dispositif se compose essentiellement de trois canaux microfluidiques de 150 microns de large chacun. L’EGF est pompé dans l’un des canaux latéraux et le tampon est pompé dans l’autre canal latéral. Il s’agit essentiellement de mettre en place un gradient chimique linéaire statique à travers le canal central.

Étant donné que la diffusion de l’EGF se diffuse facilement à travers l’agrogel, les cellules souches neuronales sont ensemencées dans le canal central et la progression de leur migration est suivie au microscope. Ainsi, les appareils sont essentiellement composés d’une couche supérieure en plexiglas qui comporte toutes les entrées et sorties pour se connecter au tube. Et en dessous se trouve une membrane en agrogel, qui contient quatre dispositifs de motif.

Celui-ci est entouré d’une entretoise PDMS, ce qui garantit que nous avons une épaisseur constante dans l’ensemble de l’appareil. Le PDMS et le gel s’assemblent sur une lame de verre, qui est recouverte d’ect. Cela aide les cellules à adhérer à la lame de verre.

De plus, la plaque en acier inoxydable est utilisée pour monter l’ensemble de l’appareil et nous Sam prenons l’appareil en sandwich avec des vis. La lignée cellulaire de type sauvage a été transfectée avec un vecteur rétroviral pour surexprimer le récepteur EGF de type sauvage et la lignée cellulaire delta a été transfectée avec une version mutée du récepteur EGF qui lui permet d’être constitutivement active sans le ligand EGF. D’accord, je vais commencer par expliquer le processus d’assemblage de notre dispositif microfluidique.

J’ai donc d’abord placé l’entretoise PDMS autour des caractéristiques en relief des micro-canaux en silicium de nos masters. Alors maintenant, je vais peser 0,3 gramme d’agros. Alors maintenant, je vais apporter 10 millions de médias indépendants du CO2 et les ajouter à l’agro.

Et je vais pipeter de haut en bas pour mélanger la poudre aros avec le média indépendant du CO2. Nous sommes maintenant prêts pour le micro-ondes. Comme vous pouvez le voir maintenant, l’agros est maintenant liquéfié, mais il reste encore quelques granulés.

Je vais essayer de le faire tourner pour dissoudre le granule et me débarrasser des bulles d’air. Je verse donc l’agros fondu sur les éléments en relief du maître en silicium et je vais maintenant prendre une lame de verre stérile et la placer sur l’entretoise PDMS. Et je l’ai mis à un angle pour essayer de forcer la plupart des bulles d’air dans le gel agricole à sortir.

Et j’ai appliqué une pression et je continuerai à appliquer une pression jusqu’à ce que la coquille de l’agros se solidifie. Donc, après une à deux minutes, il s’est solidifié. Maintenant, je vais retirer l’excès d’agros de la diapositive.

L’étape suivante consiste à faire glisser doucement la lame de verre et cette diapositive de verre peut être montée. Maintenant, je vais essayer de transférer doucement le motif aros sur une lame de verre que j’ai préalablement recouverte de fibronectine. En gros, j’utilise cette feuille de plastique stérile pour m’aider à soulever le motif agros avec l’espaceur PDMM MS et je transfère le motif agros avec les canaux vers le bas vers la diapositive.

Maintenant que celui-ci est fermement sur la glissière en verre, je vais percer des trous dans les réservoirs individuels afin que le collecteur en plastique ait accès aux canaux. Je vais le faire à l’aide d’une petite perforatrice en métal. Nous avons maintenant fini de percer des trous dans l’appareil.

Je vais ajouter 500 microlitres de média indépendant du CO2 pour éviter la dessiccation des micro-canaux et je vais maintenant le laisser reposer pendant une à deux minutes. D’accord, après une à deux minutes, je vais essayer de drainer l’excès de média et maintenant je vais aligner les trous qui se sont enfoncés dans le motif agros avec les trous d’entrée et de sortie du collecteur en plexiglas. Et une fois les trous alignés, j’appuie fermement pour former une belle étanchéité.

Maintenant, je place le collecteur en plexiglas sur les supports en acier inoxydable et maintenant je vais doucement prendre l’appareil en sandwich à l’aide de vis. Je fais très attention à ne pas trop serrer les vis car cela écraserait les canaux et je place les vis dans le sens des aiguilles d’une montre pour éviter que l’intérieur d’un motif de gel Agros ne s’emboîte. Je vais dessiner un mil de support et j’utiliserai cette seringue pour tester l’appareil.

Et comme vous pouvez le voir, j’injecte du liquide dans chaque microcanal et je cherche du liquide qui sort de chaque sortie. Donc, à l’heure actuelle, j’ai placé l’appareil assemblé dans la chambre environnementale du microscope. Celle-ci est maintenue à 37 degrés Celsius, ce qui réchauffera l’appareil et le préparera lorsque nous aurons besoin d’ensemencer les cellules.

Et comme vous pouvez le voir, j’ai déjà enfilé les deux, le tube de la pompe du parasol à travers la configuration. Et je suis actuellement en train de rincer le tube avec du PBS en préparation de nos expériences. Nous allons maintenant configurer le tube.

Je vais enfiler le tube de la pompe du parasol à travers les bouchons avec des trous déjà percés. Et chaque tube a un, a un nombre spécifique d’encoches pour que je puisse identifier à la fois l’entrée et la sortie du tube. Ainsi, le tube avec quatre encoches recevra les 10 nanogrammes par mil.

La solution EGF va maintenant fixer le tube à l’appareil. Je vais donc l’attacher à chaque appareil en fonction du nombre d’encoches qu’il possède. Il correspond donc à la solution qu’il prend.

Et maintenant, je fixe le tube de sortie. Nous utilisons un tube tigon transparent pour nous assurer que le média s’écoule bien à travers le tube de sortie et qu’il n’y a pas de blocages dans le canal. Et maintenant, je vais commencer les pompes de parasol.

Je vais maintenant commencer la procédure d’ensemencement des cellules dans le canal central. Je vais commencer par retirer l’excédent de média dans le canal du capteur. Alors maintenant, je vais voir les cellules.

Les cellules sont déjà en suspension dans des milieux indépendants du CO2. Et j’étais vendeur, j’étais assis à 60 dans l’entrée du canal central et j’étais assis à 20 microlitres dans la sortie. Et j’espère que les cellules seront assises par un écoulement entraîné par la gravité.

Et je vais répéter cette procédure pour les deux autres canaux sensibles et nous allons maintenant observer cela au microscope pour voir si l’implantation des cellules a réussi. Alors maintenant, les cellules ont adhéré à la lame de verre et en quelques minutes, elles commenceront à se propager et à atteindre leur morphologie unique. Aujourd’hui, nous avons donc couvert l’assemblage de l’appareil proprement dit, la préparation des réactifs et les techniques de microscope que j’utilise pour imager la migration cellulaire à l’intérieur de l’appareil.

En conclusion, nous espérons que ce dispositif aura une abdication beaucoup plus large, en particulier dans le cadre clinique. Figurez-en un horizontalement. Il montre les trajectoires des cellules C 17.2 et l’augmentation verticale des concentrations d’EGF.

Il montre les trajectoires des différentes souches des cellules C 17.2 que nous avons utilisées dans nos expériences avec la même concentration d’EGF. Les données sur les cellules parentales montrent qu’il y a un pic de motilité au gradient de concentration de 10 nanogrammes par mil, ce qui indique que les récepteurs sont devenus saturés de ligand à une concentration plus élevée d’EGF. Et les données de type sauvage montrent qu’il y a une augmentation de la motilité à une concentration de cent nanogrammes par mil ou EGF.

Cela indique que les récepteurs ne deviennent pas saturés à des concentrations plus élevées d’EGF. Cela a du sens puisqu’ils ont été conçus pour surexprimer le récepteur EGF. Enfin, les données de la lignée cellulaire delta indiquent que la motilité des cellules est à peu près indépendante de la concentration d’EGF.

Cela est également prévisible puisque les récepteurs EGF mutés ont été conçus pour être activés indépendamment de la présence d’EGF.