Protocoles pour l'inoculation vaginale et prélèvement d'échantillons dans le modèle expérimental chez la souris des Candida Vaginite

L’objectif global de cette procédure est de démontrer les problèmes procéduraux spécifiques associés à l’utilisation du modèle animal expérimental de candidose vaginale comme moyen de quantifier la charge fongique vaginale, et également d’utiliser des cellules vaginales ou lymphoïdes dans des tests spécifiques tels que des tests immunologiques et histologiques. Pour ce faire, on fera d’abord la démonstration de la technique d’inoculation vaginale sur des souris traitées à des œstrogènes. Ensuite, après l’euthanasie de la souris, un lavage vaginal sera effectué pour récupérer le candida.

Ensuite, le tissu vaginal et/ou les ganglions lymphatiques de drainage vaginal seront extraits. Le liquide de lavage peut être visualisé au microscope pour montrer le candida associé aux cellules épithéliales vaginales ou plaqué sur gélose pour quantifier la charge fongique vaginale. Un frottis de la fraction cellulaire peut également être utilisé pour colorer les cellules épithéliales et les cellules lymphoïdes.

Ainsi, le principal avantage de la démonstration de cette technique est que les utilisateurs du modèle animal de vaginite peuvent le faire de la manière la plus efficace possible. Et les questions clés auxquelles la technique répond sont dans le domaine de la vaginite et de l’écologie et répondent à des questions clés telles que les réponses immunitaires de l’hôte, la distribution cellulaire, l’efficacité des médicaments, l’efficacité immunothérapeutique, ainsi que les effets de l’immunisation et la démonstration de la technique. Aujourd’hui, ce sera un étudiant diplômé dans mon laboratoire, junco yano, pour infecter une souris avec C albicans trois jours après avoir administré une injection de bêta-œstradiol.

Commencez par stabiliser la souris sur une surface plane gRED pour qu’elle puisse la saisir. Tenez ensuite la base de la queue avec deux doigts et soulevez la hanche vers le haut de manière à ce que l’ouverture vaginale soit tournée vers vous. Insérez l’embout de la pipette à environ cinq millimètres de profondeur dans la lumière vaginale et pipetez jusqu’à 20 microlitres de la suspension d’inoculum.

Effectuez cette étape aussi rapidement et doucement que possible pour minimiser la détresse de la souris. Après la période d’incubation souhaitée, euthanasiez l’animal selon le protocole de votre établissement. Ensuite, avec deux doigts, tenez la souris vers le bas par la base de la queue de sorte que l’ouverture vaginale soit exposée avec une pipette.

Introduisez 100 microlitres de PBS stérile dans la lumière vaginale et, avec une aspiration et une agitation répétées, effectuez un lavage. Si la pointe de la pipette est obstruée par des cellules, distribuez les cellules obstruantes et continuez à ravager avec le PBS restant. Recueillir le liquide de lavage dans un micro-tube à centrifuger.

Après la procédure de lavage vaginal, allongez la souris sur le dos et saturez la région de l’aine avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une paire de pinces, soulevez l’orifice urinaire vers le haut afin que l’ouverture vaginale soit exposée. Insérez une paire de pinces incurvées dans la lumière vaginale et localisez le col de l’utérus tout en maintenant une prise ferme avec la pince.

Extrayez le col de l’utérus par la cavité vaginale, excisez le vagin à la base de l’ouverture vaginale, puis retirez le col de l’utérus du vagin avec des ciseaux chirurgicaux. Parce que le tissu vaginal est involué, inversez-le pour maintenir l’orientation d’origine ou ouvrez-le en une feuille en faisant une incision latérale pour l’excision du ganglion lombaire avec l’animal sur le dos. Saturez l’abdomen avec 70 % d’éthanol.

Faites une incision latérale en partant du bas-ventre vers la poitrine et exposez les organes internes à l’aide d’une paire de pinces dans les deux mains. Déplacez les intestins vers le haut pour que les vaisseaux sanguins centraux deviennent visibles. Localisez la veine inférieure et l’aorte abdominale.

Une paire de ganglions lymphatiques lombaires peut être identifiée à côté de l’aorte abdominale, située à peu près à mi-chemin entre l’origine des artères rénales et iliaques communes. Ces ganglions lymphatiques se distinguent visuellement du tissu adipeux par leur texture élastique et sont de couleur plus claire et plus opaque que le tissu adipeux. Ils sont également nettement plus grands chez les animaux infectés par rapport aux animaux non inoculés.

Les animaux excisaient les ganglions lymphatiques en plaçant des micro-pinces sous le ganglion, puis tiraient doucement vers le haut pour les séparer des tissus environnants. Après l’excision du tissu, transférez les ganglions lymphatiques sur un tamis en treillis métallique stérile placé à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre stérile contenant environ 10 millilitres de solution saline équilibrée de Hank. Pour isoler les cellules lymphoïdes, reportez-vous au protocole écrit.

Les fractions cellulaires du liquide de lavage vaginal de souris inoculées au moins quatre jours auparavant sont généralement constituées de cellules épithéliales de candida et d’infiltrats cellulaires, comme le montre ici la microscopie à montage humide. Le Candida peut être identifié par la présence de PHA ainsi que de levures. Ici, les préparations de frottis de liquide de lavage vaginal sont tachées.

Utilisation de la technique du frottis pour examiner les cellules épithéliales et les leucocytes infiltrants dont les cellules principales sont les neutrophiles, comme on peut l’identifier par les lobes de traclear. Très peu de neutrophiles, voire aucun, sont détectés chez les souris non inoculées. Cette figure montre un exemple de charge fongique vaginale.

Le liquide de lavage vaginal est prélevé à des moments précis et mis en culture pour le dénombrement de l’UFC. Dans cet exemple, le liquide a été prélevé au cinquième jour après l’inoculation, en série, dilué sur plaque et incubé pendant 48 heures. Les colonies sont ensuite comptées et la charge fongique vaginale calculée, la colonisation vaginale ou l’infection par le candida persiste pendant des semaines chez les souris inoculées traitées aux œstrogènes.

Alors que le candida ne parvient pas à établir une colonisation vaginale chez les souris inoculées non traitées aux œstrogènes, les souris non inoculées traitées aux œstrogènes restent négatives pour le candida tout au long du temps. De plus, les lavages vaginaux peuvent être effectués soit une fois sur des souris distinctes à chaque point temporel, soit longitudinalement chez les mêmes souris sous anesthésie. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de retenir les animaux en toute sécurité pour éviter un traumatisme au vagin, et veuillez prendre le temps nécessaire pour bien laver les animaux afin d’obtenir une charge fongique vaginale précise lors de l’extraction des tissus vaginaux.

Utilisez encore du PBS pour les empêcher de se déshydrater, et veillez à ne pas endommager les principales veines et artères lors de l’ablation des ganglions lymphatiques et lors du traitement des cellules des ganglions lymphatiques, gardez-les sur de la glace ou à quatre degrés pour maintenir la viabilité cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le modèle murin expérimental de la vaginite à candida pour quantifier de manière reproductible la charge fongique vaginale et exciser les tissus vaginaux ou lymphoïdes pour des tests immunologiques ou histologiques spécifiques.