Protocoles pour l'inoculation vaginale et prélèvement d'échantillons dans le modèle expérimental chez la souris des Candida Vaginite

L'objectif général de cette procédure est de démontrer des problèmes spécifiques liés à l'utilisation du modèle animal expérimental de candidose vaginale afin de quantifier la charge fongique vaginale, ainsi que d'utiliser des cellules vaginales ou lymphoïdes dans des tests spécifiques tels que des dosages immunologiques et histologiques. Cela sera réalisé en premier lieu en démontrant la technique d'inoculation vaginale sur des souris traitées par œstrogènes. Ensuite, après l'euthanasie de la souris, un lavage vaginal sera effectué pour récupérer Candida.

Ensuite, le tissu vaginal et/ou les ganglions lymphatiques drainant le vagin seront prélevés. Le liquide de lavage peut être observé au microscope pour mettre en évidence la présence de Candida associé aux cellules épithéliales vaginales, ou ensemencé sur gélose afin de quantifier la charge fongique vaginale. Un frottis de la fraction cellulaire peut également être utilisé pour colorer les cellules épithéliales et les cellules lymphoïdes.

Le principal avantage de la démonstration de cette technique est de permettre aux utilisateurs du modèle animal de vaginite de l'appliquer de manière aussi efficace et efficiente que possible. Les questions clés auxquelles répond cette technique se situent dans les domaines de la vaginite et de l'écologie, et permettent d'aborder des points essentiels tels que les réponses immunitaires de l'hôte, la distribution cellulaire, l'efficacité des médicaments, l'efficacité des immunothérapies, ainsi que les effets de l'immunisation et la démonstration de la technique elle-même. Aujourd'hui, une étudiante diplômée de mon laboratoire, Junco Yano, infectera une souris avec C albicans trois jours après l'administration d'une injection de bêta-estradiol.

Commencez par stabiliser la souris sur une surface plate de couleur rouge afin qu'elle puisse s'agripper. Ensuite, tenez la base de la queue avec deux doigts et soulevez la hanche vers le haut de manière à orienter l'ouverture vaginale vers vous. Insérez la pointe de pipette d'environ cinq millimètres de profondeur dans la lumière vaginale et aspirez jusqu'à 20 microlitres de la suspension inoculée.

Effectuez cette étape aussi rapidement et délicatement que possible afin de minimiser le stress chez la souris. Après la période d'incubation souhaitée, euthanasiez l'animal conformément au protocole en vigueur dans votre établissement. Ensuite, à l’aide de deux doigts, maintenez la souris par la base de la queue, la tête vers le bas, de manière à exposer l’ouverture vaginale à l’aide d’une pipette.

Introduisez 100 microlitres de PBS stérile dans la lumière vaginale et effectuez une lavage par aspirations et agitations répétées. Si l'embout de la pipette s'obstrue avec des cellules, expulsez les cellules obstruant l'embout et poursuivez le lavage avec le PBS restant. Recueillez le liquide de lavage dans un tube de microcentrifugeuse.

Après la procédure de lavage vaginal, placer la souris sur le dos et saturer la région de l'aine avec de l'éthanol à 70 %. À l'aide d'une pince, soulever l'orifice urinaire vers le haut afin d'exposer l'orifice vaginal. Insérer une pince courbe dans la lumière vaginale et localiser le col de l'utérus tout en maintenant une prise ferme avec la pince.

Extraire le col de l'utérus par la cavité vaginale, exciser le vagin à la base de l'orifice vaginal, puis retirer le col de l'utérus du vagin à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Comme le tissu vaginal est invaginé, l’invaginer pour conserver l’orientation d’origine ou l’ouvrir en une lame en pratiquant une incision latérale afin d’exciser le ganglion lombaire avec l’animal en décubitus dorsal. Imprégner l’abdomen d’éthanol à 70 %.

Effectuez une incision latérale en partant de l'abdomen inférieur jusqu'au thorax et exposez les organes internes à l’aide d’une pince tenue dans chaque main. Déplacez les intestins vers le haut afin que les vaisseaux sanguins centraux deviennent visibles. Repérez la veine cave inférieure et l’aorte abdominale.

Une paire de ganglions lymphatiques lombaires peut être identifiée adjacente à l'aorte abdominale, située approximativement à mi-chemin entre l'origine des artères rénales et des artères iliaques communes. Ces ganglions lymphatiques peuvent être distingués visuellement du tissu adipeux par leur texture élastique et présentent une couleur plus claire et plus opaque que le tissu adipeux. Ils sont également nettement plus gros chez les animaux infectés par rapport aux animaux non inoculés.

Les animaux ont excisé les ganglions lymphatiques en plaçant une micro-pince sous le ganglion, puis en tirant doucement vers le haut pour les séparer du tissu environnant. Après l'ablation du tissu, transférez les ganglions lymphatiques sur un tamis stérile en fil de fer placé dans une boîte de Petri en verre stérile contenant environ 10 millilitres de solution saline équilibrée de Hank. Pour isoler les cellules lymphoïdes, reportez-vous au protocole écrit.

Les fractions cellulaires du liquide de lavage vaginal provenant de souris inoculées au moins quatre jours auparavant se composent généralement de cellules épithéliales à Candida et d'infiltrats cellulaires, comme illustré ici par microscopie à fond clair. Candida peut être identifié par la présence d'hyphes (PHA) ainsi que de levures. Ici, des frottis préparés à partir du liquide de lavage vaginal sont colorés.

En utilisant la technique du frottis de Pap, on examine les cellules épithéliales et les leucocytes infiltrants dont les cellules principales sont les neutrophiles, reconnaissables à leurs lobes tricloïdes. Très peu de neutrophiles, voire aucun, sont détectés chez les souris non inoculées. Cette figure montre un exemple de charge fongique vaginale.

Le liquide de lavage vaginal est recueilli à des moments précis et mis en culture pour le dénombrement des UFC. Dans cet exemple, le liquide a été recueilli au cinquième jour suivant l'inoculation, dilué en série, étalé sur gélose et incubé pendant 48 heures. Les colonies sont ensuite comptées et la charge fongique vaginale est calculée. La colonisation ou l'infection vaginale par Candida persiste pendant plusieurs semaines chez les souris inoculées traitées par œstrogènes.

Alors que Candida ne parvient pas à établir une colonisation vaginale chez les souris non traitées aux œstrogènes après inoculation, les souris traitées aux œstrogènes mais non inoculées restent négatives pour Candida pendant toute la durée de l'expérience. De plus, les lavages vaginaux peuvent être réalisés soit une seule fois sur des souris distinctes à chaque point temporel, soit de manière longitudinale chez les mêmes souris sous anesthésie. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de bien immobiliser les animaux afin d'éviter tout traumatisme vaginal, et veillez à prendre le temps nécessaire pour effectuer un lavage complet afin d'obtenir une charge fongique vaginale précise lors de l'extraction des tissus vaginaux.

Utilisez du PBS non agité pour éviter leur dessèchement, et veillez à ne pas endommager les veines et artères principales lors de l'ablation des ganglions lymphatiques. Pendant le traitement des cellules des ganglions lymphatiques, maintenez-les sur de la glace ou à quatre degrés afin de préserver la viabilité cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser le modèle expérimental murin de vaginite à Candida pour quantifier de façon reproductible la charge fongique vaginale et prélever des tissus vaginaux ou lymphoïdes destinés à des analyses immunologiques ou histologiques spécifiques.