Évaluer les changements métaboliques hépatiques pendant la colonisation progressive des axéniques de souris par ¹ H NMR Spectroscopy

Le but de cette procédure est d’évaluer l’impact d’une colonisation progressive sur le métabolisme hépatique de l’hôte. Ceci est accompli en colonisant d’abord progressivement les souris sans germes. Le processus de colonisation est surveillé en évaluant l’excrétion urinaire des cométabolites microbiens par spectroscopie RMN.

À la suite de la surveillance du processus de colonisation, une biopsie du foie est prélevée sur la souris et préparée pour le profilage métabolique. Le profil métabolique hépatique peut ensuite être acquis à partir de la biopsie intacte à l’aide d’une spectroscopie RMN à rotation à angle magique non destructive à haute résolution. En fin de compte, cette utilisation de la spectroscopie RMN des protons révèle divers métabolites impliqués dans les voies métaboliques telles que l’énergie et les voies de stress oxydatif.

Cette expérience peut donc donner un aperçu des fonctions hépatiques pendant la colonisation. Il peut également être appliqué à travers le système tel que les reins. Pour coloniser les animaux, retirez les souris exemptes de germes des isolateurs et logez-les dans une salle d’élevage conventionnelle dans des cages, équipées d’un filtre devant les animaux conventionnels qui servent de témoins.

Ensuite, mélangez la moitié d’une portée de trois jours prélevée dans la cage conventionnelle de contrôle avec la portée des animaux exempts de germes, recueillez l’urine dans un microtube de 1,5 millilitre en manipulant la souris sur le tube et aidez-la en massant doucement l’intestin. Un minimum de 20 microlitres est nécessaire pour l’acquisition avec une sonde RMN de cinq millimètres, mais il est recommandé d’utiliser 30 microlitres pour améliorer la qualité du profilage métabolique. Congelez immédiatement l’urine dans de l’azote liquide, stockez-la à au moins 40 degrés Celsius jusqu’à l’analyse RMN.

Avant l’acquisition de la RMN, préparer une solution tampon de phosphate de sodium de 0,2 molaire dans de l’eau lourde. pH 7,4 contenant une cuillère à café millimolaire mélanger 30 microlitres de thurie avec 30 microlitres de tampon de phosphate de sodium. Transférez 50 microlitres de la solution mélangée dans un tube capillaire RMN de 1,7 millimètre à l’aide d’une seringue en verre de 50 microlitres équipée d’une aiguille métallique.

Prenez soin d’éviter les bulles. Placez l’adaptateur capillaire sur le capillaire contenant l’échantillon d’urine et placez-le dans un microtube RMN de 2,5 millimètres pour une sonde RMN de cinq millimètres. Cette combinaison de tubes peut être utilisée comme un tube RMN standard de cinq millimètres pour l’acquisition spectrale.

Dans cette démonstration, un spectromètre RMN Bruer Advanced de 700 mégahertz est utilisé pour collecter les données. Acquérir des spectres RMN de protons unidimensionnels en utilisant les paramètres décrits dans le protocole écrit. Après l’acquisition de la RMN, utilisez la tige d’extraction pour retirer le capillaire du tube RMN de 2,5 millimètres en vissant doucement l’adaptateur capillaire pour le retirer après l’euthanasie des animaux, comme indiqué dans le protocole écrit.

Préparez-vous à la biopsie du foie. N’utilisez aucun produit contenant de l’alcool pour éviter la contamination et lavez les outils avec de l’eau ou une solution saline. Prélever des biopsies hépatiques dans le lobe gauche pour des biopsies reproductibles.

Recueillir régulièrement au centre du lobe gauche, en évitant les zones périphériques où les tissus sont plus minces. Veillez à ne pas perforer la vésicule biliaire en cas de fuite de bile. Lavez immédiatement le mouchoir avec de l’eau ou une solution saline.

Congelez immédiatement les biopsies dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse RMN. Pour préparer H-R-M-A-S-N-M-R, insérez la troisième biopsie dans un rotor en zirconium et remplissez le reste du volume avec de l’eau lourde pure pour le verrouillage RMN. Veillez à ne pas faire de bulles, car elles pourraient altérer la qualité du calage et de l’acquisition des données ultérieurs. Insérez une entretoise en téflon de 50 microlitres à l’aide de la vis cylindrique.

Dévissez-le et calibrez-le à l’aide de la jauge de profondeur sur le côté court. Placez la goupille de filetage sur l’entretoise et vissez-la doucement avec le tournevis. Maison sèche, toute eau résiduelle avec un morceau de tissu.

Ensuite, placez le capuchon en haut du rotor et insérez-le dans le rotor packer. Appuyez fermement jusqu’à ce que le capuchon soit en place. Il ne doit pas y avoir d’espace entre le rotor et son capuchon, marquez la moitié du bas du rotor à l’aide d’un marqueur noir pour permettre la détection optique de la vitesse de rotation.

Une fois que le rotor a été suffisamment emballé, placez-le à l’intérieur du spectromètre RMN et commencez à tourner jusqu’à cinq kilohertz. Ici. Un spectromètre bru advanced three de 500 mégahertz est utilisé. Acquisition du spectre RMN des protons à l’aide d’une séquence d’impulsions CP MG.

Selon les directives du fabricant, l’abondant doublet de glucose alpha et numérique à 5,22 parties par million pourrait être utilisé pour calibrer les spectres RMN résultants. Pour déballer le rotor, procédez en retirant le capuchon, en utilisant le dissolvant de capuchon, en dévissant la goupille de filetage et en retirant l’entretoise en téflon. À l’aide de la vis cylindrique, l’appareil peut être soigneusement lavé à l’eau et au détergent.

L’apparition de cométabolites microbiens intestinaux au cours du processus de colonisation est clairement illustrée par ce spectre de protons d’un profil métabolique urinaire pour un animal colonisé pendant 20 jours. Cet animal n’a pas excrété de sulfate docile et de très petites quantités de phénylacétylglycine, abrégée en PAG et que cell sulfate à l’état exempt de germes. Au fur et à mesure que la colonisation progresse, ces trois marqueurs du métabolisme des protéines par le microbiote intestinal augmentent considérablement et atteignent un équilibre au jour 20

En intégrant le pic de triplet spécifique du PAG, il a été possible de quantifier l’augmentation de ce marqueur particulier au cours du temps. Ce diagramme représente la concentration moyenne de PAG pendant la colonisation pour un groupe de sept animaux à l’aide de la spectroscopie de protons H-R-M-A-S-N-M-R, le profil métabolique hépatique de deux souris avant et après la colonisation a été obtenu. Cette figure illustre bien l’information qui peut être dérivée du profil métabolique basé sur A-M-A-S-N-M-R.

De nombreux acides aminés ainsi que des métabolites dérivés du métabolisme énergétique peuvent être visualisés. Ces profils contiennent également des informations pertinentes sur le stress oxydatif, le métabolisme des nucléotides et le métabolisme des méthylamines. Dans cet exemple, il est très clair que la souris sans germes ne présente presque pas de glycogène et de très faibles quantités de glucose et de triglycérides.

Ainsi, en suivant cette procédure, de multiples outils statistiques tels que la chimiothérapie peuvent être appliqués afin de regrouper des échantillons logiques en fonction du profil métabolique et de mettre en évidence les biomarqueurs associés à l’état métabolique.