Name: Préparation de léchantillon de Mycobacterium tuberculosis Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Découvrez la préparation d'extraits acellulaires de Mycobacterium tuberculosis pour l'analyse métabolomique par RMN. Cette méthode permet d'étudier les profils métaboliques et d'identifier des cibles thérapeutiques contre la tuberculose.

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Les auteurs tiennent à remercier tous les membres des laboratoires du Dr Barletta et le Dr Powers pour leurs commentaires utiles tout en développant le protocole. Nous tenons à remercier Wendy Austin pour des discussions utiles et relecture du manuscrit. Les travaux décrits dans ce manuscrit a été financée par des subventions pilotes de semences à chaque enquêteur énumérés ci-dessus, de l&#39;Université de Nebraska-Lincoln Center Biologie Redox (parent subvention no 017675 NCRR 2P20RR, D. Becker, PI). En outre, nous tenons à remercier le Dr Ofelia Chacon pour fournir des fonds de son subvention R21 (1R21AI087561-01A1) pour les fournitures de recherche et de soutien M. Halouska de salaire partiel de standardiser les techniques de RMN inclus dans cette publication.

<ol><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).</li>
<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).</li>
<li>Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li>
<li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOGGY%3A+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li>
<li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li>
<li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+the+Human+Metabolome+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li>
<li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway%2Fgenome+databases+to+160+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li>
<li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria%3A+role+of+D-alanine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li>
<li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism%3A+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li>
<li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li>
<li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions%3A+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li>
<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
<li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li>
<li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li>
<li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+by+numbers%3A+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li>
<li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li>
<li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function%3A+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li>
<li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li>
<li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria%3A+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28LC-MS%29+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li>
<li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy%3A+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimpson%2C+RJ+%22Proteins+and+Proteomics%3A+A+Laboratory+Manual%22">Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual</a>. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).</li>
<li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li>
<li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis%3A+an+unexpected+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Who. Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anti-tuberculosis+Drug+Resistance+in+the+World%3A+Report+No.+4%22">Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4</a>. , (2008).</li>
<li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensively+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un nombre important d&#39;études ont analysé les profils transcriptomiques et protéomiques de M. la tuberculose sous une variété de tests in vitro et in vivo. 11-16 En fin de compte, les changements dans l&#39;expression des gènes et l&#39;activité enzymatique conduire à des variations dans les concentrations de petites molécules de poids moléculaire. La description complète de ces composés constitue le métabolome. Ainsi, les effets des drogues et des conditions de croissan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L&#39;enrichissement ADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Passeur d&#39;échantillons </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RMN Bruker Avance </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Sérum Albumine Bovine </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fraction V </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Tubes à centrifuger </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml stérile en polypropylène </td></tr><tr><td> Les flacons cryogéniques </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2,0 ml en polypropylène stérile </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG scientifique </td><td> C-1189 </td><td> Toxique </td></tr><tr><td> D (+) - Glucose </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Oxyde de deutérium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Stérile, fond plat, polycarbonate, 0,22 capuchon membrane en PTFE um ventilé </td></tr><tr><td> Flacon Gel flash </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Lyophilisateur </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4,5 L de table </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur </td><td> Nouveau-Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> De table shaker </td></tr><tr><td> Lyse matrice B </td><td> MP Biomédical </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Machine de lyse </td><td> MP Biomédical </td><td> FaastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> RMN tubes </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Enrichissement OADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Acide oléique </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - Microfuge 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Scellé et polypropylène </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Avec la bio-certifiés couvertures </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium-3-triméthylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge Isotope </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Cuves de spectrophotomètre </td><td> Corde de sécurité </td><td> LS-2410 </td><td> 1,5 ml en polystyrène, 2 faces claires </td></tr><tr><td> Seringue </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Stérile, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Filtre seringue </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> Acétate 0,2 um de cellulose stérile </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de l&#39;échantillon de<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; extraits pour magnétique nucléaire études métabolomiques résonance

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis est une cause majeure de mortalité chez les êtres humains à l&#39;échelle mondiale. L&#39;émergence de deux multi-(MDR) et ultra-(XDR) souches résistantes aux médicaments menace de faire dérailler les efforts actuels de lutte contre les maladies. Ainsi, il ya un besoin urgent de développer des médicaments et des vaccins qui sont plus efficaces que ceux actuellement disponibles. Le génome de M. la tuberculose est connue depuis plus de 10 ans, mais il ya d&#39;importantes lacunes dans notre connaissance de la fonction des gènes et l&#39;essentialité. De nombreuses études ont depuis utilisé l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes, tant au niveau transcriptomique et protéomique afin de déterminer les effets des médicaments, des oxydants et des conditions de croissance sur les tendances mondiales de l&#39;expression des gènes. En fin de compte, la réponse définitive de ces modifications est reflétée dans la composition métabolique de la bactérie, y compris quelques milliers de petits produits chimiques de poids moléculaire. En comparant les profils métaboliques de type sauvage et des souches mutantes, non traitées ou treated à un médicament particulier, peut effectivement permettre l&#39;identification des cibles et peut conduire au développement de nouveaux inhibiteurs des anti-tuberculeux activité. De même, les effets de deux ou plusieurs conditions sur le métabolome peut également être évaluée. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technologie puissante qui est utilisée pour identifier et quantifier les intermédiaires métaboliques. Dans ce protocole, les procédures pour la préparation de M. extraits cellulaires tuberculose pour la RMN métabolomique analyse sont décrites. Des cultures de cellules sont cultivées dans des conditions appropriées et de biosécurité de niveau requis de confinement 3, 1 récoltées et soumises à une lyse mécanique, tout en maintenant le froid pour optimiser la préservation de métabolites. Les lysats cellulaires sont récupérés, filtrés stérilisés et stockés à des températures ultra basses. Des aliquotes de ces extraits de cellules sont étalées sur gélose Middlebrook 7H9 pour unités formant colonies pour vérifier l&#39;absence de cellules viables. Après deux mois d&#39;incubation à 37 ° C, en l&#39;absence de vicolonies capables sont observées, les échantillons sont retirés de la zone de confinement pour le traitement en aval. Extraits sont lyophilisées, resuspendues dans un tampon deutéré et injecté dans l&#39;appareil RMN, la saisie des données spectroscopiques qui est ensuite soumis à une analyse statistique. Les procédures décrites peuvent être appliquées à la fois à une dimension (1D) RMN 1 H et en deux dimensions (2D) 1 H-13 C analyses RMN. Cette méthodologie fournit plus fiable d&#39;identification petit poids moléculaire et plus métabolite fiables et sensibles des analyses quantitatives des compositions extrait métaboliques cellulaires que les méthodes chromatographiques. Variations de la procédure décrite à la suite de l&#39;étape de lyse cellulaire peut également être adapté pour l&#39;analyse protéomique parallèle.

Le profil métabolomique des<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Est déterminé après la croissance dans les bouillons de culture. Les conditions peuvent être modifiées pour tester les effets des suppléments nutritionnels, des oxydants et des agents anti-tuberculeux sur le profil métabolique de ce micro-organisme. Procédure de préparation d&#39;extrait est applicable à la fois pour 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H et 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C analyses RMN.

Préparation de l&#39;échantillon de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance

*Mycobacterium tuberculosis* est l'une des principales causes de mortalité humaine à l'échelle mondiale. L'émergence de souches multirésistantes (MDR) et ultrarésistantes (XDR)...

L'objectif de cette procédure est d'analyser des extraits sans cellules de mycobactérie tuberculeuse par métabolomique RMN après une première culture, puis de récolter les cellules à un stade de croissance approprié. Ensuite, lyser les cellules et obtenir des extraits sans cellules pour analyse. Re-suspendre les extraits lyophilisés dans un tampon destiné à l'analyse RMN.Enfin, recueillir les données de RMN et analyser les spectres à l'aide de logiciels afin d'identifier les métabolites. En définitive, l'analyse par RMN de Mycobacterium tuberculosis est utilisée pour montrer la préservation des niveaux de métabolites après divers traitements. La métabolomique par RMN peut être appliquée à des aspects clés de la physiologie de Mycobacterium tuberculosis, tels que les voies métaboliques importantes.Cette compréhension est essentielle pour élucider les mécanismes d'action et de résistance des médicaments et pour identifier de nouvelles cibles en vue de la conception de médicaments. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveraient des difficultés en raison de l'impossibilité de manipuler tous les échantillons de manière strictement identique, ce qui introduirait des variations inutiles et des résultats provenant de mon laboratoire. Steven Luka, doctorant, démontrera les procédures de manipulation des échantillons destinés au traitement par RMN. De mon laboratoire, la responsable du laboratoire de recherche et Robert Fenton, technicien de recherche trois, démontreront désormais les procédures de manipulation des cultures de mycobactéries tuberculeuses lors de l'étude de M. tuberculosis.La recherche a suivi les pratiques de niveau de biosécurité 3 telles que définies par les directives institutionnelles. Bien que les étiquettes de cette vidéo indiquent Mycobacterium tuberculosis pour des raisons de biosécurité, cette démonstration a utilisé la souche non pathogène Mycobacterium smegmatis. Commencez par décongeler une conservation à 50 % de glycérol de M. tuberculosis sur de la glace.Inoculer 0,15 millilitre dans 110 millilitres de bouillon M-A-D-C-T-W dans l’ER de 250 millilitres et faire croître les cultures à 37 degrés Celsius avec agitation à 100 tr/min pendant environ six jours. S’il n’y a pas besoin d’antibiotiques, d’ajouts alternatifs ou d’autres traitements. Récolter les cultures destinées aux cultures nécessitant des traitements.Réservez 0,5 millilitre d'Eloqua sur glace pour la culture, la titration et le contrôle qualité. Appliquez ensuite le traitement souhaité et replacez les cultures dans l'agitateurs après la période de traitement. Prélevez un millilitre et déterminez l'OD 600.En outre, réserver un échantillon de 0,5 millilitre pour la culture, la titration et le contrôle qualité. Maintenir les cellules sur glace pendant tout le reste du protocole. Récolter les cellules dans quatre tubes de 50 millilitres par centrifugation après lavage avec 15 millilitres d'eau doublement distillée glacée.Resuspendre les culots dans des aliquotes de 10 millilitres. Prélever deux aliquotes et centrifuger pour obtenir un culot, puis resuspendre le culot cellulaire dans un volume final d'un millilitre d'eau doublement distillée. Si une suspension monocellulaire sans agrégats est souhaitée, faire passer les cellules à travers une aiguille de calibre 27.Procédez trois fois en transférant la suspension cellulaire d’un millilitre dans un tube de deux millilitres à vis avec matrice de lyse B. Placez l’homogénéisateur FastPrep-24 à l’intérieur de la hotte de sécurité biologique. Insérez les échantillons dans le support d’échantillons en fixant la plaque de maintien. Ensuite, homogénéisez pendant 60 secondes à une vitesse de six mètres par seconde.Ensuite, centrifuger les échantillons pour former un culot de débris cellulaires et de cellules intactes. Puis faire passer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,2 micron dans un tube stérile afin de s'assurer de l'absence de cellules viables. Déposer 0,1 millilitre d'échantillon sur de l'agar MADC.Congelez les échantillons dans un bain d'éthanol et de glace sèche et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être lyophilisés et analysés dans une installation de RMN. Après deux mois, vérifiez les plaques afin de confirmer l'absence d'unités formant des colonies. Si aucune unité formant des colonies n'est détectée, les échantillons peuvent être retirés du laboratoire de niveau de sécurité biologique 3 pour une analyse complémentaire dans une installation standard de RMN.Après avoir séché les échantillons jusqu'à dessiccation, les reprendre dans 0,7 millilitre de tampon RMN et transférer dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger pendant trois minutes à 13 000 ×g, prélever 0,6 millilitre et transférer dans un tube RMN de cinq millimètres. Pour l'analyse des milieux, un support personnalisé facilite le chargement de plusieurs tubes RMN dans les rotateurs à la profondeur appropriée.Ensuite, transférez les échantillons vers le spectromètre RMN pour les insérer dans le changeur d'échantillons A-B-A-C-S à 20 positions. Alternez entre les cultures non traitées et celles traitées avec le médicament. Le premier échantillon doit être préchargé dans l'aimant au début d'une série automatisée.Pour étalonner l'instrument, optimisez la durée de l'impulsion à 90 degrés à l'aide d'un échantillon unique et ajustez l'instrument pour les échantillons restants. Utilisez l'icône NMR et le calage du gradient. Automatisez le verrouillage, le calage et la collecte des données RMN pour chaque échantillon.Pour un spectre RMN 1D de l'hydrogène, sélectionnez la séquence d'impulsions avec suppression du signal de l'eau et sculptage d'excitation. Réglez un total de 32 000 points de données, 128 balayages et 16 balayages factices pour un spectre deux DH un C 13 hs QC. Sélectionnez la séquence d'impulsions.Sélectionnez un total de 2048 points de données avec une largeur de balayage selon la dimension directe H unidimensionnelle et 64 points de données avec une largeur de balayage selon la dimension indirecte C 13. Indiquez également la collecte du spectre avec 128 balayages et 16 balayages factices afin d'obtenir un bon rapport signal sur bruit. Un spectre de m tuberculosis a généré environ 400 pics, incluant 50 métabolites connus.Par exemple, le traitement des données décrit dans le manuscrit associé a produit ce spectre de métabolites directement ou indirectement associés à la voie de la D-alanine. L'amplitude des intensités des pics est proportionnelle aux concentrations des métabolites présents dans l'extrait cellulaire, ce qui permet de quantifier les perturbations relatives des métabolites et des voies métaboliques entre les échantillons et les traitements. La métabolomique LMR ouvre la voie aux recherches en bactériologie pour explorer la physiologie et la pathogénie chez les microbactéries ainsi que chez d'autres microorganismes pathogènes ou non pathogènes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer plusieurs extraits cellulaires de tuberculose pour la métabolomique par RMN, et surtout maintenir une cohérence tout au long du protocole afin d'obtenir des résultats fiables.

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