Name: Préparation de léchantillon de Mycobacterium tuberculosis Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Découvrez la préparation d'extraits acellulaires de Mycobacterium tuberculosis pour l'analyse métabolomique par RMN. Cette méthode permet d'étudier les profils métaboliques et d'identifier des cibles thérapeutiques contre la tuberculose.

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Les auteurs tiennent à remercier tous les membres des laboratoires du Dr Barletta et le Dr Powers pour leurs commentaires utiles tout en développant le protocole. Nous tenons à remercier Wendy Austin pour des discussions utiles et relecture du manuscrit. Les travaux décrits dans ce manuscrit a été financée par des subventions pilotes de semences à chaque enquêteur énumérés ci-dessus, de l&#39;Université de Nebraska-Lincoln Center Biologie Redox (parent subvention no 017675 NCRR 2P20RR, D. Becker, PI). En outre, nous tenons à remercier le Dr Ofelia Chacon pour fournir des fonds de son subvention R21 (1R21AI087561-01A1) pour les fournitures de recherche et de soutien M. Halouska de salaire partiel de standardiser les techniques de RMN inclus dans cette publication.

<ol><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).</li>
<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).</li>
<li>Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li>
<li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOGGY%3A+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li>
<li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li>
<li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+the+Human+Metabolome+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li>
<li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway%2Fgenome+databases+to+160+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li>
<li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria%3A+role+of+D-alanine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li>
<li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism%3A+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li>
<li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li>
<li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions%3A+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li>
<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
<li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li>
<li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li>
<li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+by+numbers%3A+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li>
<li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li>
<li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function%3A+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li>
<li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li>
<li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria%3A+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28LC-MS%29+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li>
<li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy%3A+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimpson%2C+RJ+%22Proteins+and+Proteomics%3A+A+Laboratory+Manual%22">Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual</a>. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).</li>
<li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li>
<li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis%3A+an+unexpected+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Who. Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anti-tuberculosis+Drug+Resistance+in+the+World%3A+Report+No.+4%22">Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4</a>. , (2008).</li>
<li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensively+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un nombre important d&#39;études ont analysé les profils transcriptomiques et protéomiques de M. la tuberculose sous une variété de tests in vitro et in vivo. 11-16 En fin de compte, les changements dans l&#39;expression des gènes et l&#39;activité enzymatique conduire à des variations dans les concentrations de petites molécules de poids moléculaire. La description complète de ces composés constitue le métabolome. Ainsi, les effets des drogues et des conditions de croissan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L&#39;enrichissement ADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Passeur d&#39;échantillons </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RMN Bruker Avance </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Sérum Albumine Bovine </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fraction V </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Tubes à centrifuger </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml stérile en polypropylène </td></tr><tr><td> Les flacons cryogéniques </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2,0 ml en polypropylène stérile </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG scientifique </td><td> C-1189 </td><td> Toxique </td></tr><tr><td> D (+) - Glucose </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Oxyde de deutérium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Stérile, fond plat, polycarbonate, 0,22 capuchon membrane en PTFE um ventilé </td></tr><tr><td> Flacon Gel flash </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Lyophilisateur </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4,5 L de table </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur </td><td> Nouveau-Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> De table shaker </td></tr><tr><td> Lyse matrice B </td><td> MP Biomédical </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Machine de lyse </td><td> MP Biomédical </td><td> FaastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> RMN tubes </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Enrichissement OADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Acide oléique </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - Microfuge 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Scellé et polypropylène </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Avec la bio-certifiés couvertures </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium-3-triméthylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge Isotope </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Cuves de spectrophotomètre </td><td> Corde de sécurité </td><td> LS-2410 </td><td> 1,5 ml en polystyrène, 2 faces claires </td></tr><tr><td> Seringue </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Stérile, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Filtre seringue </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> Acétate 0,2 um de cellulose stérile </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de l&#39;échantillon de<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; extraits pour magnétique nucléaire études métabolomiques résonance

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis est une cause majeure de mortalité chez les êtres humains à l&#39;échelle mondiale. L&#39;émergence de deux multi-(MDR) et ultra-(XDR) souches résistantes aux médicaments menace de faire dérailler les efforts actuels de lutte contre les maladies. Ainsi, il ya un besoin urgent de développer des médicaments et des vaccins qui sont plus efficaces que ceux actuellement disponibles. Le génome de M. la tuberculose est connue depuis plus de 10 ans, mais il ya d&#39;importantes lacunes dans notre connaissance de la fonction des gènes et l&#39;essentialité. De nombreuses études ont depuis utilisé l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes, tant au niveau transcriptomique et protéomique afin de déterminer les effets des médicaments, des oxydants et des conditions de croissance sur les tendances mondiales de l&#39;expression des gènes. En fin de compte, la réponse définitive de ces modifications est reflétée dans la composition métabolique de la bactérie, y compris quelques milliers de petits produits chimiques de poids moléculaire. En comparant les profils métaboliques de type sauvage et des souches mutantes, non traitées ou treated à un médicament particulier, peut effectivement permettre l&#39;identification des cibles et peut conduire au développement de nouveaux inhibiteurs des anti-tuberculeux activité. De même, les effets de deux ou plusieurs conditions sur le métabolome peut également être évaluée. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technologie puissante qui est utilisée pour identifier et quantifier les intermédiaires métaboliques. Dans ce protocole, les procédures pour la préparation de M. extraits cellulaires tuberculose pour la RMN métabolomique analyse sont décrites. Des cultures de cellules sont cultivées dans des conditions appropriées et de biosécurité de niveau requis de confinement 3, 1 récoltées et soumises à une lyse mécanique, tout en maintenant le froid pour optimiser la préservation de métabolites. Les lysats cellulaires sont récupérés, filtrés stérilisés et stockés à des températures ultra basses. Des aliquotes de ces extraits de cellules sont étalées sur gélose Middlebrook 7H9 pour unités formant colonies pour vérifier l&#39;absence de cellules viables. Après deux mois d&#39;incubation à 37 ° C, en l&#39;absence de vicolonies capables sont observées, les échantillons sont retirés de la zone de confinement pour le traitement en aval. Extraits sont lyophilisées, resuspendues dans un tampon deutéré et injecté dans l&#39;appareil RMN, la saisie des données spectroscopiques qui est ensuite soumis à une analyse statistique. Les procédures décrites peuvent être appliquées à la fois à une dimension (1D) RMN 1 H et en deux dimensions (2D) 1 H-13 C analyses RMN. Cette méthodologie fournit plus fiable d&#39;identification petit poids moléculaire et plus métabolite fiables et sensibles des analyses quantitatives des compositions extrait métaboliques cellulaires que les méthodes chromatographiques. Variations de la procédure décrite à la suite de l&#39;étape de lyse cellulaire peut également être adapté pour l&#39;analyse protéomique parallèle.

Le profil métabolomique des<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Est déterminé après la croissance dans les bouillons de culture. Les conditions peuvent être modifiées pour tester les effets des suppléments nutritionnels, des oxydants et des agents anti-tuberculeux sur le profil métabolique de ce micro-organisme. Procédure de préparation d&#39;extrait est applicable à la fois pour 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H et 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C analyses RMN.

Préparation de l&#39;échantillon de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance

*Mycobacterium tuberculosis* est l'une des principales causes de mortalité humaine à l'échelle mondiale. L'émergence de souches multirésistantes (MDR) et ultrarésistantes (XDR)...

L'objectif de cette procédure est d'analyser des extraits sans cellules de mycobactérie tuberculeuse par métabolomique RMN après une première culture, puis de récolter les cellules à un stade de croissance approprié. Ensuite, lyser les cellules et obtenir des extraits sans cellules pour analyse. Re-suspendre les extraits lyophilisés dans un tampon destiné à l'analyse RMN.Enfin, recueillir les données de RMN et analyser les spectres à l'aide de logiciels afin d'identifier les métabolites. En définitive, l'analyse par RMN de Mycobacterium tuberculosis est utilisée pour montrer la préservation des niveaux de métabolites après divers traitements. La métabolomique par RMN peut être appliquée à des aspects clés de la physiologie de Mycobacterium tuberculosis, tels que les voies métaboliques importantes.Cette compréhension est essentielle pour élucider les mécanismes d'action et de résistance des médicaments et pour identifier de nouvelles cibles en vue de la conception de médicaments. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveraient des difficultés en raison de l'impossibilité de manipuler tous les échantillons de manière strictement identique, ce qui introduirait des v

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une méthode pour l'extraction de métabolite communautés planctoniques microbiens est présenté. Échantillonnage ensemble de la communauté est réalisée par filtration sur des filtres spécialement préparés. Après lyophilisation, aqueuse-solubles métabolites sont extraits. Cette approche permet une application de la métabolomique environnementaux trans-omique enquêtes de communautés microbiennes naturelles ou expérimentales.

Concentration des métabolites issus de communautés planctoniques à faible densité de l&#39;environnement en utilisant métabolomique résonance magnétique nucléaire

Cette vidéo décrit une technique de préparation d’échantillons de cellules cancéreuses du sein pour le profilage des métabolites. Les cellules cancéreuses du sein sont traitées avec de l’œstradiol, qui se lie au récepteur alpha des œstrogènes et provoque une modification de la composition des métabolites.

Préparation d’échantillons pour la métabolomique : méthode de préparation d’échantillons cellulaires pour le profilage de métabolites

La neurochimie du cerveau des mammifères est modifiée dans de nombreuses maladies neurologiques et systémiques. Des profils caractéristiques des métabolites cérébraux peuvent être obtenus efficacement à partir d’extraits bruts de tissu cérébral. À cette fin, la spectroscopie RMN à haute résolution est utilisée, permettant une analyse quantitative détaillée des concentrations de métabolites (métabolomique).

Analyse métabolomique de cerveau de rat par la Résolution nucléaire Haute spectroscopie par résonance magnétique d&#39;extraits de tissus

Cet article présente l’utilisation de PSYCHE et SAPPHIRE-PSYCHE dans le profilage métabolique des plantes et comprend des procédures détaillées pour la préparation des échantillons et l’enregistrement optimal des spectres RMN Pure Shift. Des exemples à travers lesquels le gain de résolution obtenu par le découplage homonucléaire permet une compréhension plus complète du système sont discutés.

La résonance magnétique nucléaire pure shift : un nouvel outil pour la métabolomique végétale

Dans ce protocole, nous présentons un flux de travail optimisé, qui combine une préparation efficace et rapide des échantillons de nombreux échantillons. En outre, nous fournissons un guide étape par étape pour réduire les variations analytiques pour l’évaluation à haut débit des études GWAS métaboliques.

Études d’association multi-omiques à grande échelle à l’échelle du génome (Mo-GWAS): Lignes directrices pour la préparation et la normalisation des échantillons

Ce protocole décrit la chromatographie d’exclusion de taille, une technique facile et reproductible pour enrichir les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis à partir de surnageants de culture.

Mycobacterium tuberculosis Enrichissement extracellulaire des vésicules par chromatographie d’exclusion de taille

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est utilisée pour identifier la dérégulation des métabolites chez les patients atteints de diverses maladies. Cette technique permet de quantifier les métabolites dérangés, démêlant ainsi les informations physiopathologiques. Ici, nous décrivons la procédure étape par étape de l’approche basée sur la RMN pour la caractérisation métabolique des patients.

Identification et quantification des métabolites dérangés chez les patients gravement malades à l’aide de la métabolomique basée sur la RMN

Ce protocole sépare les protéines insolubles de la paroi cellulaire et de la membrane en fractions simples (1 à 5 protéines) à l’aide d’une focalisation isoélectrique préparative (IEF) basée sur un point isoélectrique, suivie d’une séparation en fonction de la masse moléculaire. Les fractions résultantes peuvent être utilisées directement pour l’analyse immunologique et protéomique sans purification supplémentaire.

Séparation et fractionnement de protéines de paroi cellulaire et de membrane cellulaire de Mycobacterium tuberculosis pour l’analyse des protéines en aval

Ce protocole montre que le battage des billes combiné à la purification des billes de capture d’ADN fournit une méthode rapide et cohérente pour extraire l’ADN des échantillons de Mycobacterium tuberculosis , ce qui en fait un choix efficace pour les applications de séquençage de nouvelle génération.

Extraction d’ADN mycobactérien à l’aide d’un battage de billes dans un tampon personnalisé suivi d’un flux de travail NGS

Ce protocole décrit la méthode CTAB pour extraire de l’ADN de haute qualité des mycobactéries, surmontant les défis posés par leurs parois cellulaires solides et riches en acide mycolique. Le processus implique la digestion enzymatique, la lyse cellulaire avec CTAB, et la purification de l’ADN par extraction organique et précipitation d’éthanol. Cette méthode produit de l’ADN adapté à des études moléculaires et fiable pour la recherche sur les mycobactériens.

Extraction d’acides désoxyribonucléiques par génome entier à partir d’espèces de Mycobacterium via la technique du bromure de cétyltriméthylammonium

Découvrez la préparation d'extraits acellulaires de Mycobacterium tuberculosis pour l'analyse métabolomique par RMN. Cette méthode permet d'étudier les profils métaboliques et d'identifier des cibles thérapeutiques contre la tuberculose.

Préparation de l'échantillon de

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