Préparation de l'échantillon de Mycobacterium tuberculosis Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance

Le but de cette procédure est d’analyser les extraits acellulaires de mycobacterium tuberculosis par métabolomique RMN en première culture, et de récolter les cellules à un stade de croissance approprié. Ensuite, lysa cellules et obtenir des extraits acellulaires pour analyse. Suspendre à nouveau les extraits lyophilisés en tampon pour l’analyse RMN.

Enfin, recueillir des données RMN et analyser les spectres à l’aide d’un logiciel pour identifier les métabolites. En fin de compte, l’analyse RMN de Mycobacterium tuberculosis est utilisée pour montrer la préservation des niveaux de métabolites lors de divers traitements. La métabolomique RMN peut être appliquée à des aspects clés de la physiologie de Mycobacterium tuberculosis, tels que des voies métaboliques importantes.

Cette compréhension est essentielle pour élucider les mécanismes d’action et de résistance aux médicaments et pour identifier de nouvelles cibles pour la conception de médicaments. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode éprouvent des difficultés en raison de leur incapacité à manipuler tous les échantillons exactement de la même manière, ce qui entraînera des variations et des résultats inutiles de mon laboratoire. Steven Luka, étudiant diplômé au doctorat, fera la démonstration des procédures de manipulation des échantillons pour le traitement RMN De mon laboratoire, le directeur du laboratoire de recherche et Robert Fenton, technicien de recherche trois, vont maintenant démontrer les procédures de manipulation des cultures de mycobacterium tuberculosis lors de la réalisation de M tuberculosis.

La recherche a suivi les pratiques de biosécurité de niveau trois telles que définies par les directives institutionnelles. Bien que les étiquettes de cette vidéo indiquent microbacterium tuberculosis pour des raisons de biosécurité, cette démonstration a utilisé la mycobacterium magmatic non pathogène. Commencez par décongeler un stock de 50 % de glycérol de M tuberculosis sur de la glace.

Injectez 0,15 millilitre dans 110 millilitres de bouillon M-A-D-C-T-W dans le RE de 250 millilitres et mon flacon faites pousser les cultures à 37 degrés Celsius en agitant à 100 tr/min pendant environ six jours. Si aucun antibiotique, d’autres ajouts ou d’autres traitements ne sont nécessaires. Récoltez les cultures pour les cultures nécessitant des traitements.

Réservez un Eloqua de 0,5 millilitre sur glace pour la culture, le titrage et le contrôle de la qualité. Effectuez ensuite le traitement souhaité et remettez les cultures dans le shaker après la période de traitement. Prélever un millilitre et déterminer l’OD 600.

Réservez également un échantillon de 0,5 millilitre pour la culture, le titrage et le contrôle de la qualité. Maintenez les cellules sur la glace pendant toute la durée du protocole restant. Récoltez les cellules dans quatre tubes de 50 millilitres par centrifugation après lavage avec de l’eau glacée double distillée de 15 millilitres.

Reese suspend les granulés dans des aliquotes de 10 millilitres. Tirez deux aliquotes et la pastille par centrifugation, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un volume final d’un millilitre d’eau distillée doublement. Si vous souhaitez une suspension unicellulaire exempte d’agglutination, passez les cellules à travers une aiguille de calibre 27.

Trois fois, procédez au transfert de la suspension de cellules d’un millilitre dans un bouchon à vis de deux millilitres contenant la matrice de lyse B. Placez l’homogénéisateur de lyse à préparation rapide 24 à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Placez les échantillons dans le porte-échantillon en fixant la plaque de fixation des rayons. Ensuite, traitez pendant 60 secondes à une vitesse de six mètres par seconde.

Ensuite, centrifugez les échantillons pour obtenir des débris de cellules de granulés et des cellules intactes. Ensuite, faites passer le supinate à travers un filtre de seringue de 0,2 micron dans un tube stérile pour contrôler l’absence de cellules viables. Plaque 0,1 millilitre d’échantillon sur MADC. Agar-agar.

Congelez les échantillons dans un bain de glace carbonique à l’éthanol et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être lyophilisés et traités dans une installation de RMN. Après deux mois, vérifiez les plaques pour vérifier l’absence d’unités formant des colonies. Si aucun utilisateur de FC n’est trouvé, les échantillons peuvent être retirés du laboratoire BSL trois pour une analyse plus approfondie dans une installation de RMN standard.

Après avoir siccité les échantillons, ils les remettent en suspension dans 0,7 millilitre de tampon RMN et les transfèrent dans une centrifugeuse à tube de micro-centrifugation pendant trois minutes à 13 000 fois. G, prélever 0,6 millilitre et transférer dans un tube RMN de cinq millimètres. À partir de l’analyse des supports, un rack personnalisé facilite le chargement de plusieurs tubes RMN dans des cônes à la bonne profondeur.

Transférez ensuite les échantillons sur le spectromètre RMN pour les insérer dans A-B-A-C-S un passeur de 20 échantillons. Alternance entre cultures non traitées et cultures traitées médicamenteuses. Le premier échantillon doit être préchargé dans l’aimant au début d’un cycle automatisé.

Pour calibrer l’instrument, optimisez la longueur d’impulsion de 90 degrés avec un seul échantillon et réglez l’instrument pour les échantillons restants. Utilisez l’icône RMN et la cale graduée. Automatisez le verrouillage, le calage et la collecte de données RMN pour chaque échantillon.

Pour un spectre RMN d’hydrogène 1D, sélectionnez la séquence d’impulsions avec suppression de l’eau et sculpture d’excitation. Définissez un total de 32 000 points de données, 128 balayages et 16 balayages factices pour un spectre de contrôle qualité à deux DH et un C 13 hs. Sélectionnez la séquence d’impulsions.

Sélectionnez un total de 2048 points de données avec une largeur de balayage le long de la dimension H directe et 64 points de données avec une largeur de balayage le long de la dimension C 13 indirecte. Spécifiez également la collecte de spectre avec 128 balayages et 16 balayages factices pour obtenir un bon rapport signal/bruit. Un spectre de la tuberculose m a généré environ 400 pics, dont 50 métabolites connus.

Par exemple, le traitement des données tel que détaillé dans le manuscrit ci-joint a produit ce spectre de métabolites qui sont directement ou indirectement associés à la voie de la D alanine. L’amplitude des intensités maximales est proportionnelle aux concentrations de métabolites présents dans l’extrait cellulaire, de sorte que les perturbations relatives des métabolites et des voies métaboliques peuvent être quantifiées entre les échantillons et les traitements. La métabolomique LMR ouvre la voie aux recherches dans le domaine de la bactériologie pour explorer la physiologie et la pathogenèse chez les microbactéries visuelles et microbactériennes, autres micro-organismes pathogènes ou non pathogènes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer plusieurs extraits de cellules de tuberculose pour la métabolomique RMN, et surtout maintenir la cohérence tout au long du protocole pour obtenir des résultats fiables.