Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) comme un outil pour visualiser des molécules et de leurs microinjecté eucaryotes Sous-cellulaires cibles

La technique CLEM a été conçu pour analyser la morphologie ultrastructurale des membranes, les organites subcellulaires, et des structures affectées par micro-injection des molécules. Cette méthode combine les techniques puissantes de micromanipulation / microinjection, microscopie confocale à fluorescence et microscopie électronique pour permettre millimètre à résolution nanométrique multi-. Cette technique se prête à une grande variété d'applications.

L’objectif global de l’expérience suivante est d’introduire de petites molécules ou protéines marquées par fluorescence dans le cytoplasme d’une cellule de mammifère en culture, et d’observer les changements morphologiques induits d’une résolution micrométrique à une résolution multinanométrique. Ceci est réalisé en cultivant d’abord des cellules de mammifères sur des lamelles de verre quadrillées et en les micro-injectant avec une petite molécule ou une protéine d’intérêt marquée par fluorescence. Ensuite, les cellules sont fixées dans du formaldéhyde, puis observées et imagées à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Ensuite, les cellules sont fixées avec du glutaraldéhyde, sectionnées, colorées et imagées à l’aide de la microscopie électronique. Enfin, les images prises en microscopie fluorescente en fond clair et en microscopie électronique sont combinées et alignées. In fine, la corrélation de ces images permet au chercheur d’imager à haute résolution les perturbations induites par la petite molécule ou la protéine d’intérêt.

Bonjour, je suis le Dr Evan Reddick dans le laboratoire du Dr Neil Alto dans le département de microbiologie du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas. Aujourd’hui, je vais vous parler de la procédure M Clem ou de la microscopie corrélative à la lumière et à l’électron. Le principal avantage de cette procédure par rapport aux techniques autonomes telles que la micro-injection ou la microscopie, est qu’elles sont ici effectuées de concert et assistées à l’utilisation d’une lamelle en verre quadrillé.

C’est cette lamelle quadrillée qui permet aux chercheurs de retourner dans la même cellule à différentes parties du protocole. De plus, cette technique permet au chercheur d’observer induire des changements architecturaux subcellulaires à partir d’une grande variété de petites molécules injectables ou de protéines d’intérêt, et de le faire d’une résolution micrométrique à plusieurs nanomètres. Pour se préparer à la micro-injection, des cellules de culture telles que des cellules de rein de rat normales ou des cellules cancéreuses du col de l’utérus immortalisées sur du verre photodécoupé sont fixées sur deux boîtes de cellules vivantes pour incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

En fonction de la chronologie expérimentale à utiliser, ajustez la cofluence des cellules. Une plaque entièrement confluente rendra très difficile l’identification des cellules micro-injectées au microscope électronique. Par conséquent, les cellules germes telles qu’elles atteignent environ 50 % de fluidité le jour d’une courte expérience et environ 25 % de fluidité.

Le jour d’une expérience plus longue, préparez de l’ADN protéique marqué par fluorescence ou de petites molécules dans le tampon approprié jusqu’à un volume final de 50 microlitres. Selon l’ofor fluor de votre choix, ajoutez un colorant de suivi tel que le rouge Texas ou le bleu cascade. Ajouter une concentration de 0,5 à un milligramme par millilitre.

Filtrez la solution à travers un filtre centrifuge de 0,22 micron. Après avoir tiré les aiguilles de micro-injection conformément aux directives du fabricant, pipeter soigneusement des microlitres de solution à l’arrière d’une aiguille. Chargez l’aiguille dans le bras du micromanipulateur d’un dispositif de micro-injection commercial fixé à un microscope inversé.

Placez une boîte de cellules cultivées dans le porte-boîte du microscope inversé. Trouvez des cellules qui se développent dans une grille photodécoupée et notez l’identifiant alphanumérique de la grille. Il sera utilisé dans toutes les étapes ultérieures.

Il est important de choisir des cellules pour la micro-injection qui sont collées près du centre de la lamelle et d’éviter celles qui se trouvent près de la périphérie. Ceci est important car cela garantira un transfert efficace de vos cellules d’intérêt vers la pièce maîtresse en résine épon utilisée plus tard pour la microscopie électronique Manuel, abaissez manuellement le bras d’injection sur la lamelle de recouvrement et utilisez le micromanipulateur pour abaisser l’aiguille jusqu’à ce que la pointe touche doucement la surface des cellules. Micro-injectez une cellule sur deux dans la grille choisie pour les cellules cultivées à environ 50 % de fluidité Co, attendez-vous à environ 80 cellules par grille de 600 micromètres carrés, ce qui donnera un N d’environ 30 à 40 cellules expérimentales et contrôlées.

Après l’injection, remettez la parabole dans l’incubateur pendant la durée souhaitée pour effectuer la microscopie fluorescente. Jetez le milieu de croissance et fixez les cellules avec du formaldéhyde dans du PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Remplacez le fixateur par un XPBS.

Documentez ensuite la disposition des cellules en prenant cinq à 10 images en champ clair de la grille choisie à faible et fort grossissement. Pour identifier les cellules micro-injectées, prenez des images fluorescentes aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de l’œil inerte du colorant d’injection. À l’aide d’un microscope confocal, collectez un Zack d’images de cellules micro-injectées à fort grossissement dans la même grille précédemment imagée.

Un fort grossissement est nécessaire pour corréler les images fluorescentes avec les structures subcellulaires qui seront identifiées par microscopie électronique. Après l’imagerie confocale, utilisez un liquide de retrait de la lamelle pour séparer la lamelle de la boîte et placez-la côté cellulaire vers le haut dans une boîte de culture fraîche contenant un XPBS. Passez au traitement pour la microscopie électronique.

Être après avoir suivi les protocoles EM standard. Pour fixer, tacher et déshydrater les échantillons, préparez la résine epon et placez la lamelle de couverture, côté cellule vers le bas, sur un tube rempli de résine eon. Laissez la résine polymériser à 60 degrés Celsius pendant 24 heures.

Pour retirer la lamelle de recouvrement de la résine epon. Immergez-le rapidement dans de l’azote liquide. Le choc de température de 60 degrés Celsius à moins 196 degrés Celsius.

Déloge la lamelle du tube de résine. Attendez cinq à 10 minutes, puis récupérez le tube, qui est maintenant libéré de la lamelle. Sous une lunette de dissection, inspectez la surface de la résine pour localiser la grille d’intérêt.

À l’aide d’une lame de rasoir stérile ou d’un scalpel, coupez le bloc d’épon de sorte que seule la grille d’intérêt soit au sommet du bloc avec une coupe ultra micro-microtone des sections en série du bloc coupé utilisez de l’acétate d’urinoir et du citrate de plomb pour contraster les sections à l’aide de protocoles standard. Déplacez les cellules souhaitées dans le microscope électronique en utilisant le positionnement relatif des cellules comme guide. Utilisation des images fluorescentes haute résolution capturées précédemment.

Identifier les régions d’intérêt de la micrographie électronique qui correspondent au signal fluorescent. Utilisez des points de repère tels que la position de l’hétérochromatine et l’enveloppe nucléaire pour déterminer quelle image fluorescente de Zack correspond à la coupe EM. Si vous effectuez actuellement la création d’images à l’aide d’un programme d’imagerie tel qu’Image J ou Adobe Photoshop, réduisez l’opacité de l’image fluorescente à 50 % et superposez-la à l’image TEM correspondante.

Alignez les images en ajustant l’échelle affichée. Voici les résultats de la micro-injection et de la microscopie corrélative à la lumière et à l’électron. Cette image montre la micrographie à fond clair de cellules NRK en croissance sur une lamelle en verre gravé au laser.

Notez les lettres de fond b et m utilisées pour identifier la grille contenant les cellules injectées. Les flèches indiquent les deux cellules identifiées et imagées au microscope électronique. Voici une image fluorescente de la cascade de colorant de suivi inerte bleue utilisée pour identifier les cellules micro-injectées.

Voici une superposition des signaux en fond clair et fluorescents de petites molécules marquées aux amines. Ce panneau représente la corrélation entre la fluorescence en fond clair et la microscopie électronique d’une pile injectée. La pointe de flèche indique un point fluorescent imagé à un grossissement plus élevé dans ce panneau.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de micro-injecter une protéine d’intérêt et de suivre ses changements morphologiques subcellulaires qu’elle induit en utilisant la procédure de micro-injection Clem ou la microscopie corrélative à la lumière et aux électrons.