Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

L'objectif général de cette méthode est d'obtenir des données de microscopie correlative en lumière et en électrons, ou CLEM, en combinant des informations de fluorescence issues d'une immunocytochimie avec la morphologie ultrastructurale provenant de la microscopie électronique en transmission au sein d'une seule et même image. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunocytochimie et de la pathologie, telles que la structure subcellulaire à laquelle une protéine d'intérêt particulière est associée. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'une même sonde nanoparticulaire à points quantiques pour obtenir à la fois le signal de microscopie en temps réel provenant de la protéine ciblée et la localisation structurale en microscopie électronique.

Après avoir fixé, inclus et sectionné le tissu tumoral humain de somatostatinome selon le protocole décrit, préparez une solution adhésive pour sections en plaçant 20 centimètres de ruban adhésif transparent dans un flacon de cinq millilitres contenant 2,0 millilitres d'acétone et laissez reposer pendant 10 minutes. Retirez le ruban et plongez une grille en nickel dans la solution, puis retirez la grille et laissez-la sécher à l'air libre. Une fois sèche, utilisez le côté mat de la grille pour prélever une section ultramince.

Il est essentiel d'établir le temps de gravure approprié pour la formulation de résine choisie. Trente minutes conviennent bien pour cette formulation, mais ce temps pourrait devoir être recalculé pour des formulations plus dures ou plus tendres. Préparez un millilitre de solution fraîche de métaperiodate de sodium saturée dans de l'eau distillée et déposez des gouttelettes de cette solution sur une surface propre de film de laboratoire.

Placer les grilles parfaitement sèches avec les sections sur les gouttelettes et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, transférer les grilles sur des gouttelettes d'eau distillée pendant 60 secondes pour les rincer. Pour effectuer le marquage par anticorps et points quantiques, ou QD, sur une surface propre de film de laboratoire, prélever à la pipette des gouttes de glycine 0,05 M et de PBS.

Placer les grilles sur les gouttelettes et incuber pendant 10 minutes pour bloquer les aldéhydes résiduels sur les sections. Pour éliminer le blocage par l'aldéhyde, essuyer brièvement le bord de la grille. Ensuite, placer la grille sur une gouttelette de sérum de chèvre normal à un pour cent, ou NGS, et d'albumine de sérum bovin à un pour cent, ou BSAC, dans du PBS pendant 10 minutes.

Préparez un millilitre de solution de blocage en ajoutant 10 microlitres de NGS et 100 microlitres de BSAC à 890 microlitres de PBS. Ensuite, préparez les sections en les plaçant sur une goutte de diluant pour anticorps pendant 10 minutes. Puis, diluez l'anticorps polyclonal anti-somatostatine au ratio d'un à dix à l'aide du diluant pour anticorps, et placez les grilles sur des gouttes de cette solution.

Incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant une heure. Après l'incubation, éliminer le réactif d'anticorps en essuyant le bord de la grille. Ensuite, laver les sections deux fois pendant cinq minutes chacune avec le diluant d'anticorps.

Après avoir dilué l'anticorps secondaire au 1/10 et préparé des gouttes, incuber les grilles sur les gouttes à température ambiante pendant une heure. Ensuite, retirer la solution d'anticorps et laver les sections deux fois. Diluer les points quantiques conjugués à la streptavidine au 1/10 et incuber les échantillons sur des gouttes de la solution à l'abri de la lumière, à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, effectuez deux lavages des grilles avec du diluant d'anticorps, chaque lavage durant cinq minutes, puis essuyez les bords des grilles. Par la suite, lavez les grilles dans de l'eau distillée pendant deux minutes avant d'essuyer délicatement les bords pour les sécher. Placez la section de grille immunomarquée dans une goutte d'eau sur une lame de verre et recouvrez-la d'une lamelle en verre.

Pour réaliser une microscopie à fluorescence, insérez un cube de filtres présentant les caractéristiques suivantes et utilisez une illumination par LED de 365 nanomètres. Placez la section immunomarquée sur la platine du microscope à immunofluorescence. Utilisez la microscopie optique pour évaluer le motif de marquage, le niveau de tout marquage non spécifique et pour vérifier que les contrôles négatifs sont exempts de signal.

Ensuite, identifier les zones d'intérêt par rapport aux barres de la grille. Puis régler un appareil photo numérique en couleur complète sur la balance des blancs automatique FL et régler la température de couleur à 3 200 K. Placer l'appareil en mode d'exposition automatique avec un gamma compris entre 0,45 et 1,00 pour optimiser l'aspect des images, et régler le gain analogique à 1×. Cliquer sur l'icône de l'appareil photo dans l'interface graphique du logiciel ZEN Two Light pour activer la visualisation en direct. Ensuite, faire la mise au point sur l'image et cliquer sur Capturer dans l'interface graphique du logiciel ZEN Two Light pour enregistrer l'image dans la mémoire tampon.

Enregistrez les images au format tf afin d'éviter la compression et la pixellisation. Préparez une impression montrant la position de la région d'intérêt par rapport aux barres de la grille ou à d'autres repères tissulaires significatifs. Ensuite, retirez la grille de la préparation, rincez à l'eau distillée et essuyez doucement les bords pour les sécher.

Pour réaliser une microscopie électronique en transmission, transférez la grille dans le microscope pour l'examen en utilisant une tension d'accélération de 100 kilovolts. Commencez par un faible grossissement d'environ 1 400X afin de vous déplacer sur la grille et de localiser les régions d'intérêt (ROIs) identifiées auparavant par microscopie optique. Observez les points quantiques individuels à un grossissement de 70 000X ou supérieur.

Ils apparaîtront sous forme de structures cristallines irrégulières présentant une densité électronique modérée. Ensuite, à l’aide d’une caméra numérique équipée d’un capteur monochrome de 1 392 par 1 040 pixels dans l’interface graphique du logiciel d’imagerie, cliquez sur l’icône de caméra pour l’activer et acquérir les images. Déplacez l’icône de caméra en position désactivée pour enregistrer l’image dans le tampon d’images.

Pour réaliser l'imagerie CLEM, utilisez une impression des images de microscopie optique afin de localiser les ZOI correspondantes en MET. Les caractéristiques architecturales du tissu sont utiles pour se repérer dans la section. Acquérir une image de la ZOI correspondante en MET.

Ensuite, pour préparer une image CLEM, assurez-vous que l'image de microscopie électronique en transmission (MET) est correctement orientée et agrandie à la même taille et résolution que l'image de microscopie optique, dans ce cas précis, 300 pixels par pouce. Étendez la taille du canevas de l'image de microscopie optique au double de sa taille initiale. Puis copiez et collez l'image MET à côté de l'image de fluorescence.

Pour créer une superposition de fluorescence dans Photoshop CS2, cliquez sur l'outil de sélection rectangulaire, sélectionnez l'image fluorescente, puis créez une couche dupliquée à partir de celle-ci. Réglez les options de fusion du style de calque sur une transparence de 30 à 40 %. Ensuite, cliquez sur l'outil de déplacement et faites glisser la couche de superposition de fluorescence sur l'image correspondante au MET, puis alignez les images.

Après avoir aligné les images, aplatir l'image pour produire le superposition finale. Ensuite, utiliser l'outil de sélection rectangulaire pour sélectionner la nouvelle image de superposition et la copier sur une nouvelle toile. Enfin, enregistrer l'image au format tf.

Dans cette image de microscopie à fluorescence, des cellules tumorales individuelles de somatostatinome contiennent d'abondantes granulations sécrétoires et ont été marquées positivement pour l'hormone somatostatine. Les noyaux apparaissent comme des trous sombres et, en faible grossissement, une fluorescence granulaire orangée variablement intense des points quantiques (QD) est visible dans le cytoplasme. La région d'intérêt (ROI) choisie en microscopie optique a été identifiée et imagée en utilisant la MET en se référant à une image de microscopie optique à 20X, comme indiqué ici.

À un grossissement plus élevé, la cellule démontre une fluorescence intense et un marquage marqué par les points quantiques dans les granules cytoplasmiques. La superposition des données de fluorescence sur les images de microscopie électronique en transmission, comme dans cet exemple, suggère que le marquage fortement positif correspond aux granules contenant un matériau modérément dense en électrons au sein de la membrane limitante de la vésicule. Enfin, comme observé ici à un grossissement plus élevé, les granules modérément denses en électrons présentaient un marquage immunologique intense par des nanocristaux de points quantiques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de la procédure, il est important de se souvenir de manipuler les grilles avec précaution, uniquement par les bords. Toucher la section lors de la prise de la grille peut détacher la section de la grille.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunomarquage multiplex peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si votre protéine d'intérêt co-localise avec une autre protéine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la pathologie pour explorer la localisation des protéines dans des tissus humains archivés, préparés pour la microscopie électronique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de combiner les informations immunocytochimiques provenant de la microscopie optique en fluorescence avec l'ultrastructure obtenue par microscopie électronique en transmission.

N'oubliez pas que le travail avec l'oxyde d'osmium peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection, le travail sous hotte aspirante et l'élimination appropriée des déchets doivent être prises lors de l'exécution de cette procédure.