Transfert de gènes à l'oreille de souris en développement intérieur par In Vivo Électroporation

Jane a été transférée à l’oreille interne de la souris en développement par in vivo, électroporation Ling Wang, Han Jang et John Burgandy, Centre de recherche sur l’audition de l’Oregon, Université de la santé et des sciences de l’Oregon. Je m’appelle John Burgandy. Mon laboratoire se trouve au Centre de recherche sur l’audition de l’Oregon à l’Université de la santé et des sciences de l’Oregon.

Je m’appelle Ang. Je suis une affiche dans le laboratoire de Johns. Je suis Ang, et je travaille également dans le laboratoire de Johns en tant qu’assistant de recherche.

Notre présentation est divisée en quatre parties. La première est la laparotomie ventrale. Nous démontrons le stylo sodique, l’anesthésie à base de barbital, comment tester l’adéquation de l’anesthésie, la protection de la cornée, la préparation du site chirurgical, la fiche technique de la chirurgie de survie de la souris de désinfection, l’incision médiane ventrale de la suite chirurgicale à travers la peau et la paroi abdominale et l’extériorisation des cornes utérines.

La deuxième partie est la micro-injection trans-utérine. Nous démontrons l’illumination trans de l’embryon, l’embryon, la réorientation, la micro-injection, la pipette, la fabrication et la micro-injection dans l’Otis au 11.5e jour embryonnaire et au 12.5e jour embryonnaire. La troisième partie est l’électroporation in vivo.

Nous démontrons le placement des électrodes de style palette et l’électroporation de l’assistance embryonnaire de la souris Day 11.5. La quatrième partie est consacrée aux résultats représentatifs. Nous montrons l’expression de la GFP dans les cochlées embryonnaires tardives et postnatales précoces.

Cela a résulté de l’électroporation in vivo de l’Otis avec plasmide d’expression au jour embryonnaire 11.5 partie de la première partie de la laparotomie ventrale. La mère est maintenue en toute sécurité en saisissant la peau derrière le cou, la queue et le membre postérieur gauche. Une injection intrapéritonéale d’un anesthésique à base de pentobarbital sodique est administrée après un écouvillonnage de l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.

La souris est placée à l’intérieur de sa cage d’habitation pendant quatre à cinq minutes pour permettre à l’anesthésique d’agir. Les pincements du pied et de la queue sont utilisés pour évaluer la pertinence de l’anesthésie. Ce barrage se ferme en réponse au pincement de la queue et a besoin de deux minutes de plus avant de devenir insensible aux stimuli nocifs.

Une pommade ophtalmique stérile est appliquée sur les yeux pour protéger les cornées de la dessiccation. Nous préparons le site chirurgical dans une hotte chimique pour minimiser la propagation de la fourrure et des squames. La fourrure est rasée à l’aide d’une lame fine pour exposer la peau recouvrant la paroi abdominale.

L’épilation complète facilite la cicatrisation de l’incision postopératoire. La désinfection de la peau abdominale est réalisée en alternant des passages de 70 % d’éthanol bétadine et 70 % d’éthanol. Passez toujours du rostral au dorlotement et utilisez une boule de coton chirurgical fraîche ou un applicateur à bout de coton.

Pour chaque passage, nous évaluons la profondeur et la qualité des respirations pendant la désinfection pour nous assurer que le barrage ne répond pas. Après, après le deuxième passage à 70 % d’éthanol, nous avons immédiatement placé la fichue surface ventrale sur un drap stérile et l’avons placée sur un coussin chauffant pendant deux à trois minutes pour la réchauffer. C’est le moment idéal pour enregistrer les données préopératoires sur la feuille de journal de la chirurgie de survie de la souris. Nous avons joint une fiche technique de notre chirurgie de survie chez la souris à titre d’information supplémentaire.

Envisagez d’inclure la fiche technique et votre protocole de soins aux animaux afin que votre comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux puisse voir comment vous surveillerez les données préopératoires et postopératoires. Nous remplissons une feuille de journal pour chaque sujet chirurgical. Nous préférons effectuer la chirurgie dans un environnement stérile, bien que cela ne soit généralement pas nécessaire pour les rongeurs.

La surface de travail est séparée du moteur du ventilateur et du boîtier du plénum, de sorte qu’aucune vibration n’est transmise à l’utilisateur. Lors de la micro-injection, nous avons joint à titre d’information supplémentaire, un schéma des modifications que nous avons apportées à notre hotte à flux laminaire pour faciliter le transfert de gènes in utero, les changements essentiels sont des découpes d’éclairage à faible niveau et sur rail et des réceptacles cachés pour les cordons d’alimentation des instruments, et un chemin de routage pour les circuits électriques accessoires. La salle d’opération se compose d’un sac IV de sonneries lactées électriques, d’un bain chaud, d’un manipulateur XY, Z, d’une stéréofluorescence, d’un microscope de dissection, d’une source lumineuse à fibre optique et d’instruments chirurgicaux.

Des pédales sont utilisées pour déclencher le micro injecteur, l’électro perter entrer dans la mise au point. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés dans un autoclave. Les instruments doivent être restérilisés entre les souris à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre ou en réautoclave le tourne-aiguille.

Les ciseaux Balli, les pinces à anneau et les pinces vasculaires sont les outils indispensables. Incision ventrale de la ligne médiane, saisir la peau avec une pince vasculaire et exciser le tégument avec les ciseaux à pointe sphérique, étendre l’incision de 10 à 14 millimètres. Identifiez la bande avasculaire blanche du tissu connecté appelée linea alba et la ligne médiane ventrale de l’abdomen, incisez le linéaire alba avec les ciseaux à pointes sphériques.

Veillez à ne pas entailler l’intestin ou les coussinets adipeux inguinaux. Irriguer immédiatement l’abdomen avec une solution stérile de lactate préchauffée. Évaluez les sites d’incision dans la peau et la paroi abdominale pour détecter les saignements.

Une pression directe avec une pince émoussée arrêtera les saignements mineurs s’il y en a, exitériorisera les cornes utérines droite et gauche avec des pinces à pointes annulaires. Attrapez doucement la corne utérine droite avec une extrémité annelée de la pince et tirez l’utérus vers l’incision médiane. Utilisez votre main libre pour manipuler doucement le côté latéral de la digue afin de faciliter l’accrochage de l’utérus.

Les pinces ne sont jamais utilisées pour comprimer l’utérus et le retirer. Étant donné que cela pourrait endommager le système vasculaire utérin ou les embryons, répétez la procédure d’extériorisation de la corne utérine gauche. Irriguez immédiatement les cornes utérines nouvellement extériorisées avec une solution de sonnerie de lactation préchaude, réinsérez doucement les coussinets adipeux inaux ou les intestins s’ils s’extériorisent avec l’utérus.

Ce n’est pas souvent le cas. Deuxième partie micro-injection utérine. Le barrage est disposé sous l’objectif à longue distance de travail et une lumière à fibre optique à câble souple est placée contre la paroi utérine.

L’utérus est doucement pressé avec un doigt de la main libre. Pour faciliter l’identification de l’orientation de l’embryon. La lumière du câble à fibre optique doit être à l’intensité la plus faible requise pour évaluer avec précision l’orientation de l’embryon.

Une lumière intense peut transmettre de la chaleur à l’utérus, ce qui peut entraîner des complications. Nous tenons la lumière à fibre optique et l’utérus dans une main et utilisons un doigt sur notre main libre pour repositionner l’embryon par palpation douce. Nous démontrons dans les trois vidéos suivantes par microscopie des clips EC et les orientations embryonnaires courantes observées par de l’utérus.

Le spectateur verra la vue microscopique que nous voyons lors de l’illumination trans, bien qu’en noir et blanc, l’illumination trans de l’utérus permette de détecter l’orientation de l’embryon in vivo. Dans cet exemple, l’embryon est en position poirier avec sa surface ventrale face au spectateur. En basculant l’utérus d’avant en arrière, nous pouvons détecter les membres postérieurs droit et gauche, la queue et le céphalon de l’œil gauche.

Dans cet exemple, l’embryon est à nouveau en position poirier, mais pivoté d’environ 90 degrés par rapport à l’axe antérieur postérieur. En basculant doucement l’utérus d’avant en arrière, nous pouvons voir les formes de pagaie qui définissent le membre postérieur gauche et le membre gauche pour le membre gauche. Le cerveau postérieur est également évident.

L’embryon est en position verticale, le côté gauche tourné vers le spectateur. Le quatrième ventricule naissant est détectable sous la forme d’une tache brillante dans le cerveau postérieur. Le céphalon de l’œil gauche, les quatre membres gauches et les membres postérieurs gauches sont également évidents.

Une légère pression sur l’utérus réoriente légèrement les embryons pour permettre la détection du tronc principal de la veine primaire de la tête et de ses branches antérieure et postérieure, qui sont marquées respectivement d’un astérisque blanc et noir. Comme nous le verrons, l’Otis est situé à mi-chemin entre les branches antérieure et postérieure de la veine primaire de la tête. L’Otis lui-même ne peut pas être vu à travers l’utérus par transillumination.

Nous montrons dans deux clips vidéo de microscopie successifs comment réorienter l’embryon pour la micro-injection dans l’Otis assist. L’objectif est d’identifier les repères embryonnaires qui permettent l’interpolation de l’emplacement de l’otis dans la tête latérale. Notre objectif est de réorienter l’embryon de la position dorsale à la position latérale afin que nous puissions identifier la veine primaire de la tête.

Le mésencéphale, le quatrième ventricule et le membre gauche sont évidents en position dorsale. Une légère pression sur l’utérus déplace l’orientation de l’embryon de la dorsale à la plus tardive. Le céphalon de l’œil gauche, le mésencéphale et le quatrième ventricule sont facilement apparents.

La veine primaire de la tête et sa branche postérieure indiquée par l’astérisque sont également évidentes. La branche antérieure de la veine primaire de la tête n’est pas clairement détectée. Notre objectif, encore une fois, est d’orienter l’embryon de manière à ce qu’il puisse identifier la veine primaire de la tête, mais sous un grossissement plus élevé approprié pour la micro-injection utérine.

Les vaisseaux utérins, la bande déciduale et l’œil gauche sont visibles dans cette perspective latérale. Une légère pression sur l’utérus déplace la position de l’embryon, de sorte que nous pouvons détecter le quatrième ventricule de l’œil gauche. La veine primaire de la tête et sa branche postérieure marquée par l’astérisque, la veine primaire de la tête et ses branches forment les montants du football américain.

La vésicule otique ne peut pas être vue à travers l’utérus, mais elle est située au centre des montants. Lynn a initié une séquence d’injection pour un embryon. Elle trans illumine l’utérus, réoriente l’embryon pour une micro-injection et apporte la pipette de micro-injection remplie de vert rapide sur le terrain.

La pipette de micro-injection est fixée à un porte-pipette qui est maintenu par un manipulateur microm X, Y, z. Le support magnétique du manipulateur est fixé à une plaque d’acier avec une base en téflon qui permet un positionnement grossier sans effort de la pipette de micro-injection. L’aiguille est avancée de manière appropriée à l’aide du bouton de commande du micromètre avant du manipulateur.

Les pipettes fabriquées sont essentielles pour une micro-injection traumatique dans l’embryon de souris au stade précoce d’Otis. Nous tirons des tubes capillaires en verre borosil à paroi épaisse avec un extracteur de pipette horizontal. La pipette résultante représentée en A est brisée manuellement à l’aide d’une pince à environ la position de diamètre extérieur de 14 à 16 microns indiquée par la pointe de flèche en B. La rupture grossière de la pipette illustrée en C est irrégulière et fragile.

Nous biseautons la pipette à environ 20 degrés pour affûter la pointe de la pipette, comme on le voit dans le panneau D, les paramètres pour tirer et biseauter les pipettes de micro-injection sont fournis dans le texte d’accompagnement. Nous démontrons dans les deux clips vidéo suivants que la micro-injection dans l’assistance otique de la souris aux jours embryonnaires 11,5 et 12,5. Notre objectif est de démontrer la micro-injection utérine dans l’otique embryonnaire de 11,5 souris.

Tout d’abord, nous injectons les otiques sans que l’utérus soit présent pour montrer sans ambiguïté comment une injection correctement ciblée apparaît. Ensuite, nous faisons la démonstration d’une micro-injection trans-utérine authentique. Pour cette première injection, l’utérus a été incisé pour permettre au sac viscéral d’extruder la bande déciduale recouvrant le sac vitellin viscéral a été retirée.

Le placenta reste attaché à l’utérus et l’embryon est vivant. Avec l’utérus enlevé de manière focale, nous voyons le quatrième ventricule, la veine primaire de la tête et ses branches antérieure et postérieure, la pipette et l’emplacement approximatif du kyste en blanc. Au début de cette séquence d’injection, un flux sanguin est détecté dans le système vasculaire du sac vitellin viscéral.

La pipette est avancée à travers le sac vitellin viscéral et dai est injecté dans l’osis note, le canal endolymphatique dorsalement et la position de l’otique au centre des montants. L’otique se trouve à mi-chemin entre les branches antérieure et postérieure de la veine primaire de la tête, micro-injection utérine dans le jour embryonnaire. 11.5 L’otique de la souris nécessite la détection de la veine de la tête primaire et d’au moins une de ses branches pour estimer l’emplacement de l’assistance otique.

Notre cible dans cet exemple schématique, les branches antérieure et postérieure de la veine de tête primaire sont détectées avec le territoire OUC marqué en blanc. Une présentation plus réaliste de l’embryon est celle où le tronc principal de la veine de tête primaire est détecté avec une seule de ses branches et l’exemple montré ne voit que la branche postérieure de la veine de tête primaire, mais cela suffit à interpréter l’emplacement de l’otique. Le PT est avancé à travers l’utérus et un colorant est injecté dans l’oticône.

Nous attendons 30 secondes pour permettre au colorant de s’écouler de la cavité amniotique, après quoi nous pouvons voir le canal endolymphatique dorsalement et le vestibule. Nous concluons par une vue à faible grossissement de l’embryon dont nous venons d’injecter le kyste pour fournir une perspective anatomique dans cette vue, le quatrième ventricule, l’œil gauche et le système vasculaire utérin sont visibles. Nous démontrons la trans et la micro-injection dans le kyste otique embryonnaire de souris au jour 12 et la micro-injection dans le quatrième ventricule naissant du cerveau postérieur.

La transillumination nous permet de détecter la veine primaire de la tête dans cette vue latérale gauche ainsi que l’œil. La pipette est avancée à travers l’utérus jusqu’à la vésicule otique et meurt injectée pour remplir sa lumière. Pour injecter le quatrième ventricule, nous faisons pivoter l’embryon de 90 degrés pour une vue dorsale du cerveau postérieur.

Le kyste gauche injecté se trouve maintenant du côté gauche. La pipette est avancée à travers l’utérus et est rapidement mélangée à du lor. Le dextran conjugué est injecté dans le quatrième ventricule.

Notez que le volume de colorant injecté ne pénètre pas dans le mésencéphale in vivo. La fluorescence est évaluée après l’injection pour valider la localisation du dextran dans le quatrième ventricule. L’embryon est ensuite réorienté de la position dorsale à la position latérale.

Le canal endolymphatique est juste ventral au quatrième ventricule dans cette vue latérale. La fluorescence in vivo valide la localisation du dextran dans le quatrième ventricule. À la naissance, nous dépistons la fluorescence verte des chiots dans le quatrième ventricule à l’aide d’une épifluorescence.

Les chiots du microscope à dissection avec une fluorescence verte dans leur cerveau postérieur possèdent une oreille interne qui a été manipulée lors de l’électroporation in vivo de l’embryogenèse de la troisième partie. Après avoir rempli le kyste avec le plasmide d’expression, l’utérus est fraîchement irrigué avec une solution de ringer lactate préchaude. La transillumination facilite le centrage du kyste ODU dans le champ d’électrodes.

La tête métallique de la lumière à fibre optique est rétractée de la surface utérine. Avant d’initier le train d’impulsions à ondes carrées, nous démontrons dans le clip de microscopie vidéo suivant un cycle d’électroporation complet in vivo. L’électroporation du jour embryonnaire, 11,5 kyste otique de souris nécessite le placement doux des électrodes de type palette sur l’utérus.

Dans cet exemple, le kyste otique gauche a été rempli de plasmide d’expression et l’utérus a été fraîchement irrigué avec des bagues lactées. La cathode est positionnée latéralement par rapport au kyste otique rempli et l’ode est positionnée médialement au début de la séquence d’ation, le kyste otique est centré dans le champ de palettes. L’utérus est comprimé doucement et le train d’impulsions à ondes carrées est initié à l’aide d’une pédale.

Idéalement, 60 à cent milliampères de courant sont délivrés par impulsion. L’utérus est alors libéré et immédiatement irrigué. L’utérus fraîchement irrigué est renvoyé dans la cavité abdominale par une légère pression avec la pince annulaire.

Une fois que l’utérus est internalisé, la cavité abdominale est rincée avec environ quatre mils de bagues lactées laissant environ un mil de bagues lactées dans la cavité abdominale pour aider à maintenir l’hydratation de la digue qui boira moins d’eau que d’habitude immédiatement après la chirurgie abdominale. La paroi abdominale puis la peau sont fermées par une suture résorbable à l’aide d’un tourne-aiguille. Notre tourne-aiguille est doté d’une ciseau intégrée qui simplifie la fermeture.

Nous préférons un point de coulage pour la paroi abdominale et la peau. Nous verrouillons un point sur deux pour fournir un soutien supplémentaire au site d’incision. Nous administrons un médicament anti-inflammatoire non stéroïdien par voie sous-cutanée avant de placer la digue dans la cage de récupération.

Consultez votre personnel vétérinaire pour savoir quels analgésiques prophylactiques sont préférés par le comité de soins et d’utilisation des animaux de votre établissement. Le barrage est niché dans un rideau stérile et posé sur le sol de la cage de récupération chauffée. La cage de récupération contient du matériel de nidification, un tube rouge pour se couvrir, de la nourriture de laboratoire et une bouteille d’eau.

La cage est remontée avec un chapeau de filtre sur le dessus le matin après l’opération. La mère est magnifiquement soignée, ambulatoire et capable de se tenir en équilibre sur ses membres postérieurs pour s’enquérir du haut de la cage ouverte. La ligne de suture de l’abdomen est propre, sèche et ne présente aucun signe de séparation, de rougeur ou d’enflure.

Nous avons annexé un document qui traite de l’élaboration d’un protocole de soins aux animaux pour le transfert de gènes in utero. Le document contient un libellé qui peut être utile lorsque vous concevez un protocole propre à un établissement en consultation avec votre comité de protection et d’utilisation des animaux. Quatrième partie, résultats représentatifs.

Les panneaux de résultats représentatifs A et B montrent une cochlée représentative d’un chiot postnatal du sixième jour dont Otis a été injecté avec un plasmide d’expression de protéine fluorescente verte améliorée au 11e jour embryonnaire, puis électro. La paroi latérale cochléaire a été retirée à mi-parcours et à l’apex. Seule l’expression de la GFP est présente de la base à mi-parcours de la cochlée et suit la distribution du marqueur de cellules ciliées myosine sept A montré dans le panneau B.Le panneau C montre une projection confocale à faible grossissement du jour embryonnaire.

18.5 organe de souris de corde immuno coloré avec un anticorps de myosine sept A cellules transfectées sont distribués dans tout l’organe de corde. Le panneau D montre une projection confocale à fort grossissement du jour embryonnaire. 18.5 Organe de souris de Corde coloré au Cin. Sept.

Une expression de GFP est détectée dans les cellules ciliées internes et externes, les cellules interphalangiennes, les cellules piliers et les cellules TER. Transfert de gènes par électroporation à l’Otis au jour embryonnaire 11.5 Progéniteurs transfecteurs qui donnent naissance à tous les types de cellules constitutives de l’organe de corde.