Préparation d’échantillons pour la métabolomique : méthode de préparation d’échantillons cellulaires pour le profilage de métabolites

La métabolomique est l’étude permettant d’identifier et de quantifier les métabolites présents dans les cellules. Pour préparer l’échantillon, commencez par ensemencer les cellules cancéreuses du sein avec le milieu de croissance dans deux plaques étiquetées comme test et contrôle. Incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Maintenant, retirez le milieu et ajoutez un milieu frais avec de l’œstradiol dans la plaque d’essai et un milieu ordinaire dans la plaque de contrôle.

L’œstradiol se lie au récepteur alpha des œstrogènes dans les cellules cancéreuses du sein pour induire certaines expressions, provoquant un changement dans la composition des métabolites. Incuber les plaques pendant la durée souhaitée. Remplacez le milieu par une solution saline tamponnée au phosphate glacée ou du PBS pour laver les cellules, puis ajoutez de l’acétone glacée. Les réactifs glacés arrêtent l’action des protéases et empêchent ainsi la dégradation des protéines.

Utilisez maintenant un grattoir pour détacher les cellules des plaques et transférez-les dans des tubes à l’aide d’une pipette. Prenez 20 microlitres de cette suspension cellulaire sur un hémocytomètre et comptez le nombre de cellules. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour une analyse plus approfondie. Dans le protocole suivant, nous préparons des échantillons de cellules MCF-7 pour la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse.

À l’aide de cellules MCF-7 cultivées selon le protocole textuel, ajoutez cinq millilitres de PBS 1x glacé dans la plaque. Inclinez ensuite la plaque plusieurs fois avant de retirer le PBS. Répétez l’opération deux fois de plus en enlevant autant de PBS que possible après le dernier lavage. Ajoutez 750 microlitres d’acétone pré-refroidie dans chaque plaque et raclez les cellules, puis combinez les cellules de deux plaques dans un tube de deux millilitres sur de la glace.

Pour compter les cellules à normaliser, pour chaque traitement, utilisez deux plaques supplémentaires pour la quantification cellulaire. Ensuite, pour détacher les cellules des plaques, ajoutez 2 millilitres de tampon HE et incubez pendant cinq minutes. Mélangez soigneusement les cellules en pipetant dans le tampon HE.

Ensuite, utilisez 20 microlitres de la solution cellulaire dans un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules au microscope. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius avant d’utiliser l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse pour identifier et quantifier les métabolites. Effectuez une analyse intégrative selon le protocole texte.