Extraction d’ADN mycobactérien à l’aide d’un battage de billes dans un tampon personnalisé suivi d’un flux de travail NGS

Nos recherches diagnostiques se concentrent sur l’amélioration de la détection de la résistance aux médicaments dans la tuberculose dans des contextes de ressources limitées, en mettant l’accent sur la rapidité et le pragmatisme. Dans le diagnostic de la tuberculose, il existe des tests génotypiques plus complets, et même un certain nombre de nouveaux tests phénotypiques rapides, et il y a des efforts constants pour rapprocher ces tests du point de service. Mais il existe encore un certain nombre d’obstacles pragmatiques.

Les problèmes de ressources, des réactifs à l’infrastructure en passant par la logistique, continuent d’être des obstacles importants. Avec tout ce qui va au-delà de la sophistication technique d’un test Cepheid Xpert, la normalisation du protocole est difficile dans différents contextes. Ainsi, l’extraction de l’ADN MTB, telle que détaillée dans ce travail ici, en est un excellent exemple.

Il est essentiel d’étendre les diagnostics de la tuberculose basés sur le séquençage, mais de nombreux laboratoires ne disposent toujours pas d’un moyen fiable d’extraire de l’ADN de haute qualité. Notre objectif est de partager une méthode simple, pratique et adaptée aux points de service à faibles ressources. Nous présentons ici un protocole simple et peu coûteux conçu pour être utilisé dans des environnements aux ressources limitées.

Il a été validé pour les applications NGS et est compatible avec les systèmes automatisés de manipulation de liquides. Pour commencer, combinez la solution de chlorure de sodium tampon de chlorhydrate Tris, le Triton X 100 et l’EDTA pour former le tampon Triton. Mélangez en remuant et ajoutez de l’eau ultrapure pour atteindre un volume final de 100 millilitres.

Filtrez et stérilisez le tampon avant utilisation. Ensuite, préparez 100 millilitres de tampon Tris-EDTA à faible teneur en EDTA en combinant un millilitre de Tris-HCl à une molaire et 20 microlitres d’EDTA à 0,5 molaire. Mélanger et remplir d’eau ultra-pure pour atteindre un volume final de 100 millilitres.

Ensuite, filtrez et stérilisez le tampon. Pour préparer les tubes de lyse, utilisez une lame de scalpel pour couper soigneusement le fond d’un tube à vis de 1,5 millilitre juste en dessous du point d’inflexion. Coupez l’embout d’une pointe de pipette P1000 et faites un coin en forme de V près de l’extrémité.

Cale le bas coupé du tube à bouchon à vis dans l’embout de pipette en forme de V pour former une cuillère. Remplissez un récipient stérile avec des billes de silicate de zircone de 0,1 millimètre. À l’aide de la cuillère préparée, transférez environ 200 milligrammes de billes dans des tubes à bouchon à vis de 1,5 millilitre.

Pour la préparation de la culture de cellules bactériennes, transférez cinq millilitres de culture de Mycobacterium tuberculosis dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Centrifugez-le à vitesse maximale pendant 10 minutes. Utilisez maintenant une pipette sérologique de 10 millilitres pour retirer soigneusement tout le surnageant, à l’exception d’environ 500 microlitres, sans déranger la pastille.

Utilisez une pipette P1000 pour retirer le surnageant restant. Remettez le granulé en suspension dans 350 microlitres de tampon triton personnalisé, puis mélangez bien en pipetant de haut en bas. Chauffez l’échantillon dans un bain de chaleur sec pendant 30 minutes à 95 degrés Celsius.

Pour préparer les expectorations, transférez un à cinq millilitres d’échantillon d’expectoration dans un tube à centrifuger stérile de 50 millilitres. Pour effectuer la liquéfaction du dithiothréitol, ajoutez quatre volumes de 10 millimolaires de dithiothréitol à l’échantillon d’expectoration, puis agitez abondamment pendant 30 secondes. Centrifugez l’échantillon à vitesse maximale pendant 10 minutes.

Ensuite, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour jeter tout le surnageant, sauf 500 microlitres. Retirez le reste du surnageant à l’aide d’une pipette P1000 sans déranger la pastille. Remettez le granulé en suspension dans 350 microlitres de tampon triton personnalisé.

Pour effectuer la liquéfaction de l’hydroxyde de sodium NALC, ajoutez quatre volumes de la solution d’hydroxyde de sodium NALC à l’échantillon d’expectoration. Agitez le mélange pendant 30 secondes. Ensuite, incubez le tube pendant sept minutes à température ambiante.

Ajoutez maintenant PBS jusqu’à la marque des 50 millilitres. Vortex le contenu du tube pour bien mélanger, puis centrifuger le tube à vitesse maximale pendant 10 minutes. Après centrifugation, à l’aide d’une pipette sérologique de 50 millilitres, jeter le surnageant comme démontré précédemment.

Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 350 microlitres de tampon triton personnalisé. Tout d’abord, transférez 350 microlitres d’échantillon inactivé dans un tube à bouchon à vis de 1,5 millilitre étiqueté contenant 250 microlitres de billes de silicate de zircone de 0,1 millimètre. Bead a battu le lysat à 6,5 mètres par seconde pendant 45 secondes avec deux minutes de repos entre les cycles.

Centrifugez l’échantillon à vitesse maximale pendant deux minutes, puis transférez 150 microlitres du surnageant dans un nouveau tube étiqueté. Ensuite, nettoyez le vortex en utilisant des billes magnétiques qui ont été assimilées à température ambiante pendant 30 minutes, pour les remettre en suspension. Transférez 180 microlitres de billes magnétiques sur l’échantillon d’ADN.

Pipette de haut en bas 10 fois pour mélanger. Après une incubation de deux minutes à température ambiante, placez le tube sur une grille magnétique et attendez deux minutes que la solution s’éclaircisse. Ensuite, utilisez une pipette de 200 microlitres pour jeter le surnageant.

Avec le tube toujours sur la grille magnétique, ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 70 % fraîchement préparé le long de la paroi opposée et attendez 30 secondes. À la fin du dernier lavage, retirez l’éthanol résiduel à l’aide d’une pipette de 10 microlitres et faites sécher à l’air libre pendant deux minutes. Dès que les billes deviennent opaques, retirez le tube du support magnétique.

Remettre en suspension dans 20 microlitres de tampon Tris à faible teneur en EDTA. Mélanger par pipetage ou vortex pour s’assurer que toutes les billes sont en solution avant une incubation de cinq minutes à température ambiante. Ensuite, placez le tube sur une grille magnétique pendant deux minutes jusqu’à ce qu’il soit clair.

Transférez ensuite moins de 20 microlitres de l’ADN élué dans un nouveau tube étiqueté pour éviter le transfert de billes. Pour quantifier l’ADN mycobactérien à l’aide d’une PCR quantitative ciblant 99 nucléotides de l’atpE mycobactérienne, assemblez un mélange maître QPCR sur de la glace. Ajustez le mixage principal en fonction de la quantité d’échantillons et d’étalons, y compris un dépassement de 10 % pour tenir compte de la perte de pipetage.

Faites fonctionner le thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant 60 secondes, suivi de 35 cycles de 95 degrés Celsius pendant 10 secondes et de 60 degrés Celsius pendant 30 secondes avec un taux de rampe de 2,11 degrés Celsius par seconde. Exécutez tous les échantillons, normes et contrôles en trois exemplaires. Ici, les cultures de mycobacterium tuberculosis ont donné les concentrations d’ADN les plus élevées parmi toutes les conditions testées.

Les échantillons d’expectorations ont montré des rendements d’ADN progressivement plus faibles et une variation accrue avec la diminution de l’apport bactérien, en particulier dans le groupe des 10 000 bactéries.