Name: Extraction d’ADN mycobactérien à l’aide d’un battage de billes dans un tampon personnalisé suivi d’un flux de travail NGS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'extraction d'ADN de Mycobacterium tuberculosis par broyage de billes et purification sur billes magnétiques. Ce protocole standardisé est optimisé pour le séquençage de nouvelle génération dans les laboratoires à ressources limitées.

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Cette étude a été menée à l’Université de Californie à San Francisco (UCSF) sous l’approbation du Comité institutionnel de biosécurité (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) et suit les directives d’éthique de la recherche de l’UCSF. Nous avons obtenu des échantillons d’expectorations restants prélevés par Discovery Life Sciences dans le cadre d’un protocole de renonciation au consentement approuvé par l’IRB auprès de personnes atteintes d’affections respiratoires non liées à la tuberculose.
1. Préparation des tampons
<ol>
	<li>Tampon Triton personnalisé (tableau 1) : Pour préparer 100 mL de tampon Triton personnalisé, commencez par combiner 2 mL de 5 M de NaCl, 1 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 8), 1 mL de Triton X-100 et 0,2 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,5 M. Ajouter de l’eau ultrapure pour porter le volume total à 100 ml. Filtrer et stériliser avant utilisation. Le tampon final contient 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA et 1 % de Triton X-100.</li>
	<li>Faible teneur en EDTA (tableau 2) : Pour préparer 100 mL de tampon à faible teneur en EDTA, mélanger 1 mL de Tris-HCl 1M (pH 8) et 0,02 mL d’EDTA 0,5 M. Ajouter de l’eau ultrapure pour porter le volume total à 100 ml. La mémoire tampon finale contient 10 mM de Tris-HCl et 0,1 mM d’EDTA.</li>
</ol>
2. Préparation des tubes de lyse
<ol>
	<li>À l’aide d’une lame de scalpel, coupez soigneusement le fond d’un tube à vis de 1,5 ml juste en dessous du point d’inflexion.</li>
	<li>Coupez la pointe d’une pointe P1000, coupez un coin en forme de V près de l’extrémité et coincez-y le fond préparé du tube à bouchon à vis. Reportez-vous à la figure 1 pour un schéma de la pelle.</li>
	<li>Remplissez un récipient stérile (p. ex., un réservoir ou une boîte de Pétri) avec des billes de zircone-silicate de 0,1 mm et utilisez la cuillère préparée pour répartir une cuillère de billes (~200 mg) dans des tubes à bouchon à vis de 1,5 ml.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
Figure 1 : Pelle de distribution des billes en interne. La pelle a été conçue pour le transfert facile de ~200 mg de billes de zirconium de 0,1 mm dans des tubes de traitement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Préparation des contributions
REMARQUE : Toute la préparation des échantillons doit être effectuée conformément aux protocoles de biosécurité de votre établissement. Nous recommandons fortement de manipuler les matières infectieuses à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité (ESB) de classe II afin de minimiser le risque d’exposition aux aérosols.
<ol>
	<li>Culture cellulaire bactérienne<ol>
		<li>Centrifuger ~ 5 mL de culture de M. tuberculosis (MGIT ou culture liquide trouble) dans un tube de centrifugation conique de 15 mL à vitesse maximale (≥ 3 000 x g) pendant 10 min.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, prélever soigneusement tout le surnageant, sauf ~ 500 μL, sans déranger la pastille. Retirez le surnageant restant à l’aide d’une pipette P1000 sans déranger la pastille.</li>
		<li>Remettez le granulé en suspension dans 350 μL de tampon Triton personnalisé en le pipetant de haut en bas. Au besoin (c.-à-d. pour prélever des échantillons à traiter à l’extérieur d’une BSL-3), inactiver l’échantillon conformément aux procédures d’exploitation normalisées.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation des expectorations<ol>
		<li>Transvaser 1 à 5 ml d’échantillon d’expectoration (spontané ou induit) dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquéfaction de la TNT<ol>
		<li>Ajouter quatre volumes de 100 mM de dithiothréitol à l’échantillon d’expectoration (le volume peut varier). Si vous utilisez un réactif commercial, suivez les instructions de dilution du fabricant.</li>
		<li>Tourbillonnez à fond pendant 30 s. Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 7 min. Vortex à nouveau pendant 30 s.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.3.1. et 3.3.2. 1x, pour les échantillons très visqueux, effectuer jusqu’à 5 cycles d’incubation-vortex.</li>
		<li>Centrifugeuse à vitesse maximale (≥ 3 000 x g) pendant 10 min. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, jeter soigneusement tout le surnageant, sauf ~ 500 μL. Retirez le surnageant restant à l’aide d’une pipette P1000 sans déranger la pastille.</li>
		<li>Remettez la pastille en suspension dans 350 μL de tampon Triton personnalisé.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquéfaction NALC-NaOH<ol>
		<li>Pour préparer la solution de NALC-NaOH, suivez les instructions du fabricant pour la préparation et la dilution.</li>
		<li>Ajouter quatre volumes de solution de NALC-NaOH à l’échantillon d’expectoration (spontané ou induit, le volume peut varier).</li>
		<li>Vortex pendant 30 s. Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 7 min. Répétez les étapes 3.4.1 et 3.4.2. 1 fois. Pour les échantillons très visqueux, effectuez jusqu’à 5 cycles d’incubation-vortex.</li>
		<li>Ajouter du PBS à la marque de 50 ml. Vortex brièvement pour mélanger. Centrifugeuse à vitesse maximale (≥ 3 000 x g) pendant 10 min.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL, jeter soigneusement tout le surnageant, sauf ~ 500 μL. Retirez le surnageant restant à l’aide d’une pipette P1000 sans déranger la pastille.</li>
		<li>Remettez la pastille en suspension dans 350 μL de tampon Triton personnalisé. Au besoin (c.-à-d. pour prélever des échantillons à traiter à l’extérieur d’une BSL-3), inactiver l’échantillon conformément aux procédures d’exploitation normalisées.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Extraction de l’ADN
<ol>
	<li>Transférez la suspension bactérienne inactivée (350 μL à partir de l’étape 3) dans un nouveau tube à bouchon à vis bien étiqueté de 1,5 ml contenant ~250 μL de billes de zircone-silicate de 0,1 mm.</li>
	<li>La bille a battu le lysat à 6,5 m/s pendant 45 s avec 2 min de repos entre les passages. Répétez l’opération pour un total de trois cycles de battage de billes.</li>
	<li>Centrifuger à vitesse maximale (≥ 12 000 x g) pendant 2 min et transférer 150 μL du surnageant dans un nouveau tube bien étiqueté. Veillez à ne pas transférer de billes ou de débris cellulaires.</li>
	<li>Laissez les billes magnétiques de nettoyage s’équilibrer à la température ambiante pendant 30 minutes et tourbillonnez complètement pour assurer une remise en suspension complète avant utilisation.</li>
	<li>Ajouter 180 μL (1,2 fois le volume) de billes magnétiques de nettoyage et mélanger en pipetant 10 fois de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 2 min.</li>
	<li>Placer sur une grille magnétique et attendre que la solution se dissipe pendant ~ 2 min. À l’aide d’une pipette P200, jeter soigneusement le surnageant sans déranger les billes magnétiques.</li>
	<li>Avec le tube toujours sur le support magnétique, ajoutez 500 μL d’éthanol à 70 % (v/v) fraîchement préparé, en distribuant le long de la paroi opposée du tube jusqu’aux billes magnétiques. Attendez 30 s.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.5. - 4.7. pour un total de deux lavages. À la fin du dernier lavage, retirez l’éthanol résiduel à l’aide d’une pipette P10. Séchez brièvement les perles pendant ~ 2 min.</li>
	<li>Immédiatement après que la bille est devenue opaque, retirez le tube de la grille magnétique et mettez-le en suspension dans 20 μL de tampon Tris à faible teneur en EDTA. Ne laissez pas les billes devenir sèches et fissurées.</li>
	<li>Mélanger par pipetage ou vortex pour s’assurer que toutes les billes sont en solution. Incuber à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Placer sur une grille magnétique et attendre que la solution devienne claire pendant ~ 2 min. Transférez l’ADN élué dans un nouveau tube bien étiqueté pour une analyse en aval. Aspirez &lt;20 μL d’ADN extrait pour éviter le transfert de billes magnétiques.</li>
</ol>
5. Dénombrement qPCR de l’ADN mycobactérien
<ol>
	<li>Pour quantifier l’ADN mycobactérien à l’aide d’une PCR quantitative ciblant 99 nucléotides de l’atpE mycobactérien (Rv1305), assembler un mélange réactionnel de 10 μL par échantillon sur de la glace contenant 5 μL de mélange maître de sonde universel (2x), 0,4 μL d’amorce directe (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGGGG-3', 10 μM) et d’amorce inverse (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL de sonde TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL de matrice d’ADN et 2 μL d’eau exempte de nucléases (tableau 3).</li>
	<li>Exécutez la réaction en utilisant les conditions de cycle thermique suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 60 s, suivie de 35 cycles de 95 °C pendant 10 s et de 60 °C pendant 30 s (avec une capture ici, en utilisant un taux de rampe de 2,11 °C/s ; Tableau 4). REMARQUE : Dans ce cas, la qPCR a été réalisée à l’aide d’un test TaqMan avec une sonde marquée VIC sur un système de PCR en temps réel QuantStudio 3,</li>
	<li>Exécutez tous les échantillons, normes et contrôles en triplicats techniques. Générer des courbes standard en utilisant des dilutions en série d’ADN purifié de M. tuberculosis . Effectuez une analyse de quantification relative à l’aide d’un logiciel d’analyse.</li>
	<li>Exportez les valeurs de quantification relatives résultantes au format CSV et visualisez-les à l’aide de R Studio (version 2024.09.1+394) pour générer des boîtes à moustaches comparant les rendements en ADN entre les méthodes d’extraction.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
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<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
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<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Perles de zircone-silicate de 0,1 mm</td><td>Produits Biospec</td><td>Référence 11079101z</td><td>Perles utilisées pour l’étape de battement des billes pour lyser les cellules mycobactériennes</td></tr><tr><td>Perles AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>Réf. A63880</td><td>Perles magnétiques pour le nettoyage de l’ADN après la lyse</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés</td></tr><tr><td>Fastprep 24</td><td>MPbio, États-Unis</td><td>116004500</td><td>Équipement pour le battage des talons à 6,5 m/s</td></tr><tr><td>Introduction à l’avant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Synthèse sur mesure</td><td>Séquence d’amorce : AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (Eau, grade biologie moléculaire)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. BP2819-1</td><td>Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés</td></tr><tr><td>Sonde universelle Luna</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>Référence M3004</td><td>Réactif qPCR pour le dénombrement de l’ADN mycobactérien</td></tr><tr><td>MycoPrep Kit</td><td>BD</td><td>UGS/RÉF 240863</td><td>Digestion d’échantillons BD MycoPrep pour le traitement des expectorations NALC-NaOH</td></tr><tr><td>NaCl (chlorure de sodium, solution 5M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9759</td><td>Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>Réf. P2272</td><td>Traitement des expectorations</td></tr><tr><td>Apprêt inversé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Synthèse sur mesure</td><td>Séquence d’amorce : GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>Sonde TaqMan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Synthèse sur mesure</td><td>Séquence de sonde : AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 m, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28314</td><td>Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés</td></tr></tbody></table>

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Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

Décrit ici est un protocole d’extraction d’ADN utilisant des perles magnétiques pour produire des extractions d’ADN de haute qualité à partir de moustiques. Ces extractions conviennent à une approche de séquençage de nouvelle génération en aval.

Un protocole d’extraction de l’ADN des moustiques à base de perles magnétiques pour le séquençage de nouvelle génération

L’expression des gènes est régulée par les interactions des promoteurs de gènes avec les éléments régulateurs distaux. Ici, nous décrivons comment la capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C) permet l’identification de ces interactions dans des types de cellules rares, qui étaient auparavant non mesurables.

Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares

Nous présentons une méthode optimisée pour l’extraction de l’ADN à partir d’expectorations décontaminées à l’aide d’une méthode d’extraction matricielle combinée à une purification par billes magnétiques pour le séquençage ciblé de nouvelle génération de Mycobacterium tuberculosis en aval.

Extraction d’ADN basée sur la matrice pour un séquençage ciblé de nouvelle génération sur des échantillons d’expectorations décontaminés

Ce protocole décrit la méthode CTAB pour extraire de l’ADN de haute qualité des mycobactéries, surmontant les défis posés par leurs parois cellulaires solides et riches en acide mycolique. Le processus implique la digestion enzymatique, la lyse cellulaire avec CTAB, et la purification de l’ADN par extraction organique et précipitation d’éthanol. Cette méthode produit de l’ADN adapté à des études moléculaires et fiable pour la recherche sur les mycobactériens.

Extraction d’acides désoxyribonucléiques par génome entier à partir d’espèces de Mycobacterium via la technique du bromure de cétyltriméthylammonium

Ici, nous présentons un protocole permettant le séquençage du génome entier des infections bactériennes sexuellement transmissibles à partir d’échantillons cliniques en utilisant l’enrichissement cible. Cette nouvelle méthode basée sur un panel syndromique permet de surmonter les défis de l’ADN humain abondant et des faibles charges bactériennes, facilitant la surveillance génomique de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum et Mycoplasma genitalium.

Génération de génomes bactériens entiers à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’un flux de travail d’enrichissement cible

L’étude actuelle décrit un flux de travail pour le séquençage nanopore des plasmides lorsque la séquence chromosomique est déjà connue ou sans intérêt. Une étape initiale d’enrichissement de l’ADN plasmidique assure une profondeur optimale de séquence plasmidique et maximise le nombre d’échantillons pouvant être séquencés par cellule de flux.

Séquençage et assemblage de plasmides à longue lecture utilisant des flux de travail basés sur le séquençage nanopore

Découvrez une méthode rapide d'extraction d'ADN de Mycobacterium tuberculosis par broyage de billes et purification sur billes magnétiques. Ce protocole standardisé est optimisé pour le séquençage de nouvelle génération dans les laboratoires à ressources limitées.

Extraction d’ADN mycobactérien à l’aide d’un battage de billes dans un tampon personnalisé suivi d’un flux de travail NGS

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