Name: Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Apprenez à mesurer le transport inverse de la dopamine dans des neurones en voltage-clamp par patch-clamp simultané et ampérométrie. Cette méthode permet d'étudier la libération médiée par DAT en contrôlant le potentiel cellulaire.

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Nous remercions le Dr Chirwa Sanika à l&#39;examen critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (DA026947, DA021471 et NS071122).

1. Matériel et fournitures <ol><li> Monter une cage de Faraday sur le dessus de la table anti-vibration (TMI) pour diminuer le bruit de fond. </li><li> La pince simultanée correctif d&#39;enregistrement ampérométrie système nécessite un microscope inversé avec d&#39;excellentes optiques DIC et une lentille longue distance de travail. Branchez le microscope phare à une batterie de voiture. Cette source de lumière continue pour le système va encore réduire le bruit électrique. </li><li> Micromanipulateurs hydrauliques (Siskiyou) diminution supplémentaire du bruit. Dans notre configuration, nous utilisons un manipulateur droitier pour l&#39;enregistrement de cellules entières, et le gaucher pour ampérométrie. </li></ol> 2. Préparer électrodes pour l&#39;enregistrement <ol><li> Tirez électrodes de patch en utilisant les pipettes de quartz sur un extracteur P-2000 (Sutter). Notre traction dure environ 5 secondes, avec deux cycles thermiques. Cette fois, la chaleur a provoqué une résistance constante (3-4 MQ) dans nos pipettes de patch ensemble de cellules. </li><li> Remplir l&#39;électrode avec l&#39;solution de la pipette contenant 2 mM de dopamine et le monter sur le manipulateur droit. Envelopper le tube contenant la solution contenant DA pipette avec une feuille d&#39;aluminium. Garder sur la glace. La dopamine est oxydable. Garder la solution sur de la glace, à l&#39;abri de la lumière diminue le taux d&#39;oxydation de la dopamine. </li><li> Retirez délicatement un ProCFE (Dagan) électrode basse en fibre de carbone ampérométrique de bruit à partir de la boîte de remisage, remplir avec du mercure, montage sur l&#39;adaptateur ampérométrique (comme le montre la figure 1), puis monter sur le maniupulator droite. Protéger la pointe de la fibre de carbone contre les dommages en maintenant l&#39;extrémité de la fibre de carbone. Vérifiez l&#39;électrode avec un microscope de laboratoire pour garantir la pointe est propre et intacte. </li><li> Examiner l&#39;intégrité de l&#39;électrode ampérométrique en mettant l&#39;électrode dans une boîte de Petri en verre contenant une solution de fond externe. Enregistrer un courant de référence en l&#39;absence de la dopamine. Ajouter 10 ul d&#39;une solution 1 mM DA au plat. Une nouvelle électrode ampérométrique bonnecâblés d&#39;une augmentation du courant d&#39;oxydation. Répétez cette étape au début et à la fin de chaque expérience afin de s&#39;assurer de l&#39;électrode ampérométrique fonctionne correctement. </li></ol> 3. Préparer la culture primaire de neurones à dopamine des neurones ou des cellules modifiées génétiquement pour exprimer transporteur de la dopamine dans les plats de Pétri en verre de fond <ol><li> Lavez délicatement les cellules appelées neurones dopaminergiques trois fois avec une solution externe au chaud. </li><li> Monter le fond en verre de Pétri sur la platine du microscope. </li></ol> 4. Visualisez cellulaire et exécuter l&#39;expérience <ol><li> Trouver le bon point focal de visualiser clairement les cellules. Exercer une pression positive sur l&#39;électrode de patch. Ensuite, amener doucement vers le bas les deux électrodes dans la solution, et à proximité de la cellule. </li><li> Positionner l&#39;électrode ampérométrique à côté de la cellule (à gauche), et l&#39;électrode de patch sur la droite. </li><li> Réaliser un joint d&#39;étanchéité gigaohm sur la cellule de l&#39;électrode de patch. La rupture du joint avec aspirationatteindre configuration cellule entière. </li><li> Permettre 5-8 min pour la dialyse de la solution interne contenant la dopamine dans la cellule. </li><li> Utiliser désiré échelon de tension ou d&#39;un protocole de rampe. Acquérir simultanément les données provenant à la fois de la pipette de patch et l&#39;électrode ampérométrique pour mesurer les courants de cellules entières et inverser le transport de la dopamine par le transporteur de la dopamine tandis que le potentiel de la membrane est contrôlée par l&#39;intermédiaire de la pipette de patch. </li></ol>

<ol><li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li>
<li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li>
<li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li>
<li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na%2B-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li>
<li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li>
<li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li>
<li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382(2010).</li>
<li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Simultanée voltage-clamp et ampérométrie présente les avantages suivants. Tous les types de cellules sont accessibles et peuvent être utilisés pour l&#39;enregistrement. L&#39;identification des cellules ou neurones où les enregistrements sont effectués est simple et direct. En particulier, si la cellule est marquée par fluorescence par addition d&#39;un marqueur fluorescent pour la protéine d&#39;intérêt à l&#39;expérimentateur peut facilement sélectionner la cellule cible ou des neurones. La configuration expérimental...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Anti-vibration table w / cage de Faraday </td><td> Technique Manufacturing Corporation </td><td> 63-500 série </td><td> nous utilisons le modèle 63-543 </td></tr><tr><td> Microscope inversé Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> interrompu </td><td> maintenant Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Deux amplificateurs à faible bruit Axopatch 200B </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-203 CV headstage BU </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> HL-1-U porte-pipette </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A convertisseur A / N </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Deux manipulateurs Siskyou, gaucheet droitier </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipette extracteur </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Faible bruit de fibres de carbone électrode ampérométrique </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Faible bruit de quartz pipette </td><td> Sutter Instruments </td><td> QF100-70-7.5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Batterie de voiture de 12 volts </td><td></td><td></td><td> largement disponibles </td></tr><tr><td> Chargeur de batterie de voiture </td><td></td><td></td><td> largement disponibles </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Le sulfate de magnésium (MgSO 4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Dihydrate de chlorure de calcium (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Hexahydrate de chlorure de magnésium (MgCl 2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

mesure single cell de la libération de dopamine avec voltage-clamp simultanée et amperometry

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Après sa libération dans la fente synaptique, la dopamine exerce ses propriétés biologiques par l&#39;intermédiaire de ses objectifs pré-et post-synaptique 1. Le signal de la dopamine se termine par la diffusion de 2-3, enzymes extracellulaires 4 et transporteurs membranaires 5. Le transporteur de la dopamine, située dans la fente péri-synaptique des neurones dopaminergiques efface les amines libérées par un flux entrant de dopamine (absorption). Le transporteur de la dopamine peut aussi fonctionner dans le sens inverse pour libérer des amines de l&#39;intérieur vers l&#39;extérieur dans un processus appelé transport vers l&#39;extérieur ou l&#39;efflux de dopamine 5. . Plus de 20 ans, Sulzer et al ont rapporté le transporteur de la dopamine peut fonctionner en deux modes d&#39;activité: avant (absorption) et inverse (efflux) 5. Le neurotransmetteur libéré par efflux par le transporteur peut transporter une grande quantité de dopamine dans l&#39;espace extracellulaire, et il a été montré à jouer un rôle majeur dans la régulation extracellulaire de dopamine homeostasis 6. Nous décrivons ici comment patch-clamp et l&#39;enregistrement simultanés ampérométrie peut être utilisé pour mesurer la dopamine libérée par l&#39;intermédiaire du mécanisme d&#39;efflux avec une résolution temporelle millisecondes lorsque le potentiel de la membrane est contrôlée. Pour cela, l&#39;ensemble de la cellule courante et à l&#39;oxydation (ampérométrique) signaux sont mesurés simultanément en utilisant un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, avec un ensemble de Bessel passe-bas du filtre à 1.000 Hz pour l&#39;ensemble des cellules d&#39;enregistrement en cours). Pour l&#39;enregistrement d&#39;une électrode ampérométrique fibre de carbone est reliée à un second amplificateur (200B Axopatch) et est placé à côté de la membrane plasmique et maintenu à +700 mV. Les cellules entières et à l&#39;oxydation (ampérométrique) courants peuvent être enregistrées et la relation courant-tension peut être généré à l&#39;aide d&#39;un protocole échelon de tension. Contrairement à l&#39;étalonnage d&#39;habitude ampérométrique, qui exige la conversion de la concentration, le courant est directement signalé sans tenir compte de la 7 fois le volume efficace. Ainsi, les données qui en résultentreprésentent une limite inférieure à efflux de dopamine parce que certains émetteur est perdu à la solution en vrac.

Patch-clamp combinée avec ampérométrie peut mesurer la tension en fonction de DAT DA induite par efflux. Figure 2A montre une configuration représentative expérimentale et l&#39;enregistrement des DAT DA induite par efflux lorsque le milieu intracellulaire et le potentiel de membrane sont serrées par une pipette de patch de cellule entière. En utilisant cette technique, les cellules exprimant les protéines YFP-DAT sont serrées en tension avec une pipette de patch pendant toute cellule d&#39;une électrod...

La technique de mesure ampérométrique la libération de dopamine à partir d&#39;une seule cellule en détectant le courant oxydatif produit par oxydation spontanée dopamine. Pince simultanée de la tension et de la méthodologie ampérométrie révéler la relation mécanique entre l&#39;ensemble «activité» du transporteur de la dopamine et le rôle régulateur de l&#39;activité sur le transport inverse de la dopamine.

Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

Après sa libération dans la fente synaptique, la dopamine exerce ses propriétés biologiques via ses cibles pré- et post-synaptiques1. Le signal dopaminergique est...

L'objectif de cette procédure est de mesurer le transport rétrograde de la dopamine dans un neurone soumis à un clampage de tension, en utilisant simultanément un enregistrement en patch clamp et la pyrométrie pour quantifier la libération de dopamine (D) médiée par le transporteur DAT. Cette mesure est réalisée en premier lieu en testant l'intégrité de l'électrode pyrométrique à l'aide de dopamine. La deuxième étape consiste à positionner l'électrode pyrométrique près de la cellule et à établir un enregistrement en mode cellule entière du neurone à l'aide d'une pipette de patch.Ensuite, la tension de la cellule est contrôlée à l’aide de la micropipette de patch et la dopamine libérée par la cellule via le DAT est enregistrée simultanément à l’aide d’une électrode pyrométrique. La dernière étape consiste à ajouter un inhibiteur du DAT et à enregistrer à nouveau les courants de la cellule entière et les courants pyrométriques, afin de pouvoir soustraire le courant spécifiquement médié par le transporteur de dopamine. L’importance de cette technique réside dans la capacité de mesurer le transport inverse de la dopamine par l’intermédiaire du transporteur de dopamine tout en contrôlan

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