Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

Le but de cette procédure est de mesurer le transport inverse de la dopamine dans un neurone qui est serré en tension à l’aide d’un patch clamp et d’une pyrométrie simultanés pour mesurer la libération de D médiée par DAT. Pour ce faire, il faut d’abord tester l’intégrité de l’électrode pyrométrique avec de la dopamine. La deuxième étape consiste à placer l’électrode pyrométrique près de la cellule et à obtenir un patch cellulaire entier du neurone avec une pipette patch.

Ensuite, la tension de la cellule est contrôlée à l’aide de la pipette patch et la dopamine médiée par DAT libérée par la cellule est enregistrée simultanément à l’aide d’une électrode pyrométrique. La dernière étape consiste à ajouter le bloqueur DAT et à enregistrer à nouveau l’ensemble des courants de cellule et de pyrométrie pour permettre de soustraire le courant spécifiquement médié par le transporteur de dopamine. L’importance de cette technique est la capacité de mesurer le transport inverse de la dopamine via le transporteur de dopamine tout en contrôlant simultanément la tension du neurone dopaminergique.

Le système d’enregistrement simultané par pince de patch et barométrie nécessite un microscope inversé avec d’excellentes optiques DIC et une lentille à longue distance de travail pour générer une source de lumière CC pour le système. Avec un faible bruit électrique, connectez le phare du microscope à une batterie de voiture. Les micromanipulateurs hydrauliques sont utilisés car ils ne contribuent pas sensiblement aux niveaux de bruit dans notre configuration.

Un manipulateur droitier est utilisé pour la pince de tension, l’enregistrement de cellules entières et le manipulateur gaucher pour la pyrométrie. Pour préparer l’électrode à l’enregistrement en gros, tirez une pipette à quartz avec un extracteur P 2000. En règle générale, nous utilisons une pipette avec une résistance de trois à quatre méga ohms.

Ensuite, remplissez l’électrode avec la solution de pipette contenant une dopamine millimolaire. Ensuite, montez-le sur le support de pipette sur le manipulateur droit. Assurez-vous d’envelopper le récipient qui contient la solution de pipette contenant de la dopamine avec du papier d’aluminium et de le conserver sur de la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.

Comme la dopamine est oxydable, garder la solution sur de la glace et à l’abri de la lumière diminuera le taux d’oxydation. Enfilez le fil d’argent dans le porte-électrode, puis enfilez l’adaptateur paramétrique am sur le porte-électrode. Ensuite, remplissez l’électrode tric avec suffisamment de mercure pour entrer en contact avec le fil d’argent.

Lorsque l’électrode est montée sur l’adaptateur, assurez-vous d’inspecter la fibre de carbone à faible bruit pro CFE et l’électrode paramétrique au microscope pour vous assurer que la pointe est propre et intacte. Assurez-vous de tenir l’extrémité la plus éloignée de la fibre de carbone afin de protéger l’extrémité de la fibre de carbone contre les dommages. Montez ensuite l’électrode pro CFE Tric.

Montez ensuite l’électrode assemblée sur le manipulateur hydraulique gauche pour examiner l’intégrité de l’électrode tric. Plongez-le dans une boîte de Pétri à fond de verre contenant la solution externe. Enregistrez le courant de base en l’absence de dopamine.

Ajoutez ensuite 10 microlitres d’une solution de dopamine d’un millimolaire dans le plat. Une bonne électrode métrique Emper doit enregistrer une augmentation du courant oxydatif. Assurez-vous de vérifier l’intégrité de l’électrode métrique de l’emper avant et après les expériences.

Dans cette procédure, récupérez les neurones ou les cellules de dopamine modifiés pour exprimer le transporteur de dopamine placés dans la boîte de Pétri à fond de verre de l’incubateur. Lavez doucement les cellules ou les neurones dopaminergiques trois fois avec une solution externe chaude. Pour visualiser les cellules et réaliser l’expérience, montez la boîte de Pétri à fond de verre sur la platine du microscope et trouvez le bon point focal pour visualiser clairement les cellules.

Ensuite, appliquez une pression positive sur l’électrode de patch. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, abaissez doucement les deux électrodes dans la solution et rapprochez la cellule avec les micromanipulateurs. Positionnez ensuite l’électrode métrique Emper sur le côté gauche de la cellule et l’électrode patch sur la droite.

Lorsque l’électrode patch touche la cellule. Appliquez une légère aspiration par la bouche ou la seringue pour former un giga joint sur la cellule. Après cela, rompez le joint avec aspiration pour obtenir une configuration de cellule entière, et attendez cinq à huit minutes pour la dialyse de la solution interne contenant de la dopamine dans la cellule.

Enregistrez ensuite les courants médiés par DAT en faisant passer la tension de la membrane cellulaire entre moins 60 et plus 100 millivolts à partir d’un potentiel de maintien de moins 40 millivolts à travers la pipette. Pour déterminer la dopamine médiée par DAT spécifique, flx enregistre les courants métriques de l’emper en l’absence et en présence d’un antagoniste du DAT. Le courant trique spécifique médié par DAT est ensuite déterminé en soustrayant les traces enregistrées en présence de l’antagoniste DAT des traces d’emper enregistrées sans l’antagoniste.

Une déviation vers le haut des courants triques correspond à un flux sortant de dopamine illustré ici. Un DAT a médié les courants enregistrés en augmentant la tension de la membrane de 20 millivolts entre moins 60 et plus 100 millivolts à partir d’un potentiel de maintien de moins quatre millivolts C avec la pipette contenant deux millimolaires de dopamine dans le mode de brassage de la cellule entière. Voici le courant métrique Emper acquis simultanément avec le courant de la cellule entière.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer le transport inverse de la dopamine via le transporteur de dopamine dans un neurone à tension serrée. N’oubliez pas de vérifier l’intégrité de l’électrode paramétrique avant et après les expériences, et n’oubliez pas de soustraire les traces enregistrées en présence de cet antagoniste des traces triques enregistrées sans l’antagoniste.