Name: Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour lidentification des gènes impliqués dans des organites intégrité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Découvrez une méthode de criblage par microscopie à fluorescence et séquençage nouvelle génération pour identifier les gènes impliqués dans l'intégrité des organites végétaux. Cette approche permet de cartographier les mutations récessives chez Arabidopsis thaliana.

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Nous reconnaissons le soutien de la Chimie, Géosciences et Biosciences Division, Bureau des sciences fondamentales de l&#39;énergie, Bureau de la science, US Department of Energy (numéro de la subvention DE-FG02-91ER20021) et la National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Nous sommes reconnaissants à Mme Karen Bird pour l&#39;édition du manuscrit.

1. EMS traitement Graines d&#39;Arabidopsis thaliana sont mutagenèse utilisant comme agent de mutagène méthanesulfonate d&#39;éthyle (EMS) 3,4, ce qui induit dans le génome de C-à-T changements qui en résultent en C / G à T / A mutations 5-7. <ol><li> Peser 0,8 g de graines d&#39;Arabidopsis (~ 40,000 graines) portant le marqueur fluorescent organite (plus précisément, dans cette étude ssGFPHDEL (séquence signal-GFP-HDEL tétrapeptide) a été utilisée comme un marqueur ER). </li><li> Transférer les graines dans un tube de 50 ml faucon, puis ajouter 25 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Ajouter 0,2% (v / v) méthanesulfonate d&#39;éthyle. </li><li> Incuber pendant 16 heures sur nutation mélangeur à basse vitesse. </li><li> Aspirer le liquide et jetez-le dans un flacon contenant 1,0 M de NaOH pour inactiver l&#39;EMS. </li><li> Ajouter 25 ml d&#39;eau dans le tube Falcon contenant les graines, à proximité, et inverser 5 fois pour se laver les graines et attendre jusqu&#39;à ce que toutes les graines se sont installés, puis aspirer l&#39;eau et jetez dans la Na 1,0 M<html> OH ballon. </li><li> Répétez l&#39;étape de lavage jusqu&#39;à 10 fois. </li><li> Après le lavage final, remettre en suspension les graines dans une quantité minimale d&#39;eau. </li><li> Passez à la stérilisation des semences en ajoutant 25 ml d&#39;eau de Javel à 10%, agiter vigoureusement pendant 30 s. Laissez les graines se déposent au fond, versez l&#39;eau de Javel et rincer avec 25 mL d&#39;eau stérile. Décanter l&#39;eau stérile et ajouter 25 ml d&#39;éthanol 70%. Agiter les tubes pendant 30 s. Laissez les graines se déposent au fond. Décanter l&#39;éthanol et rincer avec 25 mL d&#39;eau stérile. Répéter deux fois le lavage à l&#39;eau stérile, puis versez les graines dans un plat de Petri en plastique contenant 3 mm de papier filtre et laisser sécher sous le capot. Conserver à 4 ° C pendant 2 jours. </li><li> Plaque des graines sur ½ MS Phytagel (concentration de la moitié de milieu de Murashige et Skoog), de 150 mm boîte de Pétri (environ 250-300 graines pour la plaque). </li><li> Cultiver des graines M1 sur la plaque pendant 2 semaines, puis transplanter dans le sol. </li><li> Ramassez les graines M2 à partir de plantes individuelles pour générer des lignes M1 M2 (1000 lignes indépendantes). </li></ol>ove_title &quot;&gt; 2. dépistage confocale des populations M2 et M3 Dans cette section, nous décrivons l&#39;observation des plants avec un microscope confocal ou de fluorescence, comme décrit précédemment 8. <ol><li> Soixante graines de chaque ligne M2 sont cultivés pendant 7 à 10 jours sur des boîtes de Pétri en plastique, ½ MS Phytagel; sur la même plaque sont également cultivés 5 plants EMS-non traité (témoin). </li><li> Cinq à dix cotylédons sont montés avec le côté abaxial vers l&#39;objectif (40X) sur une lame de microscope et clos, avec une lamelle. </li><li> Chaque cotylédon est observé, à partir de la corticale dans la région médiane, en vertu de la fluorescence pour toute modification de la répartition subcellulaire du marqueur organite. </li><li> Plantes positives sont transplantées dans le sol et leurs graines sont récoltées et projeté à nouveau pour confirmer le phénotype mutant dans la génération M3. </li><li> Retirez les au moins trois mutations de fond contaminantes par rétrocroisement fois à un génome de type sauvage peut containing le marqueur fluorescent organite désirée. <ol><li> De la plante mère, aide de ciseaux fins ou des pinces retirer siliques matures, et les fleurs ouvertes. </li><li> Retirez les bourgeons qui sont trop petits à partir du méristème. </li><li> Insérer la pointe d&#39;une paire de pince entre pétales et sépales d&#39;ouvrir un bourgeon de fleur et de supprimer toutes les anthères. </li><li> En utilisant une paire de pince prendre une fleur ouverte maturité de la plante père et se frotter les anthères sur le stigmate de la plante émasculée. </li></ol></li></ol> 3. Cartographie Cette section décrit essentiellement comment mapper une mutation récessive utilisant un protocole modifié de Borevitz 9 qui est plus rapide si on le compare aux méthodes traditionnelles de cartographie 10,11. Cette approche utiliser des tableaux d&#39;oligonucléotides à haute densité avec la capacité de détecter de nombreux polymorphismes métrages simples (SFP) dans un seul essai 12. Utilisation de l&#39;Arabidopsis GeneChip tableau ATH1 est possible ded&#39;analyser environ 24.000 gènes. Un pool d&#39;individus F 2 montrant la mutation est comparé à un bassin de type sauvage plantes F 2 recueillies au sein de la même population en ségrégation. Ensuite, la mutation sera mappé dans la région où la piscine mutant est enrichi pour les allèles mutants génotype et par conséquent dans la même région de la piscine de type sauvage se traduira enrichi pour les allèles des parents de type sauvage 13. <ol><li> L&#39;ADN génomique (3 ug) est extraite de la homozygote mutant Britannique (M3) en utilisant un Qiagen DNeasy Plant Mini Kit et est soumis à Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 séquençage. </li><li> Le mutant homozygote-Britannique (M3) est croisé avec Landsberg erecta pour générer une population de cartographie. </li><li> Le mappage est effectuée sur 70 jusqu&#39;à 100 individus F2 présentant le phénotype aberrante et le même nombre de plantes F2 avec un phénotype de type sauvage. </li><li> Recueillir de chaque plante un disque feuilles (0,60 mm) en utilisant une perforatrice. Ladisque de feuille doivent être collectées à partir des feuilles du même âge pour être sûr d&#39;avoir des quantités similaires de l&#39;ADN. Les échantillons peuvent être traités pour l&#39;extraction de génomique séparément ou en groupes. Dans ce cas, il est possible de prélever des échantillons 5-10 pour chaque tube Eppendorf de sorte que dans la fin, vous aurez moins de tubes eppendorf à partir de laquelle l&#39;ADN génomique doit être extraite. </li><li> MasterPure usine de purification de l&#39;ADN Feuille Kit (Epicentre) est utilisé pour extraire l&#39;ADN génomique. L&#39;ADN génomique obtenu à partir de chaque échantillon est quantifié avec un NanoDrop. </li><li> La même quantité d&#39;ADN génomique à partir de chaque échantillon est ensuite mis en place pour un total de 300 ng (~ 30 pi) d&#39;ADN de plantes; ajouter 60 ul 2.5X solution aléatoire amorces [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM de 2-mercaptoéthanol, 750 ug / ml amorces oligodé (octamères aléatoires)] (Bioprime kit) et 42 pi d&#39;eau (volume final 132 pi). </li><li> ADN dénaturer à&gt; 95 ° C pendant 5 à 10 min. </li><li> Laisser refroidir sur glace. </li><li> Pour chaque denatuADN rouge ajouter 15 pL mélange avec de la biotine 10X dNTP dCTP [1 mM biotine-14-dCTP, 1 mM de dCTP, 2 mM de dATP, 2 mM de dGTP, 2 mM de dTTP dans 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), et compléter avec 3 polymérase de Klenow ul (kit Bioprime). </li><li> Incuber une nuit à 25 ° C. </li><li> Le lendemain, ajouter 15 ul de NaOAc 3 M et 400 ul froide EtOH à 100%; mélange. </li><li> Incuber à -80 ° C pendant 1 heure, puis tourner à 20500 xg pendant 15 min, retirer le surnageant et laver avec 500 ul EtOH 75% froid. </li><li> Centrifuger à 20500 xg pendant 10 min. </li><li> Culots d&#39;ADN sec à 37 ° C pendant 10 min et remettre en suspension dans 100 pi d&#39;eau. </li><li> Utilisez 5 pi pour vérifier le rendement et la qualité sur un gel (Figure 2). </li><li> Envoyer 95 uL de l&#39;étiquetage de réaction pour le type sauvage et mutant d&#39;Arabidopsis pour GeneChip hybridation ATH1 tableau génome. </li><li> Les tableaux sont numérisées et les fichiers. CEL obtenus sont analysés en utilisant le logiciel R ( <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>RG /). </li><li> Installez le logiciel R, puis ouvrez le programme et coller la chaîne suivante: la source (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () Ensuite, appuyez sur la touche retour-ce va installer les paquets standards (Bioconductor <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li> Dans un nouveau dossier sur votre bureau, télécharger à partir du site Web suivant ( <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) les fichiers: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip Le ColLerCEL.zip fichier doit être déballé et les fichiers résultants collé dans votre nouveau dossier. </li><li> Renommez les données obtenues à partir de votre expérience en GeneChip wildtype.CEL et mutant.CEL. </li><li> Copiez maintenant vos données GeneChip (wildtype.CEL etmutant.CEL) dans votre dossier. </li><li> Ouvert R, a) pour Mac: cliquez sur &quot;Divers&quot;, puis cliquez sur &quot;Changer le répertoire de travail.&quot; b) pour PC: cliquez sur &quot;Fichier&quot; puis &quot;Changer le répertoire&quot; </li><li> a) pour Mac: Sélectionnez le dossier contenant les fichiers. Cliquez sur &quot;Espace de travail», «espace de travail du fichier Charger&quot; et sélectionnez ath1V5.RData, b) pour PC: Sélectionnez le dossier contenant les fichiers ci-dessus, cliquez sur «Fichier», puis «espace de travail de charge&quot; et sélectionnez ath1V5.RData. </li><li> ReadCEL.R Ouvrir avec Notepad et copier l&#39;ensemble du texte à R. </li><li> SFP.R Ouvrir avec Notepad et copier l&#39;ensemble du texte à R. </li><li> Map.R Ouvrir avec Notepad et copier l&#39;ensemble du texte à R. </li><li> Dans la fenêtre de la console, vous verrez le message suivant: Chromosome X limite Mb yz Gènes de la recherche à TAIR coller dans ce lien 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; Fin = z </li><li> Copiez et collez le lien dans votre navigateur Internet. Une fenêtre apparaîtra et demander d&#39;ouvrir ou enregistrer le fichier, vous devez sélectionner sauver. Choisir un nom de fichier et joindre l&#39;extension &quot;. Xls&quot;, puis cliquez sur Enregistrer. </li><li> Ouvrez le fichier &quot;. Xls&quot; où vous pouvez trouver les coordonnées de votre mutant (le résultat est représenté graphiquement dans la figure 3). </li><li> Dans la zone cartographiée dans le Illumina assemblé lit du génome mutant identifier des transitions EMS 4 parmi les polymorphismes de nucléotides simples. Compléter le phénotype mutant par transformation avec le gène de type sauvage (s) en utilisant des procédures standard 15. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La figure 1 montre l&#39;approche utilisée pour l&#39;identification d&#39;un mutant de la voie de sécrétion en utilisant la microscopie confocale de dépistage. La figure 2 montre une préparation typique de l&#39;ADN génomique marqué pour l&#39;hybridation tableau. Dans la figure 3, un résultat typique attendue après l&#39;analyse des données obtenues à partir de la baie de GeneChip Arabidopsis Genome ATH1 est présenté. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> Figure 1. Arabidopsis plantes transgéniques exprimant ssGFPHDEL (ER marqueur) (1) ont été cultivées pour produire assez de semences pour l&#39;EMS de traitement (2). Les semences traitées avec EMS ont été ensuite semées pour générer des plantes M1 (3). Chaque plante M1 représente une ligne différente et des semences ont été recueillies séparément de chacun d&#39;eux. Graines M2 ont été étalées sur ½ MS substrat (4), puis criblée de défauts dans la morphologie ER par microscopie confocale (5). Pendant la projection, nous avons trouvé des plantes qui a conservé la morphologie de type sauvage ER (6) et les plantes qui montrent défectueux phénotypes ER (7). Ces plantes ont été cultivées pour obtenir la génération M3 et de confirmer le phénotype (8). L&#39;ADN génomique de la plante M3 a été utilisé pour le séquençage Illumina Solexa (a). La même plantea également été utilisée pour des croisements avec Ler-poids pour obtenir la population de cartographie F2 (b). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> Figure 2. Bioprime réactions de marquage aléatoire (5 pi de 100 ul) ont été chargés sur un gel d&#39;agarose 1%. Lane a est à partir d&#39;un pool de plantes de type sauvage F2, et la voie b est à partir d&#39;un pool de mutants plantes F2. (Marker est de 1 Kb d&#39;ADN en échelle N3232, à partir de l&#39;ONÉ). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> Figure 3. La figure représente un exemple de la cartographie du Col-0 mutation en utilisant Arabidopsis GeneChip ATH1 hybridation génomique Array. La mutation dans cet exemple est situé sur le chromosome 1 délimité, par des barres verticales. Les barres horizontales représentent les seuils de détection.

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Ici, nous décrit une microscopie confocale d&#39;un dépistage pour l&#39;identification des mutants endomembranaire. Cette approche peut être facilement étendu pour d&#39;autres organites de la cellule pour laquelle des marqueurs spécifiques de protéines fluorescentes sont disponibles. L&#39;écran est basée sur l&#39;identification de mutants qui montrent une répartition aberrante du marqueur fluorescent, soit dans l&#39;organite cible ou à organites qui ne sont pas censé contenir le marqueur. Respectivement, ces mutant...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sulfonate éthylméthane </td><td> Sigma </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige Skoog basales moyennes w Gamborg vitamines </td><td> Phyto technolog Laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Sigma </td><td> P8169-1 kg </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Maître pur de feuille d&#39;usine de purification de l&#39;ADN kit </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime système d&#39;étiquetage d&#39;ADN </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Alcool 200 Proof </td><td> Decan laboratoires inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> ATH1 Arabidopsis Gene pucetableau génome </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Tubes Falcon 50 ml </td><td> Corning </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Tubes Eppendorf de 1,5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le papier-filtre 90mm </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Balance analytique </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> na </td></tr><tr><td> Nutation (vague) agitateur </td><td> Heidolph POLYMAX 1040 </td><td> na </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> na </td></tr></tbody></table>

fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l&#39;identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Ce protocole décrit une microscope à fluorescence sur le dépistage des plants d&#39;Arabidopsis et décrit comment cartographier des mutations récessives qui modifient la distribution subcellulaire d&#39;un marqueur fluorescent spécifique marqué dans la voie de sécrétion. Arabidopsis est un puissant modèle biologique pour les études génétiques en raison de sa taille du génome, temps de génération, et la conservation des mécanismes moléculaires chez les royaumes. Le tableau génotypage comme une approche à la carte de la mutation en alternative à la méthode traditionnelle basée sur des marqueurs moléculaires est avantageuse car elle est relativement rapide et peut permettre à la cartographie de plusieurs mutants dans un laps de temps très court. Cette méthode permet l&#39;identification des protéines qui peuvent influer sur l&#39;intégrité de tout organite dans les plantes. Ici, comme un exemple, nous proposons un écran pour cartographier les gènes importants pour l&#39;intégrité du réticulum endoplasmique (RE). Notre approche, toutefois, peut être facilement étendu à d&#39;autres organites des cellules végétales(Voir par exemple 1,2), et représente donc une étape importante vers la compréhension de la base moléculaire qui régit d&#39;autres structures subcellulaires.

Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l&#39;identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l&#39;intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l&#39;identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Ce protocole décrit un criblage de plantules d'Arabidopsis basé sur la microscopie à fluorescence et explique comment cartographier des mutations récessives qui altèrent le...

L'objectif de cette expérience est d'identifier le gène ou les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites végétaux. Cela est réalisé en ajoutant d'abord du méthane sulfonate d'Éthyle comme agent chimique afin d'induire une mutagenèse sur des graines porteuses d'un marqueur fluorescent d'organite. La deuxième étape consiste à récolter les graines provenant de plantes individuelles de la première génération mutagénisée afin de produire des lignées de la génération mutante suivante, M2.Ensuite, les graines mutagénisées d'Eliana sont observées au microscope confocal ou fluorescent afin d'identifier le phénotype organellaire aberrant. La dernière étape consiste à produire la troisième génération mutagénisée et à confirmer la présence du phénotype mutant. En définitive, la mutation récessive peut être cartographiée à l'aide d'outils de séquençage de nouvelle génération.Une fois l'emplacement du gène muté identifié, la transformation à l'aide du gène de type sauvage devrait restaurer le phénotype organellaire anormal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le maintien de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites végétaux. Le traitement des graines d'atop sta par le sulfonate de méthane induit des modifications de la cytosine dans le génome, entraînant une transformation de la cytosine en guanine.Ajout de mutations. Le traitement par EMS est une étape clé de ce protocole pour assurer un taux de mutation optimal au sein des individus M deux. Commencez par obtenir des graines d'Arabidopsis de type sauvage de l'écotype Columbia, qui ont été préalablement modifiées génétiquement pour porter un marqueur fluorescent d'organelle pertinent.Transférez 0,8 gramme ou environ 40 000 graines dans un tube Falcon de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 25 millilitres d'eau distillée et 0,2 % d'Ethel méthane sulfonate. Incubez le mélange pendant 16 heures sur un agitateur mutagène à faible vitesse. Après l'incubation, aspirez le liquide et jetez-le dans un flacon contenant une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire.Pour inactiver l'EMS, ajouter 25 millilitres d'eau dans le tube Falcon contenant les graines. Fermer le tube et le retourner cinq fois pour laver les graines. Une fois que toutes les graines se sont déposées, aspirer l'eau et la jeter dans le flacon de soude à une molaire.Répétez cette étape de lavage jusqu'à 10 fois après le lavage final, puis placez les graines dans une quantité minimale d'eau. Procédez à la stérilisation des graines en ajoutant 25 millilitres d'eau de javel à 10 % et en agitant vigoureusement pendant 30 secondes. Une fois que les graines se sont déposées au fond, versez l'eau de javel et rincez avec 25 millilitres d'eau stérile.Après avoir retiré l'eau stérile, ajoutez 25 millilitres d'éthanol à 70 %. Secouez les tubes pendant 30 secondes et laissez les graines se déposer au fond. Versez l'éthanol et rincez avec 25 millilitres d'eau stérile.Répétez le rinçage avec de l'eau stérile deux fois. Ensuite, versez les graines dans une boîte de Pétri en plastique contenant du papier filtre de trois mm. Laissez les graines sécher sous la hotte après une incubation de deux jours à quatre degrés Celsius.Placer les graines dans une boîte de Pétri de 150 millimètres à raison d'environ 250 à 300 graines par boîte, dans un milieu demi-Magi et Scoog contenant du gel de fighter. En tant qu'agent gélifiant, faire pousser les graines de la génération M1 sur des boîtes pendant deux semaines. Transplanter les semis en terre et laisser les plantes continuer à croître.Après 30 à 45 jours, les plantes atteindront le stade mature où les fuites, désormais visibles, seront clairement apparentes. À ce stade, récoltez deux graines M à partir de chaque plante M1 afin de générer 1 000 lignées M2 indépendantes. Afin d'observer les jeunes plants au microscope confocal ou à fluorescence, faites germer 60 graines provenant de chaque lignée M2 pendant sept à dix jours sur des boîtes de Pétri en plastique en demi-force.Le milieu Moreish et scoog contenant du gel de fighter fait également pousser cinq plantules du témoin non traité par EMS sur la même boîte. Une fois les plantules développées, monter cinq à dix entrées de cos avec le côté scellé ABAC tourné vers l'objectif 40 fois sur une lame de microscope et recouvrir avec un coverslip ; en observation en fluorescence, examiner chaque oléine depuis la région corticale jusqu'à la région médiale afin de détecter une distribution subcellulaire modifiée du marqueur d'organite. Après transplantation des plantes positives en terre et culture des plantules comme décrit précédemment, confirmer que le phénotype mutant est présent à la génération M trois.Éliminez les mutations parasites en effectuant des croisements récurrents au moins trois fois avec un génome de type sauvage portant le marqueur fluorescent organellaire souhaité, comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer le cartographiage, utilisez le kit plant mini cogen DN Easy Z afin d'extraire environ trois microgrammes d'ADN génomique à partir du M trois, qui représente l'ADN Columbia mutant homozygote. Soumettez cet ADN à un séquençage sur l'analyseur génomique Illumina two 14.L'étape suivante consiste à croiser le mutant zago de Colombie avec Las Berger afin de produire la descendance chez laquelle la combinaison recherchée peut apparaître après autopolinisation. La génération double mutante résultante servira finalement de population de cartographie contenant le gène d'intérêt responsable de la mutation. En comparant l'ADN génomique de cette population à celui des plantes de type sauvage, il sera possible d'identifier la localisation de la mutation dans le génome.Après la croissance des plantes F deux, récolter entre 70 et 100 individus F deux présentant le phénotype aberrant et le même nombre de plantes F deux ayant un phénotype sauvage, puis prélever un disque foliaire de chaque plante à l’aide d’un perforateur. Le disque foliaire doit être prélevé sur des feuilles d’âge identique. Afin d’assurer des quantités similaires d’ADN, les échantillons peuvent être traités individuellement ou par groupes pour l’extraction génomique.Dans ce cas, il est possible de prélever cinq à 10 échantillons pour chaque tube orph eend afin de réduire le nombre de tubes à partir desquels l'ADN génomique doit être extrait. Utilisez le kit de purification d'ADN végétal Master Pure pour extraire l'ADN génomique. L'ADN génomique obtenu à partir de chaque échantillon peut ensuite être quantifié à l'aide d'un NanoDrop.Ensuite, combiner des quantités égales d'ADN provenant de chaque échantillon jusqu'à un total de 300 nanogrammes, en gardant séparés les échantillons mutés et de type sauvage pour préparer la réaction de marquage : ajouter 60 microlitres de solution de primers aléatoires 2,5 x et 42 microlitres d'eau. Après avoir dénaturé l'ADN à plus de 95 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes, placer les échantillons sur de la glace pour dénaturer l'ADN. Ajouter 15 microlitres de 10 X DN tps.Mélanger avec du DCTP biotiné et compléter par trois microlitres. Glen polymérase. Incuber les échantillons toute la nuit à 25 degrés Celsius.Le jour suivant, ajouter 15 microlitres d'acétate de sodium à trois molaire et 400 microlitres d'éthanol froid à 100 %. Incuber les échantillons mélangés à moins 80 degrés Celsius pendant une heure après une centrifugation à 20 500 ×g pendant 15 minutes. Laver le culot avec 500 microlitres d'éthanol froid à 75 % après une deuxième centrifugation.Séchez les culots d'ADN à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Remettez en suspension les culots dans 100 microlitres d'eau et utilisez cinq microlitres pour vérifier le rendement et la qualité sur un gel bio. Des réactions de marquage aléatoire ont été chargées sur un gel d'agarose à 1 % à partir d'un pool de plantes F deux de type sauvage et d'un pool de plantes F deux mutantes.Comme étape finale, envoyer 95 microlitres de la réaction de marquage de type sauvage et mutante pour l'hybridation sur puces génétiques Arabidopsis ATH1 Genome Array. Après le balayage par l'effaceur, les fichiers de points CL obtenus sont analysés à l'aide de notre logiciel. Après avoir installé notre logiciel, ouvrez le programme et collez la chaîne Bioconductor figurant dans la procédure écrite.Ensuite, appuyez sur la touche Entrée, ce qui installera les packages BIOCONDUCTOR standard à partir du site web dédié aux puces à ADN, au génotypage et à la cartographie. Téléchargez et décompressez les fichiers listés dans le texte dans un nouveau dossier sur le bureau. Conservez les données obtenues à partir de l'expérience avec la puce à gènes pour le type sauvage C, L, et le mutant C. Copiez maintenant les données de la puce à gènes pour le type sauvage C et le mutant C dans le dossier.Ensuite, ouvrez R sur un PC. Cliquez sur Fichier, puis sur Changer le répertoire. Sélectionnez le dossier contenant les fichiers, cliquez sur Fichier, sur Charger l'espace de travail, puis sélectionnez A one V five R data open read C do R à l'aide du Bloc-notes et copiez tout le texte dans R. Sur un Mac, cliquez sur Mis, puis sur Changer le répertoire de travail.Sélectionnez le dossier contenant les fichiers. Cliquez sur charger l'espace de travail, puis sélectionnez le fichier de données ATH un V cinq R. De la même manière, ouvrez SFP R et MAP R à l'aide d'un éditeur de texte, copiez le texte et collez-le dans la console R.Un message apparaîtra pour rechercher des gènes dans la ressource d'information sur Arabidopsis ou TAIR. Copiez et collez le lien trouvé dans le texte dans le navigateur Internet. Une fenêtre s'affichera et demandera d'ouvrir ou d'enregistrer le fichier.Sélectionnez enregistrer. Choisissez un nom de fichier et ajoutez l'extension. Faites x ls.Ensuite, cliquez sur enregistrer. Voici un résultat typique attendu. Après analyse des données obtenues à partir de la puce à gènes Arabidopsis H un réseau génomique, cette figure représente un exemple de cartographie de la mutation Columbia zéro utilisant la puce à gènes Arabidopsis, une hybridation génomique H un, où les barres horizontales représentent les seuils de détection.La mutation dans cet exemple est située sur le chromosome un, délimité par des barres verticales. Ouvrez le fichier dot XLS pour trouver les coordonnées du mutant dans la région cartographiée. Dans les lectures Illumina assemblées du génome mutant, identifiez les transitions EMS spécifiques parmi les polymorphismes nucléotidiques simples.Une fois maîtrisée, l'approche décrite dans ce protocole peut être utilisée pour cartographier un gène dans un délai relativement court par rapport à la méthode de cartographie classique.

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