Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l'identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l'identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

Le but de cette expérience est d’identifier le ou les gènes responsables de l’intégrité morphologique et fonctionnelle des organites végétaux. Ceci est accompli en ajoutant d’abord du sulfonate de méthane Ethel en tant qu’agent chimique aux graines d’atopie mutagène portant le marqueur fluorescent de l’organite. La deuxième étape consiste à collecter des graines de plantes individuelles de la première génération de mutagènes pour faire pousser des lignées de la génération mutante suivante M deux.

Ensuite, les graines du mutagène a Eliana sont observées à l’aide d’un microscope confocal ou fluorescent pour identifier le phénotype organique aberrant. La dernière étape consiste à générer la troisième génération de mutagène et à confirmer la présence du phénotype mutant. En fin de compte, la mutation récessive peut être cartographiée à l’aide d’outils de séquençage de nouvelle génération.

Une fois que l’emplacement du gène mutant est identifié, la transformation avec le gène de type sauvage devrait restaurer le phénotype organique aberrant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le maintien de l’intégrité morphologique et fonctionnelle des organites végétaux. Les méthanes et le traitement au sulfonate des graines de sta induisent des changements de synchronisation de la cytosine dans le génome, ce qui entraîne une cytosine gwan à la synchronisation.

Ajouter des mutations. Le traitement EMS est une étape clé de ce protocole pour assurer une mutation de rapport parfait à l’intérieur de M deux individus. Pour commencer, obtenez des graines d’Arabidopsis de l’écotype sauvage de Columbia qui ont été préalablement modifiées pour porter un marqueur fluorescent d’organite pertinent.

Transférez 0,8 gramme ou environ 40 000 graines dans un tube de faucon de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 25 millilitres d’eau distillée et 0,2 % de sulfonate de méthane Ethel. Incuber le mélange pendant 16 heures sur un mélangeur en mutation à basse vitesse après l’incubation, aspirer le liquide et le jeter dans un flacon contenant une molaire d’hydroxyde de sodium.

Pour inactiver l’EMS, ajoutez 25 millilitres d’eau dans le tube Falcon contenant les graines. Fermez le tube et retournez-le cinq fois pour laver les graines. Une fois que toutes les graines se sont déposées, aspirez l’eau et jetez-la dans la fiole molaire d’hydroxyde de sodium.

Répétez cette étape de lavage jusqu’à 10 fois après le lavage final, Reese passe les graines dans une quantité minimale d’eau. Procédez à la stérilisation des semences en ajoutant 25 millilitres d’eau de Javel à 10 % et en secouant vigoureusement pendant 30 secondes. Une fois que les graines se déposent au fond, videz l’eau de Javel et rincez avec 25 millilitres d’eau stérile.

Après avoir retiré l’eau stérile, ajoutez 25 millilitres d’éthanol à 70 %. Secouez les tubes pendant 30 secondes et laissez les graines se déposer au fond. Videz l’éthanol et rincez avec 25 millilitres d’eau stérile.

Répétez deux fois le lavage à l’eau stérile. Versez ensuite les graines sur une boîte de Pétri en plastique contenant du papier filtre de trois mm. Laissez les graines sécher sous le capuchon après les avoir incubées pendant deux jours à quatre degrés Celsius.

Placez les graines dans une boîte de Pétri de 150 millimètres à environ 250 à 300 graines par assiette dans un demi-milieu Magi et scoog contenant du gel de combat. En tant qu’agent gélifiant, faites pousser les graines de la génération M1 sur des plaques pendant deux semaines. Repiquez les semis dans le sol et laissez les plantes continuer à pousser.

Après 30 à 45 jours, les plantes atteindront le stade de maturité où elles mûrissent, de sorte que les fuites peuvent être clairement vues. À ce stade, collectez M deux graines sur des plantes M1 individuelles pour générer 1000 M deux lignes indépendantes. Afin d’observer les plantules avec un microscope confocal ou à fluorescence, faites pousser 60 graines de chaque ligne M deux pendant sept à 10 jours sur des boîtes de Pétri en plastique en deux.

Le milieu Moreish et Scoog contenant du gel de combat font également pousser cinq semis du contrôle non traité EMS sur la même plaque. Une fois que les plantules sont développées, montez cinq à 10 cos d’introduction avec le côté du joint ABAC vers la lentille 40 fois sur une lame de microscope et enfermée avec une lamelle sous fluorescence, observez chaque oléine de la région corticale à la région médiale pour une distribution subcellulaire modifiée du marqueur d’organite. Après la transplantation des plantes positives dans le sol et la croissance des semis comme nous venons de le décrire, confirmez que le phénotype mutant est dans la génération M trois.

Éliminer les mutations de fond contaminantes par rétrocroisement au moins trois fois avec un génome de type sauvage contenant le marqueur fluorescent organique souhaité, comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer la cartographie, utilisez le mini kit de plante de cogénération DN Easy Z pour extraire environ trois microgrammes d’ADN génomique de M trois, qui représente l’ADN mutant homozygote de Columbia. Soumettez cet ADN pour le séquençage de l’analyseur de génome Illumina deux 14.

L’étape suivante consiste à croiser le mutant zago Colombie Las Berger pour générer la progéniture suivant l’autopollinisation dans laquelle la combinaison peut se produire. La génération de dents sourdes en résultera et servira finalement de population cartographique contenant le gène d’intérêt, qui est à l’origine de la mutation. En comparant l’ADN génomique de cette population avec l’ADN génomique des plantes de type puits, l’emplacement de la mutation peut être identifié dans le génome.

Après la croissance des deux plantes F, rassemblez entre 70 et 100 F deux individus présentant le phénotype aberrant et le même nombre de F deux plantes avec un phénotype de type sauvage, prélevez un disque foliaire de chaque plante à l’aide d’un poinçon entier. Le disque foliaire doit être prélevé sur des feuilles du même âge. Pour garantir des quantités similaires d’ADN, les échantillons peuvent être traités pour l’extraction génomique séparément ou en groupes.

Dans ce cas, il est possible de collecter cinq à 10 échantillons pour chaque tube d’orph, de sorte qu’il y a moins de tubes à partir desquels l’ADN génomique doit être extrait. Utilisez le kit de purification de l’ADN des feuilles de plantes pour extraire l’ADN génomique. L’ADN génomique obtenu à partir de chaque échantillon peut ensuite être quantifié à l’aide d’un NanoDrop.

Ensuite, en combinant une quantité égale d’ADN de chaque échantillon jusqu’à un total de 300 nanogrammes, en gardant les échantillons de type mutant et sauvage séparés pour effectuer la réaction de marquage en premier, ajoutez 60 microlitres de solution d’amorce aléatoire 2,5 x et 42 microlitres d’eau. Après avoir dénaturé l’ADN à plus de 95 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes, appelez les échantillons sur la glace pour dénaturer l’ADN. Ajouter 15 microlitres de 10 X DN tps.

Mélanger avec de la biotine DCTP et compléter avec trois microlitres. Glen polymérase. Incuber les échantillons pendant la nuit à 25 degrés Celsius.

Le lendemain, ajoutez 15 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires et 400 microlitres d’éthanol à froid. Incuber les échantillons mélangés à moins 80 degrés Celsius pendant une heure, après une centrifugation à 20, 500 fois G pendant 15 minutes. Lavez le granulé avec 500 microlitres de froid, 75 % d’éthanol après un deuxième essorage.

Faites sécher les pastilles d’ADN à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Mettez les granulés en suspension dans 100 microlitres d’eau et utilisez cinq microlitres pour vérifier le rendement et la qualité sur un gel bio. Des réactions de marquage aléatoire primaire ont été chargées sur un gel à 1 % d’aros provenant d’un pool de plantes sauvages de type F deux et d’un pool de plantes mutantes F deux.

Comme dernière étape, envoyez 95 microlitres de type sauvage et de réaction de marquage mutant pour l’hybridation de la puce génétique arabidopsis ou d’un réseau de génomes. Après le balayage de la gomme, les fichiers de points CL obtenus sont analysés à l’aide de notre logiciel. Après avoir installé notre logiciel, ouvrez le programme et collez la chaîne bioconductrice trouvée dans la procédure écrite.

Appuyez ensuite sur la touche retour, ce qui installera les packages BIOCONDUCTOR standard à partir du site Web de matrice, de génotypage et de cartographie. Téléchargez et décompressez les fichiers répertoriés dans le texte dans un nouveau dossier sur le bureau. Conservez les données obtenues à partir de l’expérience de puce génétique dans le type sauvage C, L et le mutant C.Copiez maintenant les données de la puce génétique pour le type sauvage C et le mutant C dans le dossier.

Ensuite, ouvrez R pour un PC. Cliquez sur fichier, puis sur Modifier le répertoire. Sélectionnez le dossier contenant les fichiers, cliquez sur l’espace de travail de chargement de fichiers, puis sélectionnez A un V cinq R données ouvertes, lisez C do R à l’aide du bloc-notes et copiez l’intégralité du texte sur R pour un mac, cliquez sur mis, puis sur Modifier le répertoire de travail.

Sélectionnez le dossier contenant les fichiers. Cliquez sur workspace charger le fichier workspace et sélectionnez ATH one V five R data. De même, ouvrez SFP R et MAP R à l’aide de texte, modifiez et copiez le texte dans R dans la fenêtre de la console.

Un message s’affichera pour rechercher des gènes dans la ressource d’information Arabidopsis ou TAIR. Copiez et collez le lien trouvé dans le texte dans le navigateur Internet. Une fenêtre apparaîtra et vous demandera d’ouvrir ou d’enregistrer le fichier.

Sélectionnez Enregistrer. Choisissez un nom de fichier et joignez-y l’extension. Faites x ls.

Cliquez ensuite sur Enregistrer. Voici un résultat typique attendu. Après avoir analysé les données obtenues à partir de la puce génétique Arabidopsis H one genome array, cette figure représente un exemple de cartographie de la mutation zéro de Columbia à l’aide de la puce génétique Arabidopsis, une hybridation du génome H one, où les barres horizontales représentent les seuils de détection.

La mutation dans cet exemple est localisée sur le chromosome un, délimité par des barres verticales. Ouvrez le fichier point XLS pour trouver la coordonnée du mutant dans la zone cartographiée. Dans les lectures Illumina assemblées du génome mutant, identifiez des transitions EMS spécifiques parmi les polymorphismes nucléotidiques uniques.

Une fois maîtrisée, l’approche décrivant ce protocole peut être utilisée pour cartographier le gène dans un laps de temps de trois courts par rapport à la méthode de cartographie classique.