Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing
15 octobre 2019
Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.
Le profilage du microbiome est la première étape vers la définition du rôle du microbiome dans la santé et la maladie. Ici, nous décrivons une procédure simple pour isoler l’ADN bactérien de haute qualité de l’échantillon fécal préparant la bibliothèque, effectuant l’ARN 16SR et une analyse métagénomique de données de séquençage et de microbiome. Ce protocole aidera les chercheurs nouveaux dans le domaine du microbiome, ainsi que les chercheurs travaillant dans le domaine du microbiome à établir le pipeline de microbiome dans leur laboratoire. Ce protocole peut être étendu pour le profilage du microbiome à partir d’autres spécimens biologiques tels que des échantillons nasaux, oraux ou cutanés de sujets animaux et humains. La cueillette des perles est l’étape la plus importante car toutes les étapes en aval dépendent de l’ADN de haute qualité. L’étanchéité adéquate de la plaque de conserve est importante, car l’étanchéité incomplète pourrait mener à l’oppression de produits amplifiés, ce qui entraînerait des données de séquençage de mauvaise qualité. Pour commencer, stériliser les boîtes de séparateur avec 70% d’éthanol. Placez les souris dans des boîtes de séparateur stérilisées et laissez-les déféquer normalement jusqu’à une heure. Utilisez des forceps stériles pour recueillir les granulés fécaux dans un tube de centrifugeuse micro-centrifugeuse vide préétiqueté de 1,5 millilitre. Enfermez le tube en toute sécurité. Stériliser les forceps avec 70% d’éthanol, suivi d’un lingette germicide jetable, après avoir recueilli des matières fécales de chaque souris. Pesez 200 milligrammes de granulés fécaux dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre, avec des perles de verre de 0,1 millilitre, et placez le tube de perles dans une perle battant homogénéisant et homogénéisez les échantillons pendant 45 secondes à température ambiante, à une vitesse de 4,5 mètres par seconde. Extraire l’ADN selon les instructions du fabricant du kit et électrer l’ADN dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre. Après avoir isolé l’ADN, quantifier l’ADN isolé en chargeant 1 microlitre de l’ADN sur un fluoromètre. Configuration 16S amplification du gène ARN ribosomal PCR1 dans une plaque PCR 96-Well, en utilisant un volume de réaction de 25 microlitres. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 40 nano grammes d’ADN, 13,5 micro litres de mélange d’enzymes polymésexes haute fidélité 2X, contenant du tampon, ainsi que des DNTP dans l’amorce avant et arrière. Scellez correctement la plaque PCR du haut vers le bas le long des quatre bords. Et centrifugeuse à 1000 fois G à 20
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Aperçu
Cet article présente une méthodologie détaillée pour le profilage du microbiome par séquençage métagénomique de l'ARNr 16S. Destiné aux chercheurs débutants comme expérimentés, le protocole offre des informations sur la manière d'obtenir un profilage bactérien précis à l'aide d'outils accessibles.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Analyse du microbiome
- Séquençage métagénomique
- Profiling bactérien
Contexte
- Le rôle du microbiome dans la santé et les maladies
- L'importance de l'isolement d'ADN de haute qualité
- Applications sur divers échantillons biologiques
Méthodes utilisées
- Protocole de séquençage de l'ARNr 16S
- Préparation des échantillons fécaux et extraction de l'ADN
- Utilisation d'outils bioinformatiques librement accessibles pour l'analyse
Résultats principaux
- Isolation réussie d'ADN bactérien de haute qualité
- Préparation robuste de bibliothèques pour le séquençage
- Des instructions détaillées pour aider les chercheurs à établir des pipelines de microbiome
Conclusions
- L'étude propose un protocole complet pour le profilage du microbiome.
- Elle améliore la compréhension des méthodologies du microbiome pertinentes pour la recherche en santé.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
Le profilage du microbiome constitue une étape fondamentale dans la validation de cibles pour les maladies inflammatoires et métaboliques, permettant de formuler des hypothèses sur la contribution microbienne à la pathogenèse. Ce protocole soutient le développement de modèles précliniques en fournissant des données taxonomiques à haute résolution à partir d'échantillons biologiques complexes, facilitant ainsi l'identification des mécanismes et la réduction des risques associés aux interventions ciblant le microbiome. Le flux de travail standardisé renforce la continuité translationnelle, de la découverte à l'identification de candidats thérapeutiques, dans les programmes de traitements modulant le microbiome.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en associant des taxons bactériens spécifiques à des phénotypes de maladie dans des modèles précliniques.
- Valeur opérationnelle : Fournit un profilage reproductible des communautés microbiennes afin d'aider à la priorisation des cibles et à l'élucidation des voies biologiques.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des résultats taxonomiques quantitatifs et à haute résolution, adaptés à la standardisation des tests et aux initiatives de découverte de biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Met en place un pipeline évolutif et réutilisable pour le criblage des modifications du microbiome dans divers types d'échantillons et conditions de traitement.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la caractérisation de systèmes pertinents pour les maladies en permettant le suivi longitudinal des modifications du microbiome en réponse à des candidats thérapeutiques.
- Valeur opérationnelle : Facilite la collaboration pluridisciplinaire grâce à des formats de données normalisés et à des outils d'analyse tels que DADA2 et Phyloseq.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase précoce de découverte en fournissant des données exploitables sur le microbiome qui orientent le choix des cibles et les études mécanistiques avant l'optimisation du composé candidat.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies grâce à une attribution taxonomique précise aux niveaux du genre et de l'espèce.
- Dépistage : Fournit des profils microbiens prêts à l'analyse et reproductibles, permettant une comparaison fiable des conditions expérimentales.
- Analytique : Propose des variantes de séquences quantitatives et des mesures de diversité qui permettent des comparaisons statistiques et la corrélation avec des biomarqueurs.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique en permettant une surveillance cohérente du microbiome tout au long des différentes phases de l'étude.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité standardisée et interdépartementale d'analyse du microbiome applicable à plusieurs domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des interactions hôte-microbe.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité et l'évolutivité grâce à une PCR standardisée en deux étapes et à une analyse bioinformatique normalisée.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en permettant la détection précoce de facteurs de confusion liés au microbiome dans les modèles de maladie.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque en fournissant des informations fondées sur des données concernant la validité des mécanismes ciblant le microbiome.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie moléculaire et en bio-informatique pour la mise en place de la PCR et l'analyse basée sur DADA2.
- Dépend de l'accès à une infrastructure de séquençage de nouvelle génération et à des ressources informatiques pour le traitement métagénomique.
- Exige une standardisation inter-équipes des manipulations d'échantillons, de l'extraction d'ADN et de la préparation des bibliothèques de séquençage.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'extension du protocole à des biospécimens non fécaux, tels que des échantillons buccaux ou cutanés.
- Comprend des limites pratiques liées au biais de la PCR et à la profondeur de séquençage, qui affectent la détection des taxons peu abondants.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
1:25
Extraction of DNA from Fecal Sample
2:29
16S rRNA Gene Amplification (PCR1) and DNA Library Construction (PCR2)
3:57
Clean-up of Indexed PCR (PCR2) and Quantification
6:03
Sequence Analysis
7:49
Results: Quality Profile and Statistical Analysis
9:29
Conclusion
