Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

Le profilage du microbiome est la première étape vers la définition du rôle du microbiome dans la santé et la maladie. Ici, nous décrivons une procédure simple pour isoler l’ADN bactérien de haute qualité de l’échantillon fécal préparant la bibliothèque, effectuant l’ARN 16SR et une analyse métagénomique de données de séquençage et de microbiome. Ce protocole aidera les chercheurs nouveaux dans le domaine du microbiome, ainsi que les chercheurs travaillant dans le domaine du microbiome à établir le pipeline de microbiome dans leur laboratoire. Ce protocole peut être étendu pour le profilage du microbiome à partir d’autres spécimens biologiques tels que des échantillons nasaux, oraux ou cutanés de sujets animaux et humains. La cueillette des perles est l’étape la plus importante car toutes les étapes en aval dépendent de l’ADN de haute qualité. L’étanchéité adéquate de la plaque de conserve est importante, car l’étanchéité incomplète pourrait mener à l’oppression de produits amplifiés, ce qui entraînerait des données de séquençage de mauvaise qualité. Pour commencer, stériliser les boîtes de séparateur avec 70% d’éthanol. Placez les souris dans des boîtes de séparateur stérilisées et laissez-les déféquer normalement jusqu’à une heure. Utilisez des forceps stériles pour recueillir les granulés fécaux dans un tube de centrifugeuse micro-centrifugeuse vide préétiqueté de 1,5 millilitre. Enfermez le tube en toute sécurité. Stériliser les forceps avec 70% d’éthanol, suivi d’un lingette germicide jetable, après avoir recueilli des matières fécales de chaque souris. Pesez 200 milligrammes de granulés fécaux dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre, avec des perles de verre de 0,1 millilitre, et placez le tube de perles dans une perle battant homogénéisant et homogénéisez les échantillons pendant 45 secondes à température ambiante, à une vitesse de 4,5 mètres par seconde. Extraire l’ADN selon les instructions du fabricant du kit et électrer l’ADN dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre. Après avoir isolé l’ADN, quantifier l’ADN isolé en chargeant 1 microlitre de l’ADN sur un fluoromètre. Configuration 16S amplification du gène ARN ribosomal PCR1 dans une plaque PCR 96-Well, en utilisant un volume de réaction de 25 microlitres. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 40 nano grammes d’ADN, 13,5 micro litres de mélange d’enzymes polymésexes haute fidélité 2X, contenant du tampon, ainsi que des DNTP dans l’amorce avant et arrière. Scellez correctement la plaque PCR du haut vers le bas le long des quatre bords. Et centrifugeuse à 1000 fois G à 20