Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l'efficacité synaptique dans le mollusque Aplysie

Le calcium intracellulaire a été impliqué comme une partie importante de plusieurs mécanismes de la plasticité synaptique. Ces idées peuvent être testées en surveillant simultanément les changements dans le calcium et les altérations de l’efficacité synaptique. Nous montrons ici comment cela est accompli en combinant l’imagerie calcique et l’enregistrement intracellulaire.

Nos expériences sont menées avec un ganglion du mollusque Aplysia Cahora. Cette préparation présente un certain nombre d’avantages tels que de gros neurones identifiés, les basses températures qui sont naturelles pour l’apia, des signaux lents et facilitent l’imagerie, mais les techniques générales que nous démontrons sont facilement transférables à d’autres systèmes. Bonjour, je suis Colin Evans dans le laboratoire d’Elizabeth Cropper au Département de neurosciences de Fishburg et au Freedman Brain Institute de la Mount Sinai School of Medicine à New York.

Aujourd’hui, nous allons démontrer l’imagerie simultanée des changements de concentration de calcium intracellulaire et de l’efficacité synaptique dans le ganglion buccal du mollusque Aplysia cahora. Pour détecter le calcium intracellulaire, nous injecterons un neurone pré-synaptique avec le colorant indicateur calcique permanent IMP de la cellule orange calcium. La préparation est ensuite déplacée au microscope et les neurones pré et postsynaptiques sont empalés avec des électrodes pointues.

La stimulation présynaptique répétée entraîne une réponse postsynaptique accrue visible comme une augmentation du potentiel postsynaptique ou de l’amplitude de la PSP. La mesure du signal fluorescent du colorant indicateur de calcium nous permettra de détecter des changements simultanés dans le calcium intracellulaire présynaptique. Pour commencer à anesthésier un animal adulte pesant environ 150 grammes en injectant 75 mils de solution isotonique de chlorure de magnésium, épinglez l’animal anesthésié dans un plat recouvert de cire, puis à l’aide de pinces grossières et de ciseaux, faites une incision dans le pied de l’animal et exposez la masse buccale.

Le ganglion buccal se trouve sur la face ventrale de la masse buccale et se compose de deux hémi-ganglions connectés. Il contient plusieurs centaines de neurones qui, avec les neurones d’autres ganglions, contribuent à la génération et au contrôle du comportement alimentaire de l’animal. Libérez soigneusement le ganglion en coupant tous les nerfs déformés avec des ciseaux fins et retirez-le de l’animal.

Ensuite, épinglez le ganglion libéré à la base d’un plat recouvert d’un protège-sil rempli d’eau de mer artificielle. Le ganglion est enveloppé dans une gaine de tissu conjonctif, qui doit être retirée pour exposer les neurones individuels. Utilisez une pince de vérification, des ciseaux à iris et des précautions extrêmes pour couper cette gaine.

Pour éviter d’endommager les neurones, stabilisez le ganglion de la gaine avec des broches d’environ 15 minutes car tout mouvement sera problématique pendant l’imagerie. Pour préparer des électrodes tranchantes pour l’enregistrement intracellulaire et l’injection de colorant, tirez le tube capillaire avec un extracteur de micro-électrodes. Nous utilisons du verre de silicate de boa à filament mince d’un diamètre extérieur d’un millimètre.

Les électrodes d’enregistrement doivent avoir une résistance d’environ 10 méga lorsqu’elles sont remplies d’acétate de potassium à trois molaires, et nous ajustons donc l’extracteur en conséquence pour remplir les électrodes D. Trempez l’arrière de l’électrode tirée dans une solution de 10 millimolaires de l’action capillaire du colorant orange de calcium le long du filament de verre à l’intérieur de l’électrode pour aspirer le colorant dans la pointe, puis remplissez l’électrode avec du chlorure de potassium de 200 millimolaires pour assurer un bon contact électrique. Nous utilisons un Bela construit sur mesure pour améliorer les propriétés de l’électrode et abaisser la résistance de l’électrode d’enregistrement à environ cinq méga.

L’électrode est maintenue à un angle de 45 degrés dans un flux d’une suspension d’oxyde d’aluminium. Le mélange de chlorure de sodium dans la suspension et la connexion d’un ome-mètre permettent de surveiller la résistance de l’électrode. Au cours du processus de biseautage, nous transférons la parabole contenant les ganglions de boucle trompés dans un appareil d’électrophysiologie et localisons les neurones d’intérêt en les empalant avec des électrodes et en vérifiant leur identité.

Pour préparer le neurone à l’imagerie calcique, nous insérons d’abord une électrode remplie de colorant dans le soma cellulaire et chargeons l’électro du colorant théoriquement avec 30 minutes d’impulsions hyperpolarisantes de 15 nanoampères. Au fur et à mesure que l’orange de calcium D pénètre dans la cellule, le SOR acquiert une légère couleur rose. Nous rétractons ensuite soigneusement les électrodes d’enregistrement et laissons la préparation reposer pendant au moins 30 minutes pour permettre au colorant de se diffuser dans les processus fins du neurone.

Ensuite, transférez le plat avec la préparation dans un microscope fluorescent. Nous utilisons une lentille d’immersion dans l’eau 10 fois NA 0,3 sur un microscope à platine fixe vertical, qui fait la mise au point en déplaçant l’objectif et non la platine. Cela facilite le montage des manipulateurs.

Pour les électrodes d’enregistrement, sélectionnez un bloc de filtre approprié. Un bloc de trois filtres SI fournira les filtres d’excitation et d’émission corrects pour l’orange de calcium, ajustera les paramètres de la caméra et l’intensité de l’éclairage avec des filtres à densité neutre et l’ouverture de champ. Plus de lumière entraînera moins de bruit, mais peut potentiellement blanchir la préparation.

La caméra CCD cool snap peut capturer un champ de 500 x 300 pixels à une fréquence d’images d’environ 30 images par seconde, et un bon rapport signal/bruit. Minimisez l’éclairage des neurones en gardant l’obturateur des sources lumineuses fermé dans la mesure du possible. Dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez les régions d’intérêt ou R ois.

Ces régions définissent l’endroit où le logiciel prendra les mesures d’intensité. Nous imaginons généralement les branches primaires, secondaires et tertiaires du neurone présynaptique. Placez un retour sur investissement supplémentaire à côté du neurone difi pour obtenir une valeur d’arrière-plan qui est ensuite soustraite de tous les autres points de données.

Des électrodes d’enregistrement intracellulaires dans les neurones pré et post-synaptiques sont utilisées pour induire et surveiller la transmission synaptique. Vous pouvez assurer la synchronisation entre l’acquisition de données électrophysiologiques et l’acquisition de données d’imagerie si vous utilisez le signal de déclenchement de sortie de cadre de la caméra pour démarrer le logiciel d’acquisition de données. Une autre façon d’assurer la synchronisation consiste à monter une LED à l’intérieur du port de la caméra.

Cette LED est brièvement allumée au début de la session d’enregistrement, et fournit ainsi une marque de synchronisation. Au cours d’une expérience typique, vous déclenchez des potentiels d’action dans le neurone présynaptique en injectant de brèves impulsions de courant. Dans cet exemple, nous montrons une rafale de pointes et des augmentations correspondantes du signal calcique pour tester des hypothèses spécifiques.

Le signal calcique peut être manipulé et les effets sur la transmission synaptique déterminés. Par exemple, des médicaments tels que le chélateur de calcium EGTA peuvent être injectés présynaptiques ou appliqués par le système de perfusion. Les données sont analysées en les exportant du logiciel d’imagerie dans un fichier texte, puis dans le logiciel qui a été utilisé pour acquérir les données électrophysiologiques, qui dans notre cas est le pic deux de Cambridge Electronic Design.

Nous utilisons un script écrit personnalisé pour tracer les valeurs d’intensité du retour sur investissement et les changements correspondants dans le potentiel membranaire, quantifier les changements dans le signal calcique en soustrayant le signal de fond obtenu du retour sur investissement de fond et en calculant le changement relatif à l’aide de l’équation illustrée. F zéro est la fluorescence juste avant la stimulation, et F est la fluorescence pendant la stimulation. Nous montrons ici les résultats d’une expérience dans laquelle nous avons imagé des changements de fluorescence calcique dans le neurone B 21 identifié.

La région que nous avons imagée est indiquée en A, en B un, nous avons induit une rafale de pointes en B 21, qui a induit des potentiels postsynaptiques en B huit et un changement dans le signal calcique. B deux montre l’effet de l’injection du chélateur de calcium. Les pics EGTA en B 21 n’induisent plus d’augmentations généralisées de la fluorescence calcique et l’amplitude potentielle post-synaptique est diminuée.

En conclusion, nous avons démontré des techniques qui peuvent être utilisées pour surveiller simultanément la concentration de calcium intracellulaire et évaluer l’efficacité de la transmission synaptique. Ces techniques ne nécessitent qu’un équipement modeste par rapport à la plupart des images fonctionnelles et sont faciles et rapides à apprendre.