De base

Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment synchroniser C. elegans au stade larvaire L1. Il s'agit d'une méthode simple, mais très courante, qui s'avérera donc très utile. Vous êtes encore débutant.

Si vous êtes un expert en langage C, vous pourriez trouver ici quelques conseils pour optimiser ce protocole. La base de la synchronisation des vers repose sur la résistance relative des larves et des embryons à la solution d'hypochlorite alcalin par rapport aux adultes. Ces vers adultes, contenant de nombreux embryons, sont incubés avec une solution d'hypochlorite afin qu'ils soient tués, ne laissant que les embryons.

La seconde partie de la synchronisation est obtenue par l'absence de nourriture, de sorte que, même si les embryons éclosent à des moments différents, ils ne se développent pas au-delà du stade L un. La première étape pour démarrer un protocole de mise en place rapide consiste à disposer de vers au stade œuf pondu, avec plusieurs œufs répartis sur la boîte. Utilisez du M neuf pour récupérer les adultes afin de procéder à la récolte.

En outre, les embryons qui ont déjà atteint la surface de la boîte peuvent être prélevés à l’aide d’un matériau souple, tel qu’un morceau de film radiographique, puis les bactéries sont éliminées par plusieurs lavages avec du milieu M9. Généralement, deux ou trois lavages suffisent. Une fois les vers lavés, il est temps d’ajouter la solution de blanchiment fraîchement préparée selon nos préférences.

Contrôlez la durée d'incubation tout en agitant le tube. Vous pouvez surveiller l'émergence des adultes au microscope stéréoscopique. Une fois que presque aucune carcasse n'est visible, arrêtez la réaction en ajoutant du M neuf jusqu'à ce que le tube soit complètement rempli.

Pour terminer le protocole, effectuez au moins trois lavages. Les œufs M nine sont incubés avec agitation continue toute la nuit dans du tampon M nine, ce qui permet l’éclosion mais empêche tout développement ultérieur des vers. Bien que la synchronisation puisse être réalisée à n’importe quelle température comprise entre 15 et 25 degrés, une température de 15 °C est recommandée.

Étant donné que le développement est plus lent, comme nous l'avons mentionné, C. elegans traverse quatre stades larvaires avant d'atteindre l'âge adulte, une durée qui dépend de la température à laquelle l'organisme est élevé. Bien que C. elegans tolère des températures de croissance comprises entre 15 et 25 degrés, le taux de croissance est plus élevé.

La température supérieure ici, vous pouvez voir qu'après 24 heures, les stades auxquels se trouvent les vers sont différents. À 15 et 25 degrés, après 48 heures à 25 degrés, nous observons déjà des embryons. Toutefois, il faut attendre plus de 80 heures pour voir des embryons à la surface des boîtes.

Avec des vers cultivés à 15 degrés afin d'obtenir des résultats optimaux, plusieurs facteurs doivent être pris en compte lors de la réalisation d'une expérience de blitzing. Il est également important de reconnaître les vers qui se trouvent au stade souhaité pour la réalisation de l'expérience. Nous allons donc vous montrer comment distinguer les stades, soit par la taille, soit par microscopie à contraste interférentiel, soit par coloration.

Dans ce graphique, vous pouvez observer le taux de croissance des vers de GaN en fonction de la température, comme nous l'avons indiqué, leur croissance étant beaucoup plus rapide à 25 degrés. Il existe une corrélation entre la taille des animaux et leur développement chez les éléments marins. À l'aide du logiciel approprié, les animaux peuvent être mesurés puis classés dans le stade de développement adéquat.

D'après ce graphique, toutefois, le site constitue un marqueur grossier des stades de développement. Un échelonnement plus fiable peut être obtenu en observant certaines parties des mers, des structures anatomiques qui peuvent être utilisées et reconnues soit par contraste interférentiel différentiel, soit par microscopie à contraste de phase ou coloration DPI. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé ce protocole pour synchroniser des vers destinés à différentes expériences, comme les micro-œufs en coloration simple, la visualisation in situ et la coloration up.

En outre, ce protocole vous aide également à éliminer les contaminations. Un microscope à contraste d'interférence différentielle ou un microscope nomarski est utilisé pour améliorer le contraste. Sur des échantillons transparents non colorés, les animaux sont montés vivants sur une base d'agarose à 2 %, qui peut être préparée au préalable et conservée à quatre degrés selon les besoins.

Il peut être fondu et maintenu à 65 degrés. Une fois que l'agarose est fondue, appliquez un morceau de ruban adhésif sur une lame et placez-les de chaque côté d'une troisième lame. Prélevez délicatement un peu d'agarose et déposez une goutte sur la lame sans ruban adhésif.

Couvrir les agros avec une autre lame placée transversalement. Une fois que le chemin est solidifié, séparer les deux lames en faisant glisser délicatement l'une sur l'autre. Le tampon adhérera à l'une d'elles.

Ajoutez un peu d'Amazon sur le tampon pour maintenir les vers immobilisés. Prélevez quelques vers au microscope stéréoscopique et transférez-les dans la goutte de lele. Évitez d'endommager le trajet.

Prenez une lame de couverture et ajoutez un peu de vernis à ongles sur les bords. Placez soigneusement la lame de couverture sur cette lame en évitant la formation de bulles. Le montage peut être observé immédiatement au microscope. L'une des caractéristiques anatomiques les plus faciles à identifier chez C. elegans est l'alvea.

Par exemple, un aava ayant une forme de trois de Noël est caractéristique du stade L quatre. Des informations détaillées sur l'anatomie de c elgan au cours du développement peuvent être obtenues sur www.orla.org. La coloration au tapis est une procédure courante pour identifier les cellules individuelles.

La fixation avec le tunnel est une méthode rapide pour fixer les vers. Pour la coloration dappy, ajoutez d'abord une goutte de tampon M nine à la surface d'une lame de microscope. Prélevez quelques vers directement depuis la boîte et transférez-les dans la goutte de M nine.

Éliminez l'excès de milieu M9 soit avec une pipette, soit avec un mouchoir en papier. Ajoutez un tunnel aux vers. Répétez l'opération.

Une fois que la première goutte est sèche, ajoutez un milieu de montage contenant de l'API et laissez reposer avant de placer la préparation au microscope. Le développement du go peut être facilement observé dans un stent chaud avec de l'api.