Méthodes normalisées pour mesurer l’induction de la réponse de choc thermique à Caenorhabditis elegans

Ici, des protocoles standardisés sont présentés pour évaluer l’induction de la réponse de choc thermique (HSR) à Caenorhabditis elegans en utilisant RT-qPCR au niveau moléculaire, les journalistes fluorescents au niveau cellulaire, et la thermorecovery au niveau de l’organisme.

La réponse aux chocs thermiques est une voie essentielle de réponse au stress cellulaire qui maintient la protéostasie cytoplasmique et peut être caractérisée aux niveaux moléculaire, cellulaire et organismal dans l’elegans de mer. Nous présentons une série de protocoles normalisés et de meilleures pratiques qui génèrent une induction robuste de la réponse aux chocs thermiques chez les elegans marins afin d’améliorer la reproductibilité dans le champ de réponse aux chocs thermiques. Nous montrons que la tolérance thermique, un essai d’organisme couramment utilisé n’est pas dépendant de la réponse de choc thermique.

Au lieu de cela, nous recommandons d’utiliser la récupération thermique, un essai d’organisme qui dépend de la réponse aux chocs thermiques. La réponse aux chocs thermiques s’atténue avec le début de la ponte. Par conséquent, le moment du développement est une variable critique qui doit être prise en compte dans les expériences de réponse aux chocs thermiques.

Commencez par créer une population de vers synchronisés. Utilisez un pic de fil de platine pour transférer environ 10 vers adultes gravid dans une assiette fraîche. Assurez-vous d’enlever les œufs ou les larves qui pourraient avoir été transférés avec les adultes.

Laissez les vers pondre des œufs pendant une heure, puis retirez les adultes de l’assiette. Maintenir les vers synchronisés à 20 degrés Celsius jusqu’au stade de développement souhaité, en tenant compte du fait que le moment du développement varie selon chaque souche et la température à laquelle les vers sont élevés. Lorsque les vers sont prêts pour le choc thermique, envelopper les plaques avec du film de paraffine et utiliser un support de tube à essai avec un poids de plomb pour les submerger dans un bain d’eau en circulation à 33 degrés Celsius pendant une heure.

Récupérer les assiettes du bain d’eau et les sécher avec une serviette en papier. Retirer le film de paraffine et permettre aux vers de récupérer à 20 degrés Celsius pendant six à 24 heures, ce qui sera un temps suffisant pour la synthèse GFP. Pour préparer des diapositives pour l’imagerie, placez une diapositive de microscope entre deux autres diapositives qui ont une bande de ruban adhésif de laboratoire sur eux.

Faire une solution agarose de 3% dans l’eau et la chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que les agaroses se dissolvent. Ensuite, utilisez une pipette d’un millilitre pour placer environ 150 microlitres de l’agarose au centre de la glissière. Couvrez immédiatement la diapositive d’une glissière vierge, en la plaçant perpendiculairement de sorte qu’elle repose sur le ruban de laboratoire, puis retirez-la soigneusement.

Pour immobiliser les vers, ajouter une petite goutte d’un levamisole millimolaire, un tampon M9, au centre de la garniture d’agarose et transférer 10 vers dans la goutte à l’aide d’un pic de fil de platine. En option, étendre la levamisole à l’extérieur de la garniture d’agarose et aligner les vers avec la pioche quand ils deviennent paralysés. Couvrez les vers d’un glissement de couverture et imagez-les dès que possible à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Pour effectuer un essai thermorecovery, synchronisez les vers et maintenez-les à 20 degrés Celsius jusqu’au stade de développement désiré. Puis la chaleur les choque pendant six heures. Retirer les plaques du bain d’eau et leur permettre de récupérer à 20 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après la récupération, comptez le nombre de vers qui peuvent immédiatement craw loin après stimulation mécanique sans mouvement saccadé ou paralysie. Pour visualiser l’induction de réponse de choc thermique au niveau cellulaire, deux souches fluorescentes d’elegans de mer de reporter fluorescent ont été analysées. Dans les échantillons de contrôle négatifs sans choc thermique, le journaliste hsp-16.2 a montré la fluorescence automatique normale, mais le journaliste de hsp-70 a eu la fluorescence constitutive dans le muscle anal de dépresseur.

Après une heure de choc thermique, la fluorescence robuste a été observée dans les deux journalistes quand RNAi a été employé pour abattre hsf-1 avant de mesurer l’induction de journaliste. La fluorescence des deux souches a été sévèrement réduite, ce qui indique que ces reporters sont dépendants du hsf-1. Pour quantifier l’induction de la réponse de choc thermique au niveau moléculaire, deux protéines indigènes de choc thermique ont été mesurées avec rt PCR clé.

On a constaté qu’un choc thermique d’une heure 33 degrés Celsius entraîne une augmentation de plus de 2000 fois de l’expression relative des deux gènes de choc thermique. Un essai thermorecovery a démontré que l’exposition à un choc thermique de six heures a mené à une diminution de 20% des vers avec le mouvement normal après une récupération de 48 heures. Knockdown de hsf-1 a causé une diminution dramatique du mouvement normal, avec plus de 95% des vers montrant le mouvement saccadé ou la paralysie après avoir été poussé.

En revanche, le renversement du hsf-1 n’a pas eu d’effet significatif sur les résultats d’un test de tolérance thermo, dans lequel les vers sont exposés à une température continue de 35 degrés Celsius et le pourcentage de vers vivants est mesuré à différents moments. Lors de l’exécution de cette technique pour la première fois, assurez-vous d’envelopper les plaques avec du film de paraffine deux fois pour empêcher l’eau d’entrer dans les plaques et ruiner l’expérience. Les analyses moléculaires peuvent être étendues aux analyses génomiques à l’aide de l’ARN-seq.

D’autres analyses de l’organisme affectées par la réponse aux chocs thermiques peuvent être incluses, comme la durée de vie. La capacité unique de corréler les analyses moléculaires, cellulaires et de réponse aux chocs thermiques dans les elegans marins s’est avérée inestimable pour la compréhension du rôle de cette voie dans le développement et la maladie.