ADN vecteur basé sur l'interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la fonction d'un gène au moyen de l'interférence ARN basée sur un vecteur d'ADN. Cela est réalisé en concevant et en générant d'abord des constructions ARNsh (S-H-R-N-A) ciblant des gènes spécifiques. La deuxième étape consiste à produire un lentivirus portant la cassette d'expression d'ARNsh.

Ensuite, des lignées cellulaires stables sont générées en infectant les cellules avec le lentivirus, et les cellules infectées par le lentivirus sont utilisées dans divers tests in vitro et in vivo afin de déterminer les effets de l'inhibition du gène d'intérêt. En fin de compte, selon les tests utilisés, les résultats peuvent montrer des modifications de la tumorigénicité des cellules résultant de la diminution de l'expression du gène, grâce à des essais in vitro de prolifération, de migration et d'invasion, ainsi que des modèles in vivo de formation de xénogreffes. La procédure sera démontrée par Daniel Stowell, ma Juan, et Daniel est étudiant diplômé dans mon laboratoire. Ma Ma est technicienne.

Chang est chercheur postdoctoral. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, comme de savoir si un gène spécifique joue un rôle dans le développement et la progression du cancer, et quels aspects de ces processus il pourrait être important. Pour commencer, concevoir et commander les oligonucléotides selon les critères décrits : Anil, les deux oligos complémentaires inverses qui contiennent la séquence cible de 20 à 23 nucléotides dans le gène cible.

Ils formeront des sites eco R un et Hindi trois aux deux extrémités. Après avoir été recuit, un autre oligonucléotide contient une séquence complémentaire inverse de la séquence cible, et sa terminaison trois prime s'hybride à la terminaison trois prime du promoteur H un ou U six à l'aide d'un amorce en amont.

Utilisez une PCR pour produire un fragment possédant des sites BAM H1 et HindIII aux deux extrémités. Pendant ce temps, digérez le vecteur lentiviral et le fragment de PCR. Ensuite, réalisez une réaction de ligature à trois fragments entre le vecteur, le fragment de PCR et les oligonucléotides Anil.

Dans un rapport molaire de un à dix à dix, le vecteur résultant produira l'ARNh d'intérêt avec une séquence Hindi trois dans la région en boucle. Si un vecteur inductible est utilisé, la production d'ARNh dépendra de la présence d'une molécule inductrice telle que la doxycycline pour le système Tet ON. Transformez maintenant des cellules compétentes E. coli DH5α à haute efficacité à l'aide du produit ligaturé et identifiez les vecteurs positifs par un criblage PCR basé sur les colonies.

Amplifiez un produit qui englobe le site de ligature du vecteur et du promoteur inductible. Préparez l'ADN plasmidique à partir des colonies positives à l'aide d'un kit commercial. Ensuite, confirmez la présence de l'insert par digestion avec BAM H one et ECO R one et par électrophorèse sur gel d'agarose de l'ADN.

En outre, séquencer la région contenant le promoteur et le S-H-R-N-A en utilisant le nucléotide LIGA P cinq. À l’aide d’un kit MIDI ou maxi de préparation sans endotoxine, préparer l’ADN de lentivirus portant la cassette d’expression HRNA. Déterminer la concentration en ADN en mesurant l’absorption de la lumière à 260 nanomètres et vérifier la pureté de l’ADN en s’assurant que le rapport d’absorption lumineuse entre 260 et 280 nanomètres se situe entre 1,8 et 2,0.

Enfin, faire migrer le plasmide de lentivirus sur un gel d'agarose afin de s'assurer qu'il est en forme superhélicoïdale. Avant la transfection, préparer celle-ci en ajoutant lentement 0,9 millilitre de solution A à 0,9 millilitre de solution B, tout en faisant barboter de l'air dans la solution B à l'aide d'une pipette. Incuber ensuite une trentaine de minutes à température ambiante. Puis, ajouter lentement 0,6 millilitre du mélange sur trois plaques différentes de 10 centimètres contenant des cellules HEK 293T.

Ensuite, remettre les cellules dans l’incubateur quatre à six heures plus tard. Remplacer le milieu par sept millilitres de milieu DMEM complet. Après 24 heures, ajouter cinq millilitres supplémentaires de milieu, puis, après encore 24 heures, récupérer le milieu contenant le lentivirus.

Faire centrifuger le milieu récolté à 1500 tr/min à température ambiante pendant 10 minutes. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre. Centrifuger le milieu filtrant contenant le lentivirus par ultracentrifugation.

Versez le surnageant dans un contenant de déchets contenant de l'eau de Javel à 5 %. Resuspendez le culot de lentivirus dans un demi-millilitre à un millilitre de PBS 1X froid. Ensuite, divisez la solution de lentivirus en aliquotes de 50 à 100 microlitres pour une conservation à moins 80 degrés Celsius.

Enfin, déterminez le titre du lentivirus à l'aide d'une technique fiable. Typiquement, une boîte de culture de 10 centimètres produira de 50 à 100 millions d'unités infectieuses avant de procéder à l'infection cellulaire. Déterminez le MOI du titre lentiviral à l'aide d'un kit ou de la R-T-P-C-R pour cette procédure.

Un IIM inférieur à quatre est recommandé. Commencez par ensemencer les cellules à infecter dans une plaque de six puits à une confluence de 30 à 40 % et cultivez-les pendant une nuit. Le lendemain.

Remplacer le milieu par un millilitre de milieu frais contenant de la polybrain ou de la protamine. Ensuite, ajouter entre un et deux millions d'UI d'un lentivirus contenant un marqueur fluorescent ou un marqueur antibiotique.

Agiter lentement la plaque pendant 10 secondes pour mélanger, puis incuber pendant six heures. Après six heures, remplacer le milieu par un milieu complet normal et faire proliférer les cellules pendant deux jours. Le milieu ne doit pas contenir d'antibiotiques ni d'inducteurs, quel que soit le lentivirus utilisé, après deux jours.

Ajoutez l'antibiotique approprié si le lentivirus contient un marqueur antibiotique. De même, ajoutez l'inducteur à la moitié des cultures si le lentivirus est inductible. Après avoir cultivé les cellules pendant deux ou trois jours supplémentaires avec les antibiotiques et les inducteurs, effectuez une analyse western blot pour tester l'extinction du gène cible avant les greffes xénogreffes yeux trypsine.

Les cellules provenant de grandes boîtes de culture sont resuspendues dans le milieu d'origine contenant 50 % de Matrigel. Il est essentiel de maintenir les cellules cancéreuses en suspension dans du Matrigel à 50 % et de garder la seringue sur de la glace. Sinon, il existe un risque que le Matrigel durcisse et que l'infection doive faire l'objet d'une attention particulière.

Préparez le site chirurgical en le nettoyant soigneusement avec de l'éthanol à 70 % et réalisez l'anesthésie avec une excellente ventilation et un filtre de captage d'isoflurane fixé à la chambre d'induction. Anesthésiez des souris nues thymiques à l'aide d'isoflurane à 2 % mélangé à 1,5 % d'oxygène, trois à cinq minutes avant l'inoculation cellulaire. Ensuite, maintenez l'anesthésie à l'aide d'isoflurane à 2 % mélangé à de l'oxygène par un embout nasal.

Placer la souris sur un tapis chauffant réglé à 30 degrés Celsius. Charger les cellules dans des seringues équipées d'aiguilles de calibre 25 et demi pour des injections sous-cutanées, ou d'aiguilles de calibre 28 à 30 pour des injections orthotopiques. Cinq minutes après l'induction de l'anesthésie, injecter de un à dix millions de cellules en bolus de 200 microlitres, en un ou deux sites.

Le nombre de cellules dépend du caractère malin ou de l'agressivité des cellules cancéreuses. Pour les vecteurs activement constitutifs, utilisez deux groupes de souris injectées avec des cellules exprimant soit le gène cible S-H-R-N-A, soit un S-H-R-N-A désordonné sur des vecteurs. Utilisez les mêmes deux groupes et divisez-les chacun en sous-groupes recevant ou non un inducteur dans leur eau.

Remplacez les litières contenant de l'eau deux fois par semaine. Surveillez le volume des tumeurs de façon hebdomadaire ou bimensuelle à l'aide d'un C. Veillez à ce que le volume tumoral n'excède pas la limite institutionnelle ou A CUC, et euthanasiez tout animal présentant une ulcération étendue, une nécrose, une infection évidente, un saignement incontrôlé ou une maladie à un stade terminal. Pour surveiller la croissance tumorale et les métastases à l'aide d'un marqueur bioluminescent, désinfectez la zone de travail et anesthésiez les souris dans une chambre d'imagerie à l'aide d'une anesthésie gazeuse.

Tout d'abord, effectuez une exposition de deux à cinq minutes et vérifiez l'intensité du signal, puis ajustez en conséquence. Si la taille de la tumeur dépasse 1000 millimètres cubes ou la limite maximale établie par l'institution, euthanasiez l'animal au moment du sacrifice, documentez la taille de la tumeur et conservez-la pour des analyses ultérieures. Ce protocole a été utilisé pour étudier les effets de l'extinction de Y one sur la formation de tumeurs xénogreffées par des cellules humaines de carcinome adénocarcinomateux du sein exprimant la luciférase, implantées chez des souris nues athymiques.

La séquence cible S-H-R-N-A de la protéine humaine YY1 et une séquence contrôle S-H-R-N-A aléatoire, qui ne présentait aucune similarité significative avec tout transcrit humain connu, ont toutes deux été testées. En conséquence, deux vecteurs rétroviraux ont été construits et utilisés pour produire deux lentivirus. Les deux ont été utilisés pour infecter deux populations cellulaires différentes, et des populations cellulaires polyclonales ont été obtenues.

Après la sélection par la puromycine, une analyse sanguine par immunotransfert a confirmé l'induction par le DS d'un abaissement de YY1 dans ces lignées cellulaires infectées. Ensuite, la population cellulaire polyclonale du clone trois, infectée par le S-H-R-N-A inductible de YY1 et le S-H-R-N-A contrôle.

Les lentivirus ont été utilisés pour tester les effets de l'épuisement de YY one sur l'invasion. Nous avons observé que l'épuisement de YY one réduisait l'invasivité des cellules. Une analyse sanguine par western blot a confirmé que les docs induisaient le silençage de YY one dans les cellules portant l'indu YY one S-H-R-N-A, tandis que les cellules contenant le contrôle.

S-H-R-N-A n'a pas montré cet effet. Ces cellules ont ensuite été utilisées dans une étude de modèle murin de xénogreffe comparée aux groupes témoins indu, YY un S-H-R-N-A. Les souris implantées et fournies avec la dose contenant de l'eau ont montré une formation tumorale significativement réduite, observée par bioluminescence et mesurée par le poids des tumeurs, comme prévu. L'inhibition de YY un dans ces tumeurs de xénogreffe a été facilement confirmée par immunotransfert (western blot).

Les études n'oublient pas que le travail avec le lentivirus peut être extrêmement dangereux selon les considérations de sécurité du NIHB ; des procédures de confinement de niveau de sécurité B2 renforcé sont requises pour tous les environnements de laboratoire.