Name: ADN vecteur basé sur linterférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Apprenez à utiliser l'interférence ARN basée sur vecteur ADN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer. Cette méthode permet un silence génique inductible et à long terme in vivo.

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Ce travail a été soutenu en partie par les subventions de recherche (116 403 Scholar-RSG-09-082-01-MGO) de l&#39;American Cancer Society et les fonds intra-muros de la Wake Forest University Health Sciences à GS. DBS a été soutenue par le NCI formation 5T32CA079448 subvention.

<ol><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncog%22%5BJournal%5D)">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li>
<li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li>
<li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li>
<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+%28MOI%29+for+predicting+gene+transfer+events%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Vaccines+Ther%22%5BJournal%5D)">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6(2004).</li>
<li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
<li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce protocole décrit une méthode pour abattre un gène à l&#39;aide shRNA et de visualiser son effet biologique en utilisant l&#39;imagerie bioluminescente de la croissance des cellules tumorales in vivo. Le site cible d&#39;un shRNA ne doit contenir aucun des trois sites de restriction (BamHI, HindIII et EcoRI) utilisé pour sous-clonage. Dans un scénario rare lorsque l&#39;un quelconque de ces sites est présent, une enzyme de restriction supplémentaire peut être utilisée pour la remplacer dans la génération de l...

En plus de l&#39;équipement de laboratoire couramment utilisé pour l&#39;ARN et analyses de protéines et de la culture cellulaire, les matériaux et réactifs suivants sont requis pour ce protocole. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td></tr><tr><td> Prévention des risques biotechnologiques approprié pour le niveau de biosécurité 2 de confinement du Cabinet </td></tr><tr><td> PCR thermocycleur </td></tr><tr><td> Ultracentrifugeuse </td></tr><tr><td> Anesthésie-induction de chambre avec des charognards isoflurane </td></tr><tr><td> Pied à coulisse numérique </td></tr><tr><td> IVIS système d&#39;imagerie </td></tr><tr><td> Très compétentes DH5a E. coli </td></tr><tr><td> Enzymes de restriction EcoRI, BamHI, HindIII et </td></tr><tr><td> ADN ligase T4 </td></tr><tr><td> Troisième génération plasmides lentivirus emballage VSV-G, pRSV-Rev et pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Liste des matériaux

adn vecteur basé sur l&#39;interférence arn pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

L&#39;interférence ARN (RNAi) inhibe l&#39;expression des gènes par ARN messagers cibles dégradant spécifiquement. Depuis la découverte de l&#39;interférence double-brin d&#39;ARN (siRNA) dans le gène silencieux 1, l&#39;ARNi est devenu un puissant outil de recherche dans les études des fonctions des gènes. Par rapport à délétion génétique, gene silencing RNAi-médiation possède de nombreux avantages, tels que la facilité avec laquelle elle est effectuée et son aptitude à la plupart des lignes de cellules. De multiples études ont démontré les applications de la technologie ARNi dans la recherche contre le cancer. En particulier, le développement de l&#39;ADN à base de vecteurs technologie pour produire des petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) entraîné par le promoteur U6 ou H1 a fait à long terme et le gène inductible taire 2,3 possible. Son utilisation en combinaison avec des vecteurs viraux génétiquement modifiés, tels que des lentivirus, facilite des rendements élevés de la prestation des shRNA et / ou l&#39;intégration dans l&#39;ADN génomique pour shRNA expression stable. Nous décrivons une detaileprocédure d en utilisant l&#39;ADN à base de vecteurs de technologie ARNi afin de déterminer la fonction des gènes, y compris la construction de vecteurs lentiviraux exprimant shRNA, la production de lentivirus et l&#39;infection des cellules, et les études fonctionnelles utilisant un modèle de xénogreffe de souris. Diverses stratégies ont été signalés dans la génération des constructions shRNA. Le protocole décrit ici employant amplification par PCR et une ligature 3-fragment peut être utilisé pour générer directement et de manière efficace shRNA-constructions contenant lentiviraux sans laisser de côté supplémentaire à une séquence nucléotidique codant shRNA. Étant donné que les cassettes d&#39;expression shRNA-créés par cette stratégie peut être coupé par les enzymes de restriction, ils peuvent être facilement déplacés vers d&#39;autres vecteurs avec différents marqueurs fluorescents ou un antibiotique. La plupart des réactifs de transfection commerciaux peuvent être utilisés dans la production de lentivirus. Toutefois, dans le présent rapport, nous fournissons une méthode économique en utilisant la précipitation au phosphate de calcium qui peut atteindre plus de l&#39;efficacité de transfection de 90% enDes cellules 293T. Par rapport à constitutifs des vecteurs d&#39;expression shRNA, un système inductible shRNA est particulièrement adapté pour abattre un gène essentiel à la prolifération cellulaire. Nous démontrons la gene silencing de Yin Yang 1 (YY1), un oncogène potentiel dans le cancer du sein 4,5, par une inductible Tet-On shRNA système et de ses effets sur la formation de tumeurs. Les recherches utilisant des lentivirus nécessite un examen et d&#39;approbation d&#39;un protocole sur la biosécurité par le Comité de biosécurité de l&#39;établissement d&#39;un chercheur. Les recherches utilisant des modèles animaux nécessite un examen et d&#39;approbation d&#39;un protocole sur les animaux par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation (ACUC) de l&#39;établissement d&#39;un chercheur.

L&#39;interférence ARN (ARNi) possède de nombreux avantages sur inactivation du gène et a été largement utilisé comme un outil dans les études fonctionnelles de gènes. L&#39;invention de l&#39;ADN à base de vecteurs ARNi la technologie a fait à long terme et inactivation génique inductible possible, et a également augmenté la faisabilité de l&#39;inactivation du gène<em&gt; In vivo</em&gt;.

ADN vecteur basé sur l&#39;interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

L'interférence ARN (ARNi) inhibe l'expression génique en dégradant spécifiquement les ARNm cibles. Depuis la découverte des petits ARN interférents double brin...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la fonction d'un gène au moyen de l'interférence ARN basée sur un vecteur d'ADN. Cela est réalisé en concevant et en générant d'abord des constructions ARNsh (S-H-R-N-A) ciblant des gènes spécifiques. La deuxième étape consiste à produire un lentivirus portant la cassette d'expression d'ARNsh.Ensuite, des lignées cellulaires stables sont générées en infectant les cellules avec le lentivirus, et les cellules infectées par le lentivirus sont utilisées dans divers tests in vitro et in vivo afin de déterminer les effets de l'inhibition du gène d'intérêt. En fin de compte, selon les tests utilisés, les résultats peuvent montrer des modifications de la tumorigénicité des cellules résultant de la diminution de l'expression du gène, grâce à des essais in vitro de prolifération, de migration et d'invasion, ainsi que des modèles in vivo de formation de xénogreffes. La procédure sera démontrée par Daniel Stowell, ma Juan, et Daniel est étudiant diplômé dans mon laboratoire. Ma Ma est technicienne.Chang est chercheur postdoctoral. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, comme

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

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Facteurs de l'hôte roman impliqués dans l'infection virale peuvent être identifiés par la cellule basée échelle du génome perte de fonction ARNi dépistage.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

ARN interférence a été prouvé très efficace pour analyser la fonction des gènes...

Interférences ARNi par injection dans les ARNdb Drosophile Embryons

Source : Fuchs, M. et al. Adenofection : une méthode pour étudier le rôle des chaperonnes moléculaires dans la morphodynamique cellulaire par des expériences de déplétion-rémission. J. Vis. Exp. (2016)Ce vidéo démontre la livraison, médiée par un adénovirus, d'un transgène fluorescent combinée à une transfection par siRNA–phosphate de calcium dans des cellules de cancer du col de l'utérus. L'adénovirus exprime une protéine de remplacement fluorescente, tandis que le siRNA induit une dégradation...

Transduction adénovirale combinée et knockdown médié par siRNA dans des cellules cancéreuses

Ici, nous présentons des protocoles d'élevage un coléoptère intermédiaire germe, Dermestes maculatus (D. maculatus) dans le laboratoire. Nous partageons également des protocoles pour l'embryon et des parents ARNi et méthodes pour l'analyse des phénotypes embryonnaires pour étudier la fonction des gènes de cette espèce.

L'élevage et d'ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle, Dermestes maculatus

Nous présentons un protocole visant à démontrer un système de transfert de gène somatique utilisant RIP-Tag ; RIP-tva modèle de souris pour étudier la fonction des gènes à la métastase. Les rétrovirus aviaires sont livrés intracardiacally afin d’assurer le transfert de gènes en lésions précancéreuses et non invasives des cellules β pancréatiques chez la souris adulte.

Identification et caractérisation des facteurs métastatiques par transfert de gènes dans le RIP de roman-Tag ; RIP-tva modèle murin

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

De nombreux gènes régulés à la hausse stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Il est essentiel de déterminer quels gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce protocole présente une méthode permettant d’étudier en temps réel les effets de l’augmentation de l’expression d’un gène sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.

Mesure quantitative en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales après une transfection d’ARNm synthétique

Le présent protocole décrit l’injection intracanalaire de vecteurs viraux via la tétine pour délivrer des gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires.

In vivo Livraison de gènes dans des cellules épithéliales mammaires de souris par injection intracanalaire mammaire

Cette étude présente un double système CRISPRi ciblant les ARN longs non codants dans les cellules de mélanome. Il permet l’inactivation combinatoire de gènes et le criblage létal synthétique, en identifiant les interactions d’ARNlnc spécifiques au cancer pour des stratégies thérapeutiques potentielles.

Stratégie d’interférence CRISPR double pour cibler les interactions létales synthétiques entre des ARN non codants dans des cellules cancéreuses

Apprenez à utiliser l'interférence ARN basée sur vecteur ADN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer. Cette méthode permet un silence génique inductible et à long terme in vivo.

ADN vecteur basé sur l'interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

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