ADN vecteur basé sur l'interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la fonction des gènes par l’utilisation de l’interférence ARN basée sur les vecteurs d’ADN. Ceci est accompli en concevant et en générant d’abord des constructions S-H-R-N-A qui ciblent des gènes spécifiques. La deuxième étape consiste à produire un lentivirus porteur de la cassette d’expression de l’ARN SH.

Ensuite, des lignées cellulaires stables sont générées en infectant les cellules avec le lentivirus et les cellules infectées par le lentivirus sont utilisées dans divers essais in vitro et in vivo pour déterminer les effets de l’inactivation du gène d’intérêt. En fin de compte, en fonction des tests utilisés, les résultats peuvent montrer des changements dans la génicité tumorale des cellules à la suite de l’inactivation de gènes grâce à l’utilisation d’essais in vitro de prolifération, de migration et d’invasion, ainsi que de modèles de formation de xénogreffes in vivo. La démonstration de la procédure sera assurée par Daniel Stowell, ma Juan, et Daniel est un étudiant diplômé dans mon laboratoire.

Chang est boursière postdoctorale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, telles que si un gène spécifique joue un rôle dans le développement et la progression du cancer, et pour quels aspects de ces processus il peut être important. Pour commencer, concevoir et ordonner les oligonucléotides en fonction des critères décrits et des deux oligonucléotides complémentaires inverses qui contiennent la séquence cible de 20 à 23 nucléotides dans le gène cible.

Ils formeront des sites éco R un et hindi trois aux deux extrémités. Après avoir été agenouillé, un autre oligo contient une séquence complémentaire inverse à la séquence cible, et ses trois extrémités premières. Neils à l’extrémité trois prime du promoteur H un ou U six avec une amorce en amont.

Utilisez une PCR pour créer un fragment qui a BAM H un et hindi trois sites à chaque extrémité. Pendant ce temps, digérer le vecteur lentivirus et le fragment de PCR. Effectuez ensuite une réaction de ligature à trois fragments entre le vecteur, le fragment PCR et les oligonucléotides Anil.

Avec un rapport de une molaire à 10 à 10, le vecteur résultant produira l’ARNH d’intérêt avec une séquence hindi à trois dans la région de la boucle. Si un vecteur inductible est utilisé, la production d’ARNH dépendra de la présence d’une molécule inductrice telle que la doxycycline pour le système Tet on. Transformez maintenant des cellules e coli DH cinq cellules alpha hautement efficaces et compétentes à l’aide du produit ligaturé et identifiez les vecteurs positifs à l’aide d’un dépistage PCR basé sur la colonie.

Amplifier un produit qui s’étend sur le vecteur et le site de ligature du promoteur inductible. Préparez l’ADN plasmatique des colonies positives à l’aide d’un kit commercial. Confirmer ensuite la présence de l’insert par digestion BAM H one et ECO R one et par électrophorèse de l’ADN agarose.

De plus, séquencez la région contenant le promoteur et S-H-R-N-A à l’aide du nucléotide LIGA P cinq. À l’aide d’un kit de préparation MIDI ou maxi sans endotoxines, préparez l’ADN du lentivirus en portant la cassette d’expression HRNA. Déterminez la concentration d’ADN en mesurant l’absorption de la lumière à 260 nanomètres et assurez-vous de la pureté de l’ADN en vérifiant que le rapport d’absorption de la lumière de 260 à 280 nanomètres est compris entre 1,8 et 2,0.

Enfin, exécutez le plasmide du lentivirus sur un aérogel pour vous assurer qu’il est enroulé en S Avant la transfection, préparez-vous à la transfection en déposant d’abord lentement 0,9 millilitre de solution A dans 0,9 millilitre de solution B tout en faisant bouillonner l’air à travers la solution B avec une pipette. Incuber ensuite le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, déposez lentement 0,6 millilitre du mélange sur trois plaques différentes de 10 centimètres avec des cellules T HEK 2 93.

Remettez ensuite les cellules dans l’incubateur quatre à six heures plus tard. Remplacez le milieu par sept millilitres de milieu DMEM complet. Après 24 heures, ajoutez cinq millilitres de milieu de terre, et après 24 heures supplémentaires, récoltez le milieu contenant le lentivirus.

Faites tourner le milieu récolté à 1500 tr/min à température ambiante pendant 10 minutes. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre. Faire tourner le flux à travers un milieu contenant le lentivirus par ultra-centrifugation.

Transvasez le surnageant dans un récipient à déchets contenant 5 % d’eau de Javel. Remettez en suspension la pastille de lentivirus dans un demi-millilitre de XPBS froid. Divisez ensuite la solution de lentivirus en aliquotes de 50 à 100 microlitres pour un stockage à moins 80 degrés Celsius.

Enfin, déterminez le titre du lentivirus à l’aide d’une technique fiable. En règle générale, une boîte de culture de 10 centimètres produira 50 à 100 millions d’unités infectieuses avant de procéder à l’infection cellulaire. Déterminez le MOI du titre lentiviral à l’aide d’un kit ou d’un R-T-P-C-R pour cette procédure.

Un MOI inférieur à quatre est recommandé. Commencez par ensemencer les cellules à infecter dans une plaque à six puits jusqu’à ce qu’elles aient une fluidité de 30 à 40 % et cultivez-les pendant la nuit. Le lendemain.

Remplacez le milieu par un millilitre de milieu frais contenant du poly cerveau ou de la protamine. Ajoutez ensuite entre un et 2 millions d’ui. Lentivirus contenant un marqueur fluorescent ou antibiotique.

Secouez lentement la plaque pendant 10 secondes pour mélanger et incubez-la pendant six heures. Après six heures, remplacez le milieu par un milieu normal et complet et propagez les cellules pendant deux jours. Le milieu ne doit pas contenir d’antibiotiques ou d’inducteurs, quel que soit le lentivirus utilisé après deux jours.

Ajoutez l’antibiotique approprié si le lentivirus contient un marqueur antibiotique. De même, ajoutez de l’inducteur à la moitié des cultures si le lentivirus est inductible. Après avoir cultivé les cellules pendant deux ou trois jours de plus avec des antibiotiques et des inducteurs, effectuez une analyse de sang occidentale pour tester l’inactivation du gène cible avant la xénogreffe de trypsine des yeux.

Les cellules de grandes boîtes de culture cellulaire et les remettre en suspension dans un milieu d’origine contenant 50 % de matrigel. Il est essentiel de maintenir les cellules cancéreuses en suspension et dans 50 % de matrigel et la seringue sur de la glace. Sinon, il y a un risque que le matrigel se solidifie et que l’infection doive s’en informer.

Préparez le site chirurgical en le nettoyant soigneusement avec de l’éthanol à 70 % et effectuez l’anesthésie avec une excellente ventilation et un filtre de piégeage au fluor fixé à la chambre d’induction. Anesthésie une souris nue thymique à l’aide de 2 % de fluor mélangé à 1,5 % d’oxygène trois à cinq minutes avant l’inoculation cellulaire. Maintenez ensuite l’anesthésie à l’aide de 2 % de fluor mélangé à de l’oxygène à travers un cône nasal.

Placez la souris sur un coussin chauffant réglé à 30 degrés Celsius. Chargez les cellules dans des seringues avec des aiguilles de calibre 25 et demi pour les injections sous-cutanées, ou de 28 à 30 aiguilles pour les injections orthotopiques. Cinq minutes après l’induction de l’anesthésie à un ou deux sites, injectez un à 10 millions de cellules dans des bolus de 200 microlitres.

Le nombre de cellules dépend de la malignité ou de l’agressivité des cellules cancéreuses. Pour les vecteurs constitutivement actifs, utilisez deux groupes de souris injectées avec les cellules exprimant soit le gène cible S-H-R-N-A, soit un fortet S-H-R-N-A brouillé sur les vecteurs. Utilisez les deux mêmes groupes et divisez-les chacun en sous-groupes qui sont ou ne sont pas fournis inducteurs dans leur eau.

Remplacez les docs contenant de l’eau deux fois par semaine. Assurez-vous que le volume de la tumeur ne dépasse pas la limite institutionnelle ou A CUC et euthanasiez tous les animaux qui présentent une ulcération étendue, une nécrose, une infection évidente, un saignement incontrôlé ou une maladie en phase terminale. Pour surveiller la croissance tumorale et les métastases via un marqueur bioluminescent, désinfectez la zone de travail et anesthésiez les souris dans une chambre d’imagerie sous anesthésie gazeuse.

Tout d’abord, faites une exposition de deux à cinq minutes et vérifiez l’intensité du signal, puis ajustez en conséquence. Si la taille de la tumeur dépasse 1000 millimètres cubes ou si la taille de l’établissement est limite, euthanasiez l’animal lors du sacrifice, documentez la taille de la tumeur et conservez-la pour une analyse plus approfondie. Ce protocole a été utilisé pour étudier les effets de la raison pour laquelle Y one knockdown sur la formation tumorale de la luciférase exprimant des cellules d’adénocarcinome du sein humain implantées chez des souris nues athymiques.

La séquence cible S-H-R-N-A de YY un humain et un témoin brouillé S-H-R-N-A, qui ne présentait aucune similitude significative avec un transcrit humain connu, ont tous deux été testés. En conséquence, deux vecteurs lentiviraux ont été construits et utilisés pour produire deux lentivirus. Les deux ont été utilisés pour infecter deux populations cellulaires différentes et des populations de cellules polyclonales ont été obtenues.

Après la sélection de la mycine. L’analyse sanguine de Western a confirmé que le SD induit YY one knockdown dans ces lignées cellulaires infectées. Ensuite, la population de cellules polyclonales du clone trois qui a été infecté par YY un inductible S-H-R-N-A et le contrôle. S-H-R-N-A.

Des LENTIVIRUS ont été utilisés pour tester les effets de l’appauvrissement de YY un sur l’invasion. Nous avons observé que YY une déplétion réduisait le caractère invasif des cellules. L’analyse sanguine occidentale a confirmé que les docs induisaient YY un silençage dans les cellules avec l’indu YY un S-H-R-N-A, tandis que les cellules contenant le contrôle.

S-H-R-N-A n’a pas montré cet effet. Ces cellules ont ensuite été utilisées dans une étude de modèle de souris xénogreffe par rapport aux groupes témoins indu, YY une souris implantée S-H-R-N-A alimentée avec le dos contenant de l’eau a montré une réduction significative de la formation de tumeurs lorsqu’elle était visualisée par bioluminescence et lorsque les poids tumoraux étaient mesurés comme prévu. YY un silençage dans ces tumeurs xénogreffes a été facilement confirmé par western blot.

Études N’oubliez pas que travailler avec des lentivirus peut être extrêmement dangereux selon les considérations de sécurité des SSNA. Pour la recherche avec des vecteurs lentiviraux, des procédures de confinement de niveau B amélioré deux sont requises pour tous les laboratoires.