Souris îlot de Langerhans isolement à l'aide d'une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

L’objectif global de cette procédure est d’isoler avec succès les œillets du pancréas d’une souris. Pour ce faire, il suffit d’abord d’isoler le pancréas des tissus environnants. Ensuite, le canal biliaire est canulé afin que le pancréas puisse être gonflé avec le mélange de protéase de collagénase.

Une fois gonflé, le pancréas est retiré et les œillets sont soigneusement dissociés. Enfin, les œillets isolés sont filtrés et plaqués pour une utilisation future. En fin de compte, cette méthode d’isolation des œillets avec de la collagénase purifiée et de la protéase neutre est utilisée pour obtenir un rendement maximal des œillets et une morphologie optimale des œillets.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d’isolement des œillets est que nous avons éliminé la variabilité d’un lot à l’autre en utilisant des enzymes purifiées. Et de plus, nous avons modifié ou amélioré certains protocoles pour améliorer la morphologie des œillets. Après l’euthanasie, couvrez le torse avec de l’éthanol à 70 % avant d’ouvrir complètement la cavité abdominale, de l’anus au diaphragme.

Placez ensuite la souris sur la plate-forme d’un microscope de dissection. Retirez le cæcum et le côlon ascendant et placez-les à l’extérieur de la cavité corporelle vers la gauche, déplacez les lobes du foie contre le diaphragme. S’ils n’y restent pas par eux-mêmes, augmentez l’ouverture de la cavité corporelle.

Saisissez le duodénum à l’aide d’une pince incurvée et localisez l’artère hépatique, la veine porte et le faisceau des voies biliaires menant au foie. Avec une autre paire de pinces incurvées. Insérez une suture sous le faisceau de veines et de canaux artériels et serrez-la aussi près que possible du foie.

À l’aide de deux paires de pinces incurvées, saisissez soigneusement le duodénum et trouvez le canal biliaire attaché à la papille, utilisez une pince de la pince pour percer le pancréas et le tissu conjonctif juste sous le canal biliaire et près de la papille qui travaille. Rapidement, placez la pince dans le trou et insérez une suture. Sans serrer. Attachez la suture autour du canal biliaire pour créer un petit cercle à l’aide d’une pince à 90 degrés.

Tirez sur l’intestin grêle jusqu’à ce que le canal biliaire soit tau. Faites une coupe horizontale à travers la papille avec des ciseaux super fins sans déloger le canal biliaire de la papille tout en tenant l’intestin. Insérez une canule dans le canal biliaire, puis tirez doucement la suture autour de la canule.

Ensuite, remplissez une seringue de trois millilitres avec 2,0 millilitres de mélange de collagénase et de protéase. Injectez ce mélange dans la canule à un rythme lent et constant. Une fois le gonflage du pancréas terminé, retirez la canule du canal biliaire.

En commençant par le côlon descendant, coupez le tissu conjonctif tout en tirant les intestins vers le haut jusqu’à ce que le canal biliaire soit atteint. Ensuite, séparez le pancréas de la rate et des tissus environnants. Enfin, coupez les sutures et retirez le pancréas.

Une fois retiré, placez le pancréas dans un tube de 50 millilitres contenant cinq millilitres de HBSS sur de la glace. Une fois tous les échantillons prélevés, placez tous les tubes de 50 millilitres contenant du tissu pancréatique dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Pendant 15 minutes, secouez doucement le tube et vérifiez la dissociation des tissus.

Assurez-vous que le tissu se détache facilement en tenant le tube par le couvercle. Tourbillonnez 12 fois pour dissocier davantage le tissu. N’ajoutez pas plus de 30 millilitres de HBSS et centrifugez.

Aspirez soigneusement le surnageant et laissez une petite quantité de surnageant au fond afin de ne pas perturber la palette cellulaire. À l’aide d’une seringue de 30 millilitres attachée à une aiguille de calibre 14, n’ajoutez pas plus de 10 millilitres de HBSS et aspirez la suspension de haut en bas deux fois. Filtrez le mélange de cellules à travers une passoire en T en plastique dans un tube de 50 millilitres.

Rincer avec encore 10 millilitres, HBSS et centrifuger. Décantez le surnageant et retournez les tubes pour les égoutter sur un essuie-tout absorbant pendant une minute. Remettez en suspension chaque tube dans 10 millilitres.

Froid 1100. Son revêtement opaque, le son opaque Avec 10 millilitres, HBSS et centrifugeuse. Retirez la totalité des 20 millilitres de surnageant à l’aide d’une pipette de 25 millilitres de grand calibre et passez le surnageant à travers un filtre inversé de 70 microns.

Filtrez les œillets directement dans une boîte de Pétri et rincez en pipetant 10 millilitres de média à œillets à travers la culture du filtre. Les œillets dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’expérimentation. Le rendement, la morphologie et la qualité des œillets sont les paramètres généraux utilisés pour juger du succès de l’isolation des œillets.

La morphologie typique des œillets est illustrée ici. Les œillets ont une forme ronde à oblongue avec une taille relativement uniforme. Ici. Des œillets isolés ont été analysés pour détecter la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose.

La stimulation à l’insuline était similaire entre les œillets préparés par Sigma Type 11 par rapport à ci zyme TM, MABP, indiquant une haute qualité de préparation des œillets. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de canuler un canal biliaire de souris. Travaillez avec la collagénase zyme et les neutroprotéases pour isoler vos paupières pour tout dosage.