Name: Souris îlot de Langerhans isolement à laide dune combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Apprenez à isoler des îlots de Langerhans chez la souris à l'aide d'une combinaison de collagénase purifiée et de protéase neutre. Cette méthode améliore le rendement et la morphologie tout en réduisant la variabilité inter-lots.

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Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (à la fois pour RGM).

A. Matériel nécessaire: Voir le tableau 1 (réactifs) avant la préparation <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10X + 900 ml H 2 0 + 1% de pénicilline / streptomycine (stockée dans le réfrigérateur ou sur de la glace). </li><li> 20% actions BSA est faite dans l&#39;eau et aliquotés et conservés à -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml de HBSS 1X (P / S) + 3 ml de BSA 20% (concentrations finales BSA est de 0,3%) </li><li> Islet moyenne: RPMI + 10% FBS + glutamine 1% + 1% de pénicilline / streptomycine </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque </li><li> Suture 4-0 (McKesson): couper en morceaux 2 ¾ pouces et stockés dans une boîte de Petri de 10 cm </li><li> Instruments: Pliez la pince de Outils Fine Science à 90 °, et limer les dents crénelées de toutes les trois paires de pinces. L&#39;objectif est de ternes les dents, ne pas les supprimer. </li><li> Canule pour l&#39;administration de la collagénase / protéase mélange: 27G ½ po aiguille, 30 ½ poaiguille, tube PE50 coupé en morceaux de 12 po. Déposer les deux aiguilles vers le bas jusqu&#39;à une extrémité arrondie lisse qui n&#39;a pas de bords tranchants. Insérer l&#39;aiguille 27G dans une extrémité d&#39;une pièce de 12 po PE50 tube. Retirez l&#39;aiguille 30G de l&#39;enveloppe en brisant le boîtier avec une paire de pinces, tournant le boîtier ¼ de tour à chaque fois. Retirer l&#39;aiguille de la pince de l&#39;enveloppe et de l&#39;insérer dans l&#39;autre extrémité de la tubulure PE50 sous un microscope à dissection. Veillez à ne pas plier le tuyau que vous insérez l&#39;aiguille dans le tube PE50. L&#39;aiguille 27G est la fin que vous allez fixer la seringue de la collagénase. </li><li> Protéase collagénase (enzyme CI MA) et de neutre (CI enzyme BP). Reconstituer le TDE selon les instructions du fabricant. Reportez-vous au certificat spécifique du lot d&#39;analyse pour calculer la concentration de l&#39;activité enzymatique. Transférer un total de 350.000 collagène dégradantes d&#39;activité (CDA) des unités de la collagénase reconstitué et 100.000 unités de protéase neutre de la reconstittribué protéase BP dans un tube conique et diluer jusqu&#39;à 15 ml au total dans du HBSS (P / S) </li></ol> B. Step-by-Step Protocole 1. L&#39;inflation de pancréas avec la collagénase / protéase Mélange <ol><li> Euthanasier souris par dislocation cervicale, saturer le torse de la souris avec de l&#39;EtOH 70%, cavité abdominale ouverte complètement de l&#39;anus à membrane avec des ciseaux et des pinces à dissection. </li><li> Placez la souris sur la plate-forme d&#39;un microscope à dissection. </li><li> Tirez le caecum et le côlon ascendant et de les mettre en dehors de la cavité du corps à votre gauche. Voir la figure 1 pour un résumé des étapes suivantes. </li><li> Positionner les lobes du foie contre le diaphragme, ils doivent y rester si la cavité du corps est suffisamment ouvert. Trouvez l&#39;artère hépatique, la veine porte et le faisceau voie biliaire conduisant dans le foie en saisissant le duodénum avec des pinces courbes. Avec une autre paire de pinces courbées, les mains sous l&#39;artère, veine, et conduit bundle et tirez un 2 ¾ po morceau de suture 4-0 sous l&#39;artère, veine voie biliaire, et l&#39;attacher fois et serrer au plus près du foie que possible. </li><li> L&#39;utilisation de deux paires de pinces courbes, bien saisir le duodénum et de trouver la voie biliaire au duodénum attaché à la papille. Utilisez une pince de la pince à pointer à travers le pancréas et le tissu conjonctif droit sous l&#39;étroite voie biliaire à la papille. Poke vos pinces rapidement à travers l&#39;organe à faire un trou, puis mettre les deux pinces de pinces à travers et prendre un autre morceau de 2 ¾ de pouce de suture 4-0 grâce et l&#39;attacher fois et tirez-le à un petit cercle, mais ne pas serrer. </li><li> Modifier les 90 ° forceps et aux ciseaux Vannas Superfine. Avec les 90 ° pince, pincez et tirez soigneusement l&#39;intestin grêle jusqu&#39;à ce que le canal cholédoque est tendu. Faire une coupe horizontale à travers la papille avec les ciseaux en piquant les ciseaux ouverts dans l&#39;intestin, puis couper avec un seul mouvement. Essayez de ne faire one recoupent la papille sans déloger la voie biliaire de la papille. </li><li> Tout en maintenant l&#39;intestin avec les 90 ° pince, insérez la canule dans le canal cholédoque jusqu&#39;à la moitié de la longueur de la voie biliaire, puis tirez doucement le fil de suture serrée autour de la canule. </li><li> Remplir une seringue de 3 ml avec 2,0 ml de collagénase / protéase mélange et les injecter dans la canule à un rythme lent et constant. </li><li> Après le gonflage du pancréas est terminée, retirez la canule de la voie biliaire principale et utiliser les pinces et ciseaux courbes incurvées printemps pour enlever le pancréas gonflé en commençant par le côlon descendant et coupant le tissu conjonctif que vous tirez les intestins vers le haut. Continuer à supprimer le pancréas dans l&#39;intestin jusqu&#39;à ce que vous atteigniez le canal biliaire, puis retirez le pancréas de la rate, puis l&#39;estomac, puis de les viscères de la cavité abdominale. Terminer la suppression en coupant les fils de suture loin. Ajouter le pancréas à un tube de 50 ml contenant 5 ml de HBSS(P / S). Ce tube doit être sur la glace. </li><li> Répétez la procédure ci-dessus pour chaque animal jusqu&#39;à quatre animaux. Pour des résultats optimaux, se dissocient seulement quatre pancréas en même temps. En règle générale, tandis que les quatre premiers sont dans le bain à 37 ° C de l&#39;eau, on gonfle un autre pancréas quatre. </li></ol> 2. Pancréas dissociation <ol><li> Placer les tubes de 50 ml contenant du pancréas dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Secouez doucement le tube et vérifier pour la dissociation des tissus, assurez-vous de tissu se détache facilement, puis tourbillonner les tubes 12 fois pendant que vous tenez le tube par le couvercle. </li><li> Ne pas ajouter plus de 30 ml de HBSS (BSA) (cela peut être un montant inférieur, en fonction de combien est nécessaire pour équilibrer les tubes pendant l&#39;étape de centrifugation) et centrifuger à 290 xg pendant une minute. </li><li> Aspirer le surnageant avec précaution et laisser une petite quantité de surnageant (2-3 ml) à la base afin de ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> L&#39;aide d&#39;un seringue 30 ml d&#39;Attached à 14G aiguille, ne pas ajouter plus de 10 ml de HBSS (BSA) et aspirer la suspension de haut en bas 2 fois. </li><li> Filtrer le mélange de cellules à travers une passoire à thé en plastique dans un tube de 50 ml et rincer avec un autre HBSS 10 ml (BSA). </li><li> Centrifuger à 330 xg pendant 2 min. </li><li> Décanter le surnageant et inverser les tubes égoutter sur du papier absorbant pendant 1 minute. </li><li> Resuspendre chaque tube de 10 ml à froid histopaque 1100. </li><li> Superposez la histopaque avec 10 ml de HBSS (BSA) et centrifuger à 900 xg pendant 18 min. </li><li> Retirez la totalité des 20 ml de surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette de grand alésage 25 ml et passer le surnageant à travers environ 70 um filtre inversées. </li><li> Rincer les îlots dans un plat de Pétri de 10 cm par pipetage 10 médias îlots ml à travers le filtre en le tenant à l&#39;endroit sur le plat. </li><li> Culture des îlots dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur de culture tissulaire avant d&#39;être prêt pour l&#39;expérimentation. En règle générale, les îlots sont cueillies à la main et comptés avant experimentation. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Rendements Islet, la morphologie et la qualité sont les paramètres généraux utilisés pour juger du succès de l&#39;isolement des îlots. Dans nos mains, les rendements des îlots de la moyenne C57BL / 6 souris sont de l&#39;ordre de 150-250 îlots qui utilisent ce protocole (voir le tableau 2), et sont comparables aux données obtenues en utilisant optimisé Sigma type XI collagénase. Cependant, les rendements peuvent varier en fonction de la souche de souris utilisée et l&#39;âge de la souris. La plupart des animaux que nous utilisons sont dans la gamme de 8-16 ans semaine Ce protocole a été testé sur plusieurs souches de souris, y compris C57BL / 6 (180 à 250 îlots / souris), CD1 (200-300 îlots / souris), 129 / B6 (200-300 îlots / souris), BLKS-db/db (120-200 îlots / souris), NOD (10 semaines d&#39;âge, 100-150 îlots / souris), et NOD-SCID (100-150 îlots / souris ). La morphologie des îlots typique est montrée à la figure 2, dans laquelle îlots faire un tour à la forme oblongue avec une taille relativement uniforme (bien que la taille uniformity peut varier d&#39;une souche à l&#39;autre). Figure 3 montre notre analyse typique du glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline à partir de souris C57BL / 6 îlots isolés à l&#39;aide de la souris TDES purifiés vs Sigma type XI de la collagénase. Typiquement, un des résultats de haute qualité d&#39;îlots de préparation à une stimulation par l&#39;insuline à 25 mM de glucose qui est 6-20 fois supérieure à celle observée à 2,5 mM de glucose. D&#39;autres applications peut également être utilisé pour tester la qualité d&#39;îlots isolés, et il s&#39;agit notamment de l&#39;utilisation de techniques de périfusion, Ca 2 + d&#39;imagerie (avec Fura2), et transcription inverse PCR, entre autres 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un résumé de la canulation du canal cholédoque. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Aspect typique d&#39;îlots C57BL / 6 à 24 h isolement suivant. Images ont été acquises sur un enmicroscope à un grossissement de 40X convertis. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Stimulée par le glucose sécrétion d&#39;insuline de souris C57BL / 6 îlots. A 24 h suivant l&#39;isolement, 100 îlots ont été incubés dans un plat de 12 puits pendant 1 heure à 37 ° C dans de Krebs-Ringer HEPES solution tampon contenant 2,5 mM de glucose. Les îlots ont ensuite été transférés à Krebs-Ringer HEPES à 2,5 mM de glucose pendant une heure supplémentaire, après quoi le surnageant a été recueilli pour la mesure de l&#39;insuline à l&#39;aide d&#39;une à deux sites immunospécifique-enzymatique (ELISA) (Crystal Chem). Les îlots mêmes ont ensuite été transférés à Krebs-Ringer tamponné HEPES contenant 25 mM de glucose et de l&#39;insuline dans le milieu a été mesurée par ELISA après 1 heure d&#39;incubation.

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<li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li>
<li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPAR-%7Bgamma%7D+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li>
</ol>

NDS, SAT, et RGM n&#39;avez rien à déclarer. AGB auteur est employé par VitaCyte. Auteur MRC détient une participation dans VitaCyte.

Dans ce protocole, nous avons décrit notre procédure de cathétérisme, perfusion de collagénase, et la dissociation du pancréas de souris, dans le but d&#39;isoler les îlots de Langerhans. Techniquement, notre méthode, une fois maîtrisé, devrait permettre à l&#39;isolement du pancréas moins de 4 min de l&#39;euthanasie de l&#39;animal, et en 1 heure devrait aboutir à l&#39;isolement d&#39;îlots à partir d&#39;un seul animal. La rapidité de la technique nous permet d&#39;isoler les îlots de jusqu&#39;à 12 souris à un étirement typique, ce qui conduit à l&#39;isolement de jusqu&#39;à 3.000 îlots. Contrairement à d&#39;autres protocoles qui utilisent des préparations brutes de collagénase, notre protocole comprend l&#39;utilisation de protéases purifiées, CI enzyme collagénase et MA CI enzyme protéase BP. Les variations de la consistance des préparations TDE qui sont disponibles dans le commerce exige que chaque lot soit individuellement testées et optimisées avant l&#39;utilisation générale. Cette variabilité de lot à lot nous a conduit à envisager l&#39;utilisation de puriTDES fiés de VitaCyte. Ces TDES hautement purifiés sont caractérisés par plusieurs méthodes, y compris l&#39;utilisation de tests de fluorescence sensibles substrat marqué. Le dosage de fluorescence CDA est plus sensible aux différentes formes moléculaires de la collagénase qui ont des cinétiques différentes de collagène natif dégradants. Historique des dosages de substrats peptidiques fournir une évaluation incomplète de la collagénase. Caractérisation de la collagénase par des méthodes multiples assure une plus grande activité enzymatique entre les lots. Sur la base de notre propre test en utilisant une variété de préparations de collagenase disponibles dans le commerce, nous avons constaté que les combinaisons d&#39;enzymes purifiées donné reproductibles de lot à lot résultats. Les principaux avantages de l&#39;utilisation de TDES hautement purifiés et rigoureusement caractérisée dans la présente demande sont une fois de la composition enzymatique optimale est définie, la cohérence de ses performances de lot à lot est assurée. Cette cohérence élimine le processus laborieux de qualification beaucoup normalement requispour les produits bruts de la collagénase ou enrichi. TDES purifiées également permettre des modifications supplémentaires de la composition afin d&#39;améliorer le rendement et la qualité des îlots récupérés à partir de différentes souches de souris. Rapports compositions enzymatiques optimales pour l&#39;isolement des îlots de différentes souches de souris peuvent être plus efficacement communiquées. Ceci, à son tour, conduit à une utilisation plus productive des ressources et une meilleure flexibilité dans la conception expérimentale. Il ya beaucoup d&#39;étapes essentielles qui peuvent affecter le résultat de l&#39;isolement des îlots en utilisant notre protocole. Le premier est la nécessité de parvenir à l&#39;inflation effective du pancréas au cours de la perfusion de la préparation enzymatique. Il est important de commencer l&#39;inflation avec une force douce de la seringue, et augmenter la force que les gonfle pancréas. Il est utile de déplacer les intestins et le pancréas soulever lors du gonflage de sorte que la collagénase perfuse l&#39;organe entier. Une autre étape importante est la force avec laquelle on secoue l&#39;AFTE tubesr incubation à 37 ° C (étape 2,2). Nous avons constaté que le pancréas secouant durement contre le bouchon du tube provoque la fragmentation des îlots, mais sans aucune forme de dissociation mécanique à cette étape, les rendements des îlots peut chuter dramatiquement. Il est également impératif que lors de l&#39;étape de dissociation avec la seringue (étape 2.5), une force de niveau moyen est appliqué pendant le mouvement de haut en bas avec le piston, ce qui assure la dissociation tissulaire adéquate avant l&#39;étape de filtrage (2,6), où très peu de tissu doit être retenu sur le filtre passoire à thé. Enfin, la dernière étape à suivre attentivement l&#39;aspiration de l&#39;ensemble de 20 ml de HISTOPAQUE les îlots fractionnés. Bien que les îlots sont généralement à l&#39;interface de la histopaque et HBSS, nous avons constaté que nous perdons îlots quand nous essayons de supprimer uniquement l&#39;interface, au contraire, nous avons maintenant retirer la totalité des 20 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette de grand alésage 25 ml. Nous avons ajouté la filtration à travers le filtre 70 um inversé (étape 2.11) afin d&#39;éliminer la nécessité de centrifuge les îlots à plusieurs reprises pour laver la histopaque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td></td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> HBSS 10X </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> tout </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 suture rouleau de 100 m </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 14 g extrémité émoussée </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Sciss Superfine Vannas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux courbes de printemps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Pince courbes (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Pince courbes (pour 90 °) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 pouces aiguille </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 30G 1/2 pouce </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> Tube PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP protéase </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 3 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 30 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um filtre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 boîte de Pétri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Passoire à thé en plastique </td><td> Toute fourniture cuisine </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs Tableau 1. Et équipement </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma type XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110329) </td><td> MA (081104) BP (100823) </td><td> MA (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Rendements îlots moyen (± SD) en utilisant des lots différents TDE * * Les données représentent la moyenne des rendements des îlots d&#39;au moins 10 souris. Les numéros de lot entre parenthèses </td></tr></tbody></table>

souris îlot de langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

L&#39;interrogatoire de l&#39;expression génique des cellules bêta et la fonction in vitro a carrément changé au fil des ans à partir de l&#39;étude des lignées de rongeurs tumorigènes de cellules à l&#39;étude des îlots isolés de rongeurs. Îlots primaires offrent l&#39;avantage qu&#39;elles reflètent plus fidèlement la biologie des voies de signalisation intracellulaires et les réponses sécrétoires. Considérant que la méthode d&#39;isolement des îlots de tissu à l&#39;aide d&#39;enzymes dissociant (TDE) préparatifs a été bien établi dans de nombreux laboratoires de 1-4, les variations de la consistance du rendement et de la qualité de l&#39;îlot n&#39;importe quelle souche de rongeurs donnée limiter la portée et la faisabilité des études primaires îlots. Ces variations se produisent souvent à la suite des TDES brut partiellement purifiés utilisés dans la procédure d&#39;isolement des îlots; TDES présentent souvent beaucoup à beaucoup variations de l&#39;activité et nécessitent souvent des ajustements de la dose d&#39;enzyme utilisée. Un petit nombre de rapports ont utilisé pour purifier TDES isolements cellulaires de rongeurs 5, 6 </sup&gt;, mais la pratique n&#39;est pas très répandue malgré l&#39;utilisation de routine et les avantages de purifier TDES pour isolements d&#39;îlots humains. En collaboration avec VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), nous avons développé un protocole de souris modifiée îlot isolement basé sur celui décrit par Gotoh 7, 8, dans lequel les TDES sont perfusés directement dans le canal pancréatique de souris, suivie d&#39;un fractionnement du tissu brut par un gradient Histopaque 9, et l&#39;isolement des îlots purifié. Une différence significative dans notre protocole est l&#39;utilisation de la collagénase purifiée (CI enzyme MA) et neutre protéase (enzyme CI BP) combinaison. La collagénase a été caractérisé par l&#39;utilisation d&#39;un 6 collagène fluorescence activité (CDA) test dégradants qui ont utilisé marquées par fluorescence solubles fibrilles peau de veau comme substrat 6. Ce substrat est plus prédictif de la cinétique de dégradation du collagène dans la matrice de tissu, car il repose sur le collagène natif comme substrat. La protéase est CHaracterized avec un test sensible cinétique fluorescente 10. L&#39;utilisation de ces tests améliorés ainsi que l&#39;analyse biochimique plus traditionnelle activer le chiffrement transparent des données à fabriquer plus cohérente, conduisant à la cohérence entre les lots de meilleures performances. Le protocole décrit ici a été optimisé pour un rendement maximal et de la morphologie des îlots îlot optimale en utilisant C57BL / 6. Au cours de l&#39;élaboration de ce protocole, plusieurs combinaisons de collagénase et de protéases neutres ont été évaluées à différentes concentrations, et le rapport final de la collagénase: protéase neutre de 35:10 représentent le rendement enzymatique comparable à Sigma Type XI. Parce que la variabilité importante des rendements des îlots moyenne de différentes souches de rats et de souris ont été signalés, des modifications supplémentaires de la composition TDE devraient être faits pour améliorer le rendement et la qualité des îlots de récupération à partir de différentes espèces et souches.

Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d&#39;une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Souris îlot de Langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

L'étude de l'expression génique et de la fonction des cellules bêta in vitro a radicalement évolué au fil des années, délaissant l'étude des lignées cellulaires tumorigènes de rongeurs...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler avec succès les îlots pancréatiques à partir du pancréas d'une souris. Cela est réalisé en premier lieu en isolant le pancréas des tissus environnants. Ensuite, le canal biliaire est canulé afin de permettre l'insufflation du pancréas avec le mélange de protéase au collagénase.Une fois gonflé, le pancréas est retiré et les îlots sont soigneusement dissociés. Enfin, les îlots isolés sont filtrés et mis en culture pour une utilisation ultérieure. En définitive, cette méthode d'isolement des îlots à l'aide de collagénase purifiée et de protéase neutre est utilisée pour obtenir un rendement maximal d'îlots et une morphologie optimale des îlots.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'isolement des œillets est que nous avons éliminé la variabilité entre lots en utilisant des enzymes purifiées. De plus, nous avons modifié ou amélioré certains protocoles afin d'améliorer la morphologie des œillets. Après l'euthanasie, recouvrez le tronc avec de l'éthanol à 70 % avant d'ouvrir complètement la cavité abdominale de l'anus jusqu'au diaphragme.Placez ensuite la souris sur la plateforme d'un microscope stéréoscopique. Extrayez le caecum et le côlon ascendant et positionnez-les à l'extérieur de la cavité corporelle du côté gauche ; déplacez les lobes du foie contre le diaphragme. S'ils ne restent pas en place d'eux-mêmes, élargissez l'ouverture de la cavité corporelle.Saisir le duodénum avec des pinces courbes et localiser le cordon artère hépatique, veine porte et canal biliaire menant au foie. Avec une autre paire de pinces courbes, insérer une suture sous le cordon artère-veine-canal et serrer aussi près que possible du foie.À l’aide de deux paires de pinces courbes, saisir délicatement le duodénum et localiser le canal cholédoque fixé à la papille. À l’aide d’une branche de la pince, percer le pancréas et les tissus conjonctifs situés juste sous le canal cholédoque et près de la papille. Rapidement, introduire la pince à travers l’orifice et insérer un fil de suture. Nœud lâche. Faire passer le fil autour du canal cholédoque afin de former un petit cercle, en utilisant des pinces à 90 degrés.Tirer délicatement l'intestin grêle jusqu'à ce que le canal biliaire soit tendu. Effectuer une incision horizontale au niveau de la papille à l'aide de ciseaux très fins, sans déloger le canal biliaire de la papille, tout en maintenant l'intestin. Insérer une canule dans le canal biliaire, puis serrer doucement le fil autour de la canule.Ensuite, remplissez une seringue de trois millilitres avec 2,0 millilitre de mélange de collagénase et de protéase. Injectez ce mélange dans la canule à un rythme lent et constant. Une fois l'insufflation du pancréas terminée, retirez la canule du canal biliaire.En partant du côlon descendant, sectionner le tissu conjonctif tout en tirant sur les intestins vers le haut jusqu'à atteindre le canal cholédoque. Ensuite, séparer le pancréas de la rate et des tissus environnants. Enfin, couper les points de suture et retirer le pancréas.Une fois prélevé, placer le pancréas dans un tube de 50 millilitres contenant cinq millilitres de HBSS sur de la glace. Une fois tous les échantillons recueillis, placer les tubes de 50 millilitres contenant le tissu pancréatique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Agiter doucement le tube pendant 15 minutes et vérifier la dissociation du tissu.Vérifiez que le tissu se dissocie facilement en tenant le tube par le couvercle. Agitez doucement 12 fois pour dissocier davantage le tissu. Ajoutez au plus 30 millilitres de HBSS et centrifugez.Aspirez soigneusement le surnageant et laissez une petite quantité de surnageant au fond afin de ne pas perturber le culot cellulaire. À l’aide d’une seringue de 30 millilitres munie d’une aiguille de calibre 14, ajoutez au maximum 10 millilitres de HBSS et aspirez la suspension de haut en bas deux fois. Filtrez le mélange cellulaire à travers un tamis plastique en forme de T dans un tube de 50 millilitres.Rincez avec encore 10 millilitres de HBSS et centrifugez. Jetez le surnageant et retournez les tubes pour les faire égoutter sur du papier absorbant pendant une minute. Résuspendez chaque tube dans 10 millilitres.Froid 1100. Son recouvrement opaque, son recouvrement opaque avec 10 millilitres, HBSS et centrifuger. Éliminer complètement les 20 millilitres de surnageant à l’aide d’une pipette large orifice de 25 millilitres et faire passer le surnageant à travers un filtre inversé de 70 microns.Filtrez les œillets directement dans une boîte de Pétri et rincez-les en pipetant 10 millilitres de milieu pour œillets à travers la culture sur filtre. Conservez les œillets dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à leur utilisation expérimentale. Les rendements en œillets, leur morphologie et leur qualité sont les paramètres généraux utilisés pour évaluer le succès de l’isolement des œillets.La morphologie typique des œillets est présentée ici. Les œillets ont une forme ronde à oblongue avec une taille relativement uniforme. Des œillets isolés ont été analysés pour la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.La stimulation à l'insuline était similaire entre les îlots préparés à l'aide de Sigma Type 11 et ceux préparés avec ci zyme TM, MABP, indiquant une qualité élevée de la préparation des îlots. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment canuler le canal cholédoque d'une souris. Travaillez avec la zyme collagénase et les neutroprotéases pour isoler vos îlots afin de les utiliser dans n'importe quel dosage.

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Isolement murin îlots pancréatiques

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules des îlots pancréatiques souris pour contrôler les inductions de ROS par les xénobiotiques afin d’identifier les potentiels chimiques xénobiotiques diabétogène.

Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals

Dans ce protocole, une méthode d’isolement et de transplantation d’îlot de murine dans le tissu sous-cutané sous-cutané inguinale d’adipeux est décrite. Des îlots murines syngénéiques isolés sont transplantés dans un récipient de murine utilisant un hydrogel de membrane de sous-sol. Le taux de glucose sanguin des receveurs est surveillé, et l’analyse histologique des greffes d’îcles est effectuée.

Modèle de transplantation inguinal Subcutaneous De tissu adipeux blanc (ISWAT) des îlots de Murine

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Apprenez à isoler des îlots de Langerhans chez la souris à l'aide d'une combinaison de collagénase purifiée et de protéase neutre. Cette méthode améliore le rendement et la morphologie tout en réduisant la variabilité inter-lots.

Souris îlot de Langerhans isolement à l'aide d'une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

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