Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

- Les cellules des îlots pancréatiques produisent des hormones essentielles impliquées dans les fonctions endocriniennes. Pour isoler les îlots, il faut d’abord sécuriser une souris euthanasiée et exposer chirurgicalement sa cavité abdominale. Brossez le foie et les intestins pour localiser et clamper le canal cholédoque. Identifiez l’ampoule de Vater, le canal formé par l’union des canaux pancréatiques et cholaires.

Ensuite, injectez une solution d’enzyme collagénase dans le canal cholédoque. Le reflux du canal gonfle avec succès le pancréas, facilitant la dissociation des tissus pancréatiques induite par la collagénase. Exciser le pancréas dans un tube contenant plus de solution de collagénase. Hachez mécaniquement le tissu et incubez pour faciliter la digestion des tissus par la collagénase.

Une fois la suspension homogène obtenue, arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant une solution contenant des protéines qui inhibent l’activité de la collagénase. Centrifugeuse pour recueillir une pastille de tissu. Remettez la pastille en suspension dans un milieu à gradient de densité approprié, superposez-la d’un tampon approprié et centrifugez-la pour générer des couches de gradient

Prélever les îlots de la couche formée entre le milieu de gradient de densité et la zone tampon. Enfin, choisissez des îlots sains pour la culture. Dans le protocole suivant, nous démontrerons l'isolement des îlots pancréatiques murins par l'administration de collagénase suivie d'une centrifugation par gradient de densité.

- Commencez par coller les membres de la souris en position couchée et vaporisez le corps avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une pince en verre de couverture et de ciseaux chirurgicaux incurvés, faites une incision horizontale de la peau abdominale d’environ 3 centimètres et ouvrez la peau pour exposer la paroi abdominale. Faites une incision verticale de 3 à 4 centimètres sur le péritoine abdominal pour exposer complètement le pancréas et placez la souris sous un microscope à dissection.

Poussez le lobe du foie vers le haut pour exposer le canal biliaire, qui apparaît sous la forme d’un tube rose pâle, et déplacez doucement les intestins de la région lombaire et iliaque droite vers la droite de la cavité abdominale pour exposer le canal biliaire et l’artère hépatique. Utilisez Schwartz Micro Serrefines pour pincer soigneusement le canal cholédoque aussi près que possible du foie et identifier l’ampoule de Vater, qui est située au niveau de la papille duodénale et formée par l’union du canal pancréatique et du canal cholédoque.

À l’aide d’une pince Micro Adson pour tendre le canal cholédoque, insérez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30 attachée à une seringue de 3 millilitres contenant 3 millilitres de solution de collagénase P fraîchement préparée dans l’ampoule de Vater, en poussant l’aiguille dans le canal parallèlement au vaisseau sur environ un quart de la longueur du vaisseau. Une fois l’aiguille en place, stabilisez l’aiguille à l’aide d’une pince Micro Adson et injectez lentement et régulièrement 3 millilitres de solution de collagénase P dans le conduit. L’injection est considérée comme réussie si les régions de la tête, du cou, du corps et de la queue du pancréas sont complètement gonflées.

- Une bonne entrée dans l’ampoule et la canulation du canal cholédoque sont essentielles pour une récolte réussie par digestion. Le perçage des parois canalaires réduit l’efficacité de l’isolation.

- À l’aide d’une pince incurvée et d’une pince Micro Adson, retirez délicatement le pancréas gonflé en commençant par la rate et en continuant vers l’estomac et le long du duodénum. Placez ensuite le pancréas dans un tube de digestion de 50 millilitres contenant 3 millilitres de solution glacée de collagénase P. Pour récolter les îlots, utilisez d’abord des ciseaux chirurgicaux fins pour hacher le pancréas pendant 3 à 5 secondes avant de placer le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius à 100 à 120 rotations par minute pendant 12 à 13 minutes.

À la fin de l’incubation, secouez doucement le tube pendant environ 30 secondes pour perturber les tissus jusqu’à ce que la solution soit homogène, comme le confirment de fines particules de tissu pancréatique ressemblant à du sable. Dès que le tissu est digéré, placez le tube sur de la glace et ajoutez 40 millilitres de solution d’arrêt glacée pour terminer la réaction enzymatique. Après avoir doucement perturbé la pastille, faites tourner le tissu digestif dans une centrifugeuse à godet oscillant, suivie de deux centrifugations avec 20 millilitres de solution d’arrêt fraîche par lavage.

Après le dernier lavage, remettez en suspension la pastille dans 40 millilitres de HBSS glacé pour trois lavages supplémentaires, en remettant en suspension la pastille dans 5 millilitres de solution de gradient de densité à température ambiante après le dernier lavage. Agitez brièvement le tube à basse vitesse jusqu’à ce que la solution soit homogénéisée avant d’ajouter encore 5 millilitres de gradient de densité à température ambiante dans le tube. Utilisez maintenant une pipette de 10 millimètres pour ajouter doucement et lentement 10 millimètres de HBSS à température ambiante dans le tube de manière goutte à goutte pour permettre la formation d’un gradient, et utilisez une centrifugeuse à godet oscillant pour isoler les populations cellulaires par séparation par gradient de densité.

À la fin de la centrifugation, utilisez une pipette de 10 millilitres, pré-humidifiée avec du HBSS froid pour recueillir 5 à 10 millilitres de la couche d’îlots entre le gradient de densité et le HBSS. Transférez les îlots dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de HBSS frais et glacé, et collectez les cellules par centrifugation dans une centrifugeuse à godet oscillant. Aspirez soigneusement tous les millilitres de surnageant, sauf les 3 derniers, sans déranger la pastille, et lavez les îlots au moins trois fois de plus avec 20 millilitres de HBSS frais par lavage.

Après le dernier lavage, remplacez le surnageant par 4 millilitres de milieu RPMI 1640 à 37 degrés Celsius et faites tourner doucement le tube pour déloger la pastille. Versez immédiatement les îlots dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et lavez le tube avec 5 millilitres de milieu frais RPMI 1640 pour recueillir tous les îlots restants, en regroupant le lavage avec les autres îlots.

Ensuite, à l’aide d’un microscope de dissection et d’une pointe de pipette de 20 microlitres, choisissez des îlots sphériques ou oblongs, brun doré sains, avec une surface lisse de la boîte de Pétri pour les transférer dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 10 millilitres de milieu RPMI 1640 complet. Lorsque tous les îlots ont été collectés, placez les îlots dans l’incubateur stérile à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone dans de l’air humidifié pendant la nuit.