Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intracellulaire dans la pathogenèse du diabète PPDMA induit par une pancréatite aiguë. Les méthodes actuelles pour isoler les îlots primaires des souris reposent principalement sur la canulation des voies biliaires. Cette technique nécessite une localisation précise et une canulation du canal biliaire, suivies d’une perfusion in vivo de la solution de collagénase P du parenchyme pancréatique.

Il est assez difficile de réaliser sans formation spécialisée, et obtenir une perfusion pancréatique efficace et efficiente est un défi. Cette vidéo empêche une méthode simple et rapide pour isoler les îlots de montage primaire, adaptée aux chercheurs sans expérience en perfusion. La méthode permet également l’acquisition simultanée de cellules acinaires pancréatiques primaires, produisant une quantité suffisante d’îlots et de cellules acinaires de haute qualité.

Cela permet aux chercheurs de mener des expériences dans le même contexte pathologique et physiologique, facilitant ainsi une analyse approfondie du mécanisme d’interaction entre les îlots et les cellules acinaires. Isolement des îlots pancréatiques et des cellules acinaires pancréatiques (PAC). Ajoutez la solution salée équilibrée de Hank et la solution de collagénase P à la plaque à 12 puits et ajoutez trois millilitres de solution de collagénase P dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres pour une digestion ultérieure.

Anesthésiez la souris avec du tribromoéthanol à 1,25 % avant l’opération, suivie d’une euthanasie. Réaliser une incision abdominale en V pour ouvrir la cavité abdominale de la souris. L’organe lymphoïde rouge foncé dans la région hypocondriaque gauche est la rate, et l’organe blanc attaché à la rate est le pancréas.

Effectuez soigneusement une dissection contuse du pancréas le long du bord inférieur de l’estomac et de la jonction pancréaticoduodénale. Lavez le tissu pancréatique isolé dans la solution salaire équilibrée de Hank et retirez les attaches mésentériques résiduelles, la rate et le tissu adipeux péripancréatique. Déplacez le pancréas pré-traité sur une plaque à 12 puits pré-ajoutée avec deux millilitres de solution de collagénase P.

Maintenez le pancréas en place avec une pince à épiler de la main gauche et utilisez une seringue d’un millilitre avec la main droite pour injecter la solution de collagénase P dans le parenchyme pancréatique jusqu’à ce que le tissu pancréatique paraisse translucide et œdématose. Coupez rapidement le pancréas en morceaux de tissu cubés d’un à deux millimètres avec des ciseaux chirurgicaux. Coupez la pointe distale à 1,5 centimètre d’une pointe de pipette d’un millilitre pour agrandir l’ouverture, et utilisez cette pointe modifiée pour transférer les morceaux de tissu pancréatique ensemble avec deux millilitres de solution de collagénase P dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres préchargé de trois millilitres de solution de collagénase P.

Incubez le tube de centrifugeuse dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes, en secouant doucement le tube toutes les cinq à six minutes pendant cette période. Ajoutez 10 millilitres de milieu complet RPMI 1640 pour mettre fin à l’effet digestif de la solution de collagénase P. Pipettez le pellet à répétition avec une pipette Pasteur de cinq millilitres, 15 à 20 mouvements de montée et descente, jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros amas de tissu visibles.

Ajoutez 10 millilitres de RPMI 1640 full medium. Ensuite, centrifugez à 180 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Et jetez le surnageant : Resuspendez la boule avec 20 millilitres de média complet RPMI 1640.

Filtrez la suspension à travers un tamis à 40 mailles. Ensuite, centrifugez à 180 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Écartez doucement le surnageant.

Ajoutez 20 millilitres de solution Ficoll pour resuspendre le pellet. Ensuite, ajoute lentement 15 millilitres de RPMI 1640 full medium. À ce stade, une interface liquide claire peut être observée.

Centrifugez doucement à 640 fois G pendant 20 minutes à 25 degrés Celsius. Retirez soigneusement le tube de centrifugeuse et aspirez la couche supérieure de médium rouge à l’aide d’une pipette Pasteur de cinq millilitres. Ensuite, aspirez soigneusement les îlots contenant le liquide à l’interface de la couche liquide et transférez-le dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres.

Ajoutez 20 millilitres de RPMI 1640 full medium. Centrifugez à 180 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant. Resuspendez le plomb avec 20 millilitres de médium complet RPMI 1640.

Centrifugez à 180 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant. Resuspendez le pellet avec 10 millilitres de médium complet RPMI 1640. Et transférez-le dans une boîte de culture cellulaire de 60 millimètres.

Sous un microscope biologique inversé avec un grossissement de 100 fois, choisissez manuellement les îlots à l’aide d’une pipette de 20 microlitres. Transférer les îlots sélectionnés sur une plaque de culture cellulaire de 24 puits préchargée de 500 microlitres de milieu complet RPMI 1640 par puits. Écartez la couche de solution de Ficoll.

Resuspendez la pastille avec 10 millilitres de milieu complet DMEM. Filtrez à travers une passoire de cellules de 100 micromètres. Centrifugez à 180 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Et jetez le surnageant. Resuspendez la pastille avec 10 millilitres de milieu complet DMEM. Centrifugez à 180 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.

Ensuite, resuspendez la pellete avec cinq millilitres de milieu complet DMEM pour les expériences suivantes. Après centrifugation par gradient de densité de solution de Ficoll, des îlots ont été observés près de l’interface entre la couche liquide transparente et incolore et le milieu avec des paquets présents sous forme de sédiments au fond du tube. Les îlots étaient généralement ronds ovales, brun doré, avec un rendement stable de 120 plus ou moins cinq par souris, figures A et B. Les PACs fraîchement isolés étaient sphériques et regroupés.

Les cellules acinaires présentaient des extrémités apicales plus foncées avec des granules de zymogène visibles et un rendement était de 1,6 à 1,95 fois 10 à la septième cellule de puissance par souris, Figure C et Figure D. La coloration PI des îlots et des cellules acinaires de la clacéine montre que la plupart des cellules sont colorées en calcéine verte, vivante, et quelques PI rouges, mortes, Figure A. L’analyse quantitative basée sur l’image J révèle que les îlots isolés et les cellules acinaires ont des taux de viabilité de 97,52 plus ou moins 0,16 % et 96,55 plus ou moins 0,95 % respectivement, Figure B. Cellules acinaires pancréatiques isolées, une activité basale de l’amylase de 0,79 plus ou moins 0,01 unité par millilitre. Après stimulation avec 10 nanomolaires, 20 nanomolaires et 50 nanomolaires céruléines, leurs activités amylases étaient respectivement de 1,45 plus ou moins 0,03 unité par millilitre, 1,65 plus ou moins 0,05 unité par millilitre, et 1,39 plus ou moins 0,02 unité par millilitre respectivement. L’ANOVA uniway a montré que tous les groupes de céruléine présentaient une activité amylase significativement différente par rapport au groupe témoin, toutes les valeurs P inférieures à 0,001.

De plus, le groupe des 20 nanomolaires différait significativement du groupe des 10 nanomolaires, valeur P inférieure à 0,001, figure A. Îlots isolés à une sécrétion d’insuline de 0,27 plus ou moins 0,04 nanogramme par millilitre par îlot par heure lorsqu’ils étaient stimulés avec 5,6 millimolaires de glucose et 0,94 plus ou moins 0,04 nanogramme par millilitre par îlot par heure avec 22 millimolaires de glucose, GSI est égal à 3,44, Figure B. Cette étude a établi une méthode d’isolement simultané des îlots primaires de souris et des cellules acinaires pancréatiques sans perfusion complexe in vivo. Avec une longue barrière technique, la méthode est facile à utiliser, produisant 120 îlots plus ou moins 5 et 1,6 à 1,95 fois 10 à la septième puissance par souris, les deux types cellulaires montrant un taux de viabilité supérieur à 96 %. Les îlots isolés présentent une sécrétion normale d’insuline stimulée par le glucose et les cellules acinaires sont sensibles à la stimulation de la céruléine. Cela confirme que les cellules obtenues par cette méthode ont des fonctions intactes, les rendant adaptées à des études sur les interactions exocrines pancréatiques et endocriniennes.

Cependant, la méthode est limitée par la nécessité de connaissances basiques en anatomie de la souris, l’exigence d’ajustements de dosage des réactifs, les restrictions sur le nombre de souris traitées simultanément, et le risque d’application non validée. Il reste un protocole d’isolement cellulaire fiable pour les chercheurs manquant d’expérience en perfusion.