Évaluation de la mécanique de l'appareil respiratoire chez les souris en utilisant la technique d'oscillation forcée

L’objectif global de cette procédure est de démontrer les mesures d’oscillation forcée de la mécanique respiratoire chez la souris à l’aide de l’événement de flexion, un ventilateur à piston commercial contrôlé par ordinateur. Cela se fera par l’évaluation de la réactivité des voies respiratoires à la méthylcholine inhalée. La première étape consiste à préparer les réactifs requis, l’équipement et le sujet.

Ensuite, le sujet est connecté au ventilateur pour des mesures de ventilation mécanique et de mécanique respiratoire. À l’aide d’un script prédéfini, une collection de mesures automatisées hautement contrôlées est effectuée au départ et après la provocation de la méthylcholine. L’analyse des résultats peut montrer une hyperréactivité des voies respiratoires, comme en témoignent les réponses maximales plus importantes de résistance et d’élastine chez les souris exposées au chlore par rapport aux sujets témoins.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle fournit un outil précis permettant de mesurer la fonction pulmonaire de manière complète, détaillée et translationnelle. Ceci est accompli par l’analyse des signaux de pression et de volume acquis en réaction à des formes d’onde de flux d’air oscillatoires prédéfinies appliquées à l’ouverture des voies respiratoires du sujet. De plus, de nombreux facteurs qui influencent la réponse physiologique peuvent être contrôlés et standardisés.

À l’aide de cette méthode, activez le système Flex event FX et démarrez le logiciel. Le présent protocole s’applique à l’une ou l’autre des deux générations d’événements flex prises en charge par flexi. Portez sept logiciels lors de la première session d’expérimentation ou à tout moment avant celle-ci Ouvrez le module de définition et de planification de l’étude pour prédéfinir la structure de l’étude.

Cliquez sur le bouton Créer une nouvelle étude et suivez l’assistant pour créer une étude. Définir le protocole et définir les groupes d’expérimentation et les sujets à étudier. Lancez une session d’expérimentation en ouvrant le module de session d’expérimentation et en suivant la séquence de démarrage.

Pour l’étude et la sélection de modèles. Attribuez un sujet au site de mesure et confirmez son poids. Procédez à l’étalonnage du système en suivant les étapes décrites dans le logiciel d’exploitation.

Il est demandé de fixer la canule à utiliser sur le tube en Y pour l’étalonnage. Poursuivez l’étalonnage de la canule en suivant les étapes de l’assistant d’étalonnage et vérifiez que les valeurs d’étalonnage obtenues se situent dans la plage spécifiée. Si nécessaire, répétez le processus d’étalonnage jusqu’à ce qu’il soit prêt, annulez les invites pour démarrer la ventilation et l’enregistrement des données.

Ceux-ci peuvent être initiés ultérieurement. Anesthésier le sujet à l’aide de doses appropriées d’agents anesthésiques. Vérifiez que le sujet a atteint un niveau d’anesthésie chirurgical.

Le sujet ne doit montrer aucune réaction à un pincement d’orteil et sa respiration doit être régulière et non laborieuse. Positionnez l’animal en décubitus dorsal avec une source de chaleur pour maintenir une température corporelle appropriée. Une ampoule de 60 watts placée à 45 centimètres de la souris est suffisante.

Nettoyez ensuite la région de la gorge avec de l’alcool pour exposer la trachée. Faites une incision et séparez doucement la glande sous-maxillaire et la couche musculaire qui la recouvre. Soulevez doucement la trachée à l’aide d’une paire de micro-pinces.

Passez ensuite une suture en dessous. Coupez entre les deux anneaux de cartilage les plus proches du larynx. Cela fait une petite incision dans la trachée sans la sectionner.

Insérez la canule calibrée dans l’incision et avancez-la doucement à travers cinq anneaux trachéaux. Dans cet exemple, une canule métallique de calibre 18 de 1,2 centimètre est en fonctionnement. Il est essentiel de sécuriser la canule à l’aide de la suture.

L’accessoire doit former un joint étanche à l’air autour de la canule. Approchez l’animal canulé du ventilateur. Démarrez la ventilation mécanique en sélectionnant un profil de ventilation prédéfini ou personnalisé dans le docker de ventilation.

Connectez maintenant l’animal au ventilateur via le tube en Y. Alignez soigneusement l’animal sur le ventilateur et assurez-vous que la canule trachéale est au même niveau que le ventilateur. Cela permet d’éviter une éventuelle canule, une occlusion ou une torsion trachéale dans le logiciel.

Exécutez une perturbation de gonflage profonde en double-cliquant sur le nom de la perturbation pour vérifier l’insertion et la fixation de la canule. À moins qu’il n’y ait une fuite, le système maintiendra une pression de 30 centimètres d’eau sur une période de trois secondes sans déplacement de volume excessif. Les traces de volume et de pression enregistrées doivent être lisses et ne présenter aucun signe de décalage ou de déformation.

Sinon, il peut y avoir une canule, une obstruction ou un mauvais placement à ce stade. Des transducteurs de signes vitaux pour la surveillance de la fréquence cardiaque et de la température corporelle peuvent être connectés si nécessaire. L’enregistrement des données de ces signaux peut être lancé à tout moment, manuellement ou automatiquement via un script.

Les mesures ou les commandes pour l’activation du nébuliseur, les marqueurs d’événements, etc., peuvent être automatisées à l’aide de scripts prédéfinis ou personnalisés pour un processus expérimental hautement contrôlé et reproductible. Six familles de perturbations donnant lieu à un certain nombre de paramètres peuvent être utilisées pour décrire la mécanique du système respiratoire sujet au départ et à la suite d’un défi donné. Lorsque vous êtes prêt à commencer à prendre des mesures, il est important d’exécuter d’abord la perturbation de gonflage profond pour recruter les zones pulmonaires fermées et normaliser l’historique du volume pulmonaire

Ensuite, vérifiez l’absence d’efforts inspiratoires spontanés en effectuant une mesure de test. Observez les traces du signal de pression dans la vue du jeu de données sélectionné. Avec courbes PV par étapes.

Les plateaux de pression doivent être bien définis, sans déviations vers le bas. Une variation de pression vers le bas indiquerait un effort inspiratoire de la part de l’animal. Lancez maintenant le script pour l’évaluation de la réactivité des voies respiratoires à la méthylcholine inhalée en double-cliquant sur son titre.

Dans cet exemple, le script effectue une séquence de mesures de référence en trois exemplaires. Ensuite, il y a une invite pour charger le nébuliseur avec du sérum physiologique. Ou dans cet exemple, une solution de méthylcholine charge environ 100 microlitres de solution dans le nébuliseur.

La nébulisation démarrera automatiquement dès que les informations seront saisies dans le logiciel. Peu de temps après la fin de la nébulisation, une séquence de mesures rapprochées est initiée pendant environ trois minutes. Ensuite, une invite à effectuer.

Un autre défi est fourni et la séquence des mesures peut être répétée entre les défis. Le séchage de l’intérieur du support du nébuliseur à l’aide d’un écouvillon peut aider à empêcher l’accumulation de gouttelettes ou de condensation dans la ligne inspiratoire. Au fur et à mesure que les données sont collectées, le logiciel calcule les paramètres associés à la perturbation et fournit un coefficient de détermination basé sur l’ajustement des données au modèle.

Plus tard, l’expérience est accessible via le module d’examen et de rapport du logiciel pour exporter ou analyser davantage les données. À la fin de l’expérience, arrêtez la ventilation et détachez le sujet. Une fois détaché, euthanasier rapidement l’animal avec une surdose de pentobarbital sodique, puis un lavage broncho-alvéolaire peut être effectué ou les poumons peuvent être isolés pour une analyse plus approfondie.

Avant de passer au sujet suivant, rincez et séchez l’adaptateur du nébuliseur y tube et canule. Passez au sujet suivant dans le logiciel d’exploitation et confirmez son poids. Procédez ensuite aux étapes d’étalonnage suggérées avant de poursuivre l’expérience.

En fin de journée, rincez et séchez le matériel. N’oubliez pas, avant de clore la session expérimentale, de nettoyer également la valve expiratoire du système conformément aux instructions du fabricant afin de maintenir les performances de votre système. Les exemples suivants représentent une sélection de résultats typiques d’expériences sur des souris naïves et exposées au chlore, des résultats équivalents de naïves aj.

Les souris ont été obtenues au départ et après une constriction bronchologique induite par la méthylcholine en utilisant l’une des deux générations d’événements de flexion soutenues par l’usure flexible sept. Étant donné que les mesures FOT à large bande permettent de partitionner la réponse pulmonaire en paramètres des voies respiratoires et du tissu parenchymateux, elles fournissent un moyen d’identifier les régions pulmonaires affectées. Par exemple, des souris AJ naïves ont montré une augmentation de la résistance de base lorsque la pression expiratoire finale était augmentée de trois à neuf centimètres d’eau.

La modification de la pression expiratoire finale a entraîné une diminution de la résistance des voies respiratoires compatible avec les effets bronchodilatateurs d’un volume pulmonaire plus élevé et d’une pression de gonflage plus élevée, ainsi qu’une augmentation de l’amortissement tissulaire, un paramètre étroitement lié à la résistance tissulaire qui reflète la viscoélasticité des tissus et peut-être la résistance des petites voies respiratoires. Ce dernier est connu pour augmenter avec l’augmentation du volume pulmonaire. Ce protocole est souvent utilisé pour évaluer la réactivité des voies respiratoires à la méthylcholine inhalée après une exposition au chlore gazeux.

Les souris B.SEA ont montré une hyperréactivité des voies respiratoires par rapport aux témoins exposés à l’air. Dans le présent exemple, les souris exposées au chlore gazeux ont montré des réponses maximales plus importantes à tous les paramètres FOT. Ces souris ont également montré un décalage statistiquement significatif vers la gauche de la courbe de réponse de la concentration ou une hypersensibilité à la méthylcholine inhalée, ce qui est illustré par une réduction de la concentration de méthylcholine nécessaire pour provoquer un doublement de la résistance et de l’élastine.

En plus de FOT, le système d’événements flexibles peut enregistrer d’autres mesures telles que les courbes de volume de pression. La partie supérieure du limbe de déflation est ajustée à l’équation de Salazar Knolls, et les paramètres associés sont calculés par le logiciel. Afin de réussir cette technique, il est important de prêter attention à chaque étape d’une importance particulière : le calibrage du système, la résistance de la canule endotrachéale, le positionnement de l’animal et la standardisation des volumes pulmonaires.

Si ces étapes sont suivies avec précision, cette méthode vous fournira une caractérisation précise des propriétés mécaniques du poumon de souris.