Électrotaxie microfluidique à base d'analyse quantitative à la demande de

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des anomalies dans la signalisation neuronale et neuromusculaire chez l'organisme modèle C Allergan après exposition chimique ou manipulation génétique. Cela est réalisé en concevant et en gravant tout d'abord un motif de microcanaux dans une plaquette de silicium. Lors de la deuxième étape, le moule en silicium est utilisé pour mouler un ou plusieurs microcanaux en PDMS.

Ensuite, des composants accessoires sont fixés au moule en PDMS. Puis, le comportement des vers lorsqu'ils sont stimulés pour nager à travers le microcanal est enregistré à l'aide d'une caméra montée sur un microscope. Enfin, l'électro-microfluidique est utilisée pour déterminer les modifications des systèmes neuronal et musculaire des nématodes induites par des manipulations chimiques ou génétiques, la locomotion servant de paramètre de mesure.

Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes, en particulier les tests comportementaux basés sur des plaques, est qu'elle permet de contrôler précisément la direction de la locomotion du ver, ce qui rend possible une quantification exacte de comportements locomoteurs tels que la fréquence des courbures corporelles, le temps de rotation et la vitesse de nage. Les implications de cette technique s'étendent au traitement des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson et celle d'Alzheimer, car elle peut être utilisée pour cribler des facteurs chimiques et génétiques possédant des propriétés neuroprotectrices. Nous avons eu l'idée de cette technique lorsque nous avons réalisé qu'il existait un manque de méthode permettant d'analyser le comportement de déplacement de manière quantitative.

Le mouvement est volontaire et aléatoire, et il est difficile à caractériser. Nous souhaitions donc établir une méthode simple que tout le monde puisse apprendre. Pour fabriquer le moule principal, commencez par plonger une plaquette de silicium de trois pouces dans l'acétone, puis dans le méthanol, pendant 30 secondes chacun. Rincez ensuite la plaquette avec de l'eau déionisée pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez un pistolet à air azoté pour sécher la surface des plaquettes, puis chauffez la plaquette sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius après deux minutes ; oxydez ensuite la surface de la plaquette de silicium par plasma à 50 watts pendant une minute. Appliquez maintenant trois millilitres de résine photosensible SU-8 100 sur la surface de la plaquette par centrifugation à 1 750 tr/min pendant 40 secondes, puis effectuez un pré-cuisson de la plaquette recouverte sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius. Après 10 minutes, augmentez la température jusqu'à 95 degrés Celsius en deux minutes et faites cuire la plaquette pendant une heure supplémentaire.

Après avoir retiré la plaquette du plateau chauffant, positionnez un masque photolithographique présentant le motif souhaité au-dessus de la plaquette. Exposez la résine photosensible à une lumière UV pendant 95 secondes. Ensuite, effectuez une cuisson postérieure de la plaquette sur un plateau chauffant en utilisant le même gradient de température que celui utilisé pour la cuisson préalable après la cuisson postérieure.

Immergez la plaquette dans le SU huit. Préparez une solution pendant 10 à 15 minutes. Rincez la plaquette avec de l'isopropanol pour confirmer l'achèvement du développement du motif.

Ensuite, rincez à l’eau déionisée pendant 30 secondes. Enfin, séchez la plaquette à l’aide d’un pistolet à azote et faites-la chauffer brièvement à 120 degrés Celsius. Placez maintenant le moule maître fabriqué ainsi qu’une plaquette de silicium vierge dans deux boîtes de Pétri distinctes, chacune doublée de papier d’aluminium.

Verser 20 millilitres de prépolymère de PDMS dans le moule maître et dans le plat du wafer témoin, et 15 millilitres dans le plat du wafer vierge. Ensuite, appuyer délicatement sur les wafers à l’aide d’un applicateur en bois jetable afin d’éliminer toute poche d’air située sous les wafers, puis couvrir les deux plats et les laisser reposer pendant une journée pour polymériser. Une fois les wafers polymérisés, retirer la feuille d’aluminium et décoller le PDMS.

Ensuite, utilisez un poinçon Harris de 2,5 millimètres pour percer des orifices d'accès au fluide aux deux extrémités du canal dans le PDMS provenant du moule maître. Découpez les deux disques de PDMS en bandes de taille similaire. Puis, en salle blanche, insérez le canal, la bande de PDMS vierge et une lame de verre dans un oxydeur à plasma.

Exposer les matériaux à un plasma d'oxygène à une puissance de 40 watts pendant 40 secondes. Ensuite, fixer la pièce du canal et la lame de verre sur des côtés opposés de la bande vierge et mettre les matériaux de côté pour permettre l'achèvement de l'adhésion. Après deux heures, utiliser le prépolymère de PDMS pour fixer deux morceaux de tube en plastique d'au moins six pouces de long sur les réservoirs perforés, à l'aide d'un bloc chauffant à 120 degrés Celsius.

Laisser durcir le PDMS avant de continuer. Ensuite, fixer un connecteur en plastique pour fluides à l'une des tubes afin de permettre l'attachement de seringues. Insérer maintenant des morceaux de 7,62 cm de fil de cuivre isolé de calibre 22 dans chaque réservoir entre le tube d'entrée et le canal, en fixant les fils avec du prépolymère de PDMS supplémentaire.

Commencez cette étape en plaçant le microcanal fraîchement assemblé sur une platine mobile XY d'un microscope équipé d'une caméra reliée à un moniteur, puis connectez l'alimentation électrique aux électrodes du microcanal. Après avoir confirmé que la résistance du microcanal est d'environ 0,6 mégohm, reliez le tube de sortie du microcanal à une seringue jetable. Ensuite, immergez l'embouchure du tube d'entrée dans une solution de nématodes en suspension dans du tampon physiologique M neuf.

Appliquez une pression négative à l'intérieur de la seringue pour aspirer le liquide dans le canal. Lorsque les tubes d'entrée et de sortie sont tous deux remplis, déconnectez la seringue et utilisez la pression hydrostatique. Manipulez l'écoulement en ajustant la hauteur relative des tubes afin de positionner un ver au centre du canal.

Ensuite, placer les deux tubes à plat et à la même hauteur afin de maintenir un débit nul dans le microcanal. Lors du changement d'échantillons de vers pendant une expérience de galvanotaxie, après avoir mis les deux tubes d'entrée à la même hauteur, s'il subsiste un écoulement, effectuer de légers ajustements de la hauteur des tubes les uns par rapport aux autres. Si l'on doute à un moment donné que le débit soit réellement nul, on peut induire une inversion du mouvement du ver en changeant la polarité du champ électrique, puis évaluer la vitesse linéaire du ver pendant son demi-tour.

Réglez maintenant l'alimentation électrique à la tension appropriée. Activez le signal électrique et laissez une minute de pré-exposition afin que le ver s'acclimate au champ ; durant cette période, le ver devrait commencer à se déplacer vers la cathode. Une fois la minute écoulée, commencez l'enregistrement.

Lorsque l'expérience est terminée, retirez tous les liquides et les vers du canal. Rincez la chambre avec de l'eau déionisée et laissez l'appareil sur une plaque chauffante à 125 degrés Celsius pour le sécher. Dans cette vidéo représentative, un nématode adulte jeune de type sauvage en électro-axe et ses sorties de position et de vitesse issues du logiciel de suivi des vers sont montrés.

La vidéo commence avec la cathode à droite. L'apparence de la pipette en verre indique l'inversion imminente ; la disparition ultérieure du signal de la pipette marque le moment de l'inversion. À cet instant, les données de position en fonction du temps et de la vitesse instantanée en fonction du temps, issues du programme personnalisé de suivi du ver, sont affichées pour le ver présent dans la vidéo. Le programme a calculé la courbe de vitesse à partir de la courbe de position en fonction du temps.

Ce diagramme en boîte présente les données de vitesse électrokinétique provenant d'un ensemble d'animaux de type sauvage et d'animaux transgéniques. Les animaux transgéniques de type T expriment le gène humain de l'alpha-synucléine dans les muscles de la paroi corporelle sous le contrôle du promoteur du gène de la chaîne lourde de myosine UNC-54, ce qui provoque une agrégation protéique et se manifeste par une réponse électrotactique plus lente que celle des animaux de type sauvage. Une fois maîtrisée, plus de 20 vers peuvent être analysés chaque heure si l'expérience d'électrotaxie est correctement réalisée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que seules les mutations et les substances chimiques affectant la locomotion ou la sensibilité électro-sensorielle produiront des phénotypes détectables par le test de l'électrotaxie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment structurer un motif sur du silicone, comment assembler un canal microfluidique et comment analyser la locomotion de N. methodus à l’aide d’un test axxial.