En utilisant un dispositif microfluidique pour une Stimulation mécanique et l’imagerie haute résolution de c. elegans

L’objectif global de cette technique est de mesurer comment les nématodes et leurs neurones réagissent à des stimuli mécaniques externes à l’aide d’une puce microfluidique équipée d’actionneurs de pression. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines de la mécanobiologie et de la biologie sensorielle, telles que la façon dont les cellules, les tissus et les animaux réagissent à la stimulation mécanique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit suffisamment la mobilité du ver de manière non invasive pour permettre une imagerie à haute résolution tout en ayant accès à la cuticule du ver pour la stimulation mécanique.

Cette méthode peut également être utilisée pour étudier l’influence des indices mécaniques sur le développement. Il pourrait même être appliqué à d’autres systèmes tels que l’exponse d’organes ex vivo ou d’autres animaux de taille similaire à C. Elegans. Mettre en place un système de microscope pour l’excitation simultanée de GCaMP et RFP.

Une option est une source lumineuse discrète qui ne transmet que la lumière cyan et jaune. Pour la visualisation, utilisez un objectif 10x et un objectif à fort grossissement. Envoyez également l’image à un ordinateur via un appareil photo numérique.

Ensuite, incluez un cube de fluorescence et, si nécessaire, un filtre d’excitation. Ajoutez au cube un miroir dichroïque qui réfléchit la lumière cyan et jaune et transmet la lumière verte et rouge. Installez un séparateur de faisceau avec un miroir dichroïque passe-long avec une coupure à 570 nanomètres.

Prévoyez également un filtre d’émission passe-bande pour la lumière verte à 525 nanomètres avec une largeur de 50 nanomètres et un filtre d’émission passe-bande pour la lumière rouge à 632 nanomètres avec une largeur de 60 nanomètres. Projetez les deux faisceaux dans le champ de vision de la caméra. Assurez-vous que la partie verte est projetée dans la moitié supérieure de l’écran et la partie rouge vers le bas.

Utilisez toujours des puces microfluidiques de moins d’un mois. Pour la configuration, chargez d’abord le réservoir à écoulement par gravité avec du M9 filtré. Positionnez le réservoir à environ 60 centimètres au-dessus de la puce et connectez-le à une sortie de puce. Ensuite, connectez l’autre sortie à un conteneur à déchets avec deux entrées, et connectez la deuxième entrée au conteneur à déchets à une pompe péristaltique.

Effectuez toutes les connexions avec des tubes en polyéthylène. Ensuite, assemblez des interconnexions, des longueurs de tube de 50 millimètres avec des connecteurs de tube métallique aux deux extrémités. Press-Fit et interconnectez-vous sur chacun des six doigts d’actionnement et dans l’entrée de la vis sans fin.

Maintenant, positionnez la puce sous l’optique. Assurez-vous de laisser les interconnexions attachées à la puce car le PDMS s’usera rapidement avec des manipulations répétées. Il est essentiel que l’actionneur PDMS et le tube reliant la puce au réservoir d’air soient correctement scellés pour assurer un bon actionnement chromatique de la membrane.

Avant de charger les animaux, vérifiez la perte de pression dans la puce microfluidique. Mesurez la déflexion de la membrane en effectuant plusieurs cycles d’actionnement à la pression souhaitée. Ensuite, comparez les valeurs quantitatives avec les prédictions théoriques.

Si les valeurs mesurées ne sont pas celles attendues, vérifiez qu’il n’y a pas de fuites dans le tube ou les connecteurs de tube. Le PDMS peut également avoir une élasticité différente en raison d’un rapport alternatif entre le polymère de base et l’agent de durcissement, ou la masse du peut être ancienne et excessivement réticulée. Avoir préparé des C. elegans synchronisés selon l’âge des jeunes adultes ou des adultes du premier jour, tels que décrits par Porta-de-la-Riva et compagnie dans leur publication Jove de 2012.

Maintenant, choisissez deux à cinq jeunes adultes ou des hermaphrodites d’un jour. Il est essentiel de choisir des animaux de la bonne taille. Les petits animaux ne seront pas piégés dans le canal, et les animaux trop gros seront difficiles à retirer et peuvent obstruer l’appareil.

Tirez les vers cueillis dans une goutte de M9 filtré. Ensuite, aspirez-les dans une longueur de tube à l’aide d’une seringue d’un millilitre sans les tirer dans le corps de la seringue lui-même. Ensuite, connectez le tube à l’interconnexion à l’entrée de la vis sans fin de la puce. Ensuite, activez l’écoulement par gravité en ouvrant la vanne du réservoir et en démarrant la pompe.

Maintenant, observez le canal de piégeage à un grossissement de quatre fois et poussez doucement les animaux dans l’appareil. Après avoir chargé les animaux dans la chambre d’attente, utilisez le piston pour faire couler doucement l’un d’entre eux vers l’avant du canal de piégeage de sorte que sa tête entre dans la forme effilée du canal. Si le ver ne remplit pas toute la section transversale du canal du nez jusqu’à l’extrémité du corps, retirez le ver.

Souvent, les vers trop petits traversent directement la puce sans être piégés. Si un animal qui s’est coincé dans le canal de piégeage doit être retiré, il suffit d’appuyer sur le piston de la seringue jusqu’à ce que le ver disparaisse du canal, puis de charger un nouveau ver. Une fois qu’un ver est correctement chargé, passez en mode fluorescence et augmentez le grossissement.

Pour éviter la saturation, assurez-vous d’ajuster l’intensité de l’excitation en fonction de l’intensité de la fluorescence. Vérifiez si le neurite d’un neurone d’intérêt se trouve à travers le diaphragme de l’un des actionneurs. Cet actionneur doit également être antérieur au corps cellulaire du neurone.

Si ce n’est pas le cas, ajustez la position de l’animal en tirant ou en poussant sur le piston. Si cela ne résout pas le problème, retirez le ver et chargez-en un nouveau. De plus, s’il y a de l’autofluorescence autour du neurone, remplacez le ver.

Une fois qu’un ver est correctement chargé, concentrez-vous sur le corps cellulaire du neurone d’intérêt, puis déterminez de quel actionneur se trouve la puce sur sa face antérieure et connectez cet actionneur à la pompe de pression programmable à l’aide de l’interconnexion associée. Si l’expérience nécessite de mesurer la distance entre l’actionneur et le neurone, placez les deux dans le champ de vision avec la paroi du canal parallèle aux bords supérieur et inférieur de l’image. Ensuite, définissez un protocole de pression à l’aide de la pompe à pression programmable.

Commencez toujours par prendre au moins 50 images à zéro kilopascals pour définir une ligne de base. Ensuite, programmez la forme d’onde et la pression du stimulus. Maintenant, exécutez le protocole d’imagerie et de pression.

Lors de l’enregistrement, le neurone d’intérêt doit être le point le plus brillant dans une zone de 10 pixels carrés. Il ne peut pas se déplacer de plus de 10 pixels dans deux images séquentielles, et il doit rester dans le champ de vision. Pendant l’enregistrement, vous pouvez observer des changements dans l’intensité de la fluorescence lorsque la pression et les actionneurs changent.

Cela indique une stimulation réussie des neurones. Entre les stimuli, incluez 10 secondes à une pression constante de zéro kilopascal. Il est possible d’enregistrer simultanément des signaux provenant de plusieurs neurones dans le champ de vision, à condition qu’ils soient séparés d’au moins 10 pixels pendant toute la durée de l’enregistrement.

Pour garder les vers pour une étude plus approfondie, débranchez les sorties de la puce vers l’écoulement par gravité et le conteneur à déchets. Ensuite, appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que toute la vis sans fin soit poussée à travers le canal de piégeage dans le canal d’écoulement, et continuez à appuyer sur le piston jusqu’à ce que l’animal apparaisse dans une gouttelette à l’extérieur de la puce. Maintenant, débranchez la seringue avec le tube et aspirez le ver dans la gouttelette sur une plaque de gélose.

Pour retirer et sacrifier un ver dans le canal, appuyez sur le piston jusqu’à ce que tout le ver soit poussé à travers le canal de piégeage et dans le canal d’écoulement. Ensuite, la vis sans fin s’écoulera hors de la puce et dans le conteneur à déchets. Après la mise en place de la puce microfluidique, la déviation du diaphragme a été testée.

Les valeurs mesurées étaient reproductibles avec une légère variation ne dépassant pas un micron à 450 kilopascals de pression. Après avoir inséré les vers dans l’entrée de la puce, la peau d’un seul animal à l’intérieur du canal de piégeage a été présentée aux six actionneurs. Avec cette conception, le neurone PLM ne peut généralement pas être complètement immobilisé, de sorte qu’il peut se déplacer librement latéralement et verticalement.

Bien qu’il soit possible d’activer avec succès les neurones PLM, il est difficile d’enregistrer les transitoires calciques de ceux-ci en raison du mouvement de la queue. Une fois en place, l’animal a été stimulé à l’aide de l’un des six actionneurs positionnés pour délivrer des stimuli mécaniques à chacun des six TRN. L’un des trois stimuli différents de deux secondes a été présenté.

Une prise à 275 kilopascals, une rampe à 275 kilopascals ou un bourdonnement composé d’un sinus de 75 kilopascals à 10 hertz superposé au pas de 275 kilopascals. Des intervalles de 10 secondes sans pression séparaient les stimuli. Les rampes de pression et les paliers de pression n’activaient les TRN que si les stimuli atteignaient des pressions supérieures à 400 kilopascals, tandis que les stimuli bourdonnants activaient vigoureusement tous les TRN.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq minutes par ver. Il est important de se rappeler qu’une mauvaise étanchéité entre la puce et la lamelle, ou entre la puce et les interconnexions, entraînera une fuite et une défaillance de l’appareil. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie de tension ou l’administration ciblée de stimuli mécaniques à différents neurones peuvent être effectuées afin de caractériser la réponse mécanique des nocicepteurs.

De plus, comme les animaux peuvent être récupérés à la suite de cette procédure, la technique pourrait être utilisée pour dépister les mutants défectueux dans leur réponse aux stimuli mécaniques. N’oubliez pas que travailler avec des gaz comprimés et des produits chimiques peut être extrêmement dangereux. Prenez des précautions telles que porter des vêtements de protection individuelle et travailler avec des hottes si nécessaire pour éviter ces dangers.