Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d'imagerie par microscopie à fluorescence

L’objectif global de cette procédure est de créer des gradients adhésifs et solubles pour étudier la migration cellulaire. Ceci est accompli en passant d’abord une surface pour empêcher l’adhésion cellulaire non spécifique. La deuxième étape consiste à fabriquer des tampons à partir de l’impression par micro-contact.

Ensuite, la surface est tracée avec des lignes streptocociques par impression par micro-contact. Le din sanglé peut également être imprimé sous forme de points à l’aide d’une lithographie à plume fixée au bas d’un dispositif microfluidique. La surface modifiée servira de base à un gradient adhésif de biotine RGD.

La dernière étape consiste à charger les cellules sur la surface avec le signal adhésif en présence d’un gradient d’attractif de chimiothérapie soluble. En fin de compte, la microscopie à cellules vivantes est utilisée pour montrer la migration cellulaire en réponse à des signaux adhésifs et solubles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le transwell ou le test en chambre vide et une configuration microfluidique conventionnelle est que le système désintégré de motif de surface Le dispositif microfluidique permet l’observation des réponses cellulaires à des signaux adhésifs contrôlés dans l’espace et à un gradient adhésif et à un gradient soluble en même temps.

Eh bien, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la migration cellulaire, telles que l’importance de l’adhésion cellulaire et de provoquer un accident vasculaire cérébral entre les récepteurs de chimiothérapie Texas tels que les récepteurs couplés à la protéine G kinase et les récepteurs d’adhésion comme RIN To ate glass cover slips. Tout d’abord, nettoyez les lamelles en les immergeant dans un support dans de l’éthanol à 100 % et en plaçant le support dans un bain-marie pendant 30 minutes. Séchez les lamelles du couvercle en verre à l’air.

Ensuite, sonicez le couvercle en verre pendant 30 minutes dans une molaire d’hydroxyde de sodium. Ensuite, rincez les surfaces en verre en basculant soigneusement la grille dans un bécher rempli d’un litre et demi d’eau milli cube. Répétez le processus de rinçage trois fois avec de l’eau fraîche en millicube à chaque fois.

Après le troisième rinçage, séchez, le couvercle en verre se glisse dans un four à 60 degrés Celsius pendant environ une demi-heure. Placez la moitié des lamelles de couverture en verre propre individuellement dans une chambre humide composée d’une plaque à 24 puits, partiellement remplie d’eau. Les puits sont remplis d’eau et les lamelles de verre sont posées sur le dessus des puits pour l’ation, Un copolymère de polylysine et de polyéthylène glycol est utilisé dans lequel 20 % des molécules de cheville sont greffées à la biotine.

Abrégé en PLL Peg : déposez 15 microlitres de biotine PLL Peg dans du PBS sur chaque lamelle en verre. Prenez l’autre moitié des lamelles de verre propres restantes et prenez soigneusement en sandwich la solution PEG. Laissez les lamelles pendant une heure dans la chambre humide.

Après une heure de glissement, le couvercle pris en sandwich se détache doucement l’un de l’autre sans gratter la surface recouverte de PEG et rincez-les à l’eau UE. L’eau doit glisser facilement du côté traité de la cheville. Si besoin est.

Sécher à l’air libre, le couvercle en verre se glisse sur une serviette en papier, la surface traitée étant tournée vers le haut, rangez-la. Le couvercle en verre se glisse dans une dessiccation sous vide jusqu’à une utilisation ultérieure. Le master en silicium requis pour cette procédure est fabriqué par photolithographie pour couler le tampon A-P-D-M-S pour l’élastomère PDMS sur le Silicon Master à l’intérieur d’une boîte de Pétri à environ un centimètre de hauteur et durcir le mélange master et PDMS dans un four à 70 degrés Celsius pendant une heure.

Par la suite, le tampon PDMS est retiré du master Silicon et coupé à la taille voulue pour imprimer des motifs protéiques à l’aide de la technique d’impression par micro-contact et pour rendre les tampons PDMS plus hydrophiles en traitant le côté du motif dans un nettoyant UV et à l’ozone pendant une heure et demie immédiatement après le lieu de traitement à l’ozone. Et étalez 10 microlitres d’adin dénudé sur les tampons PDMS. Si les traces doivent être visibles au microscope fluorescent, utilisez de l’Aden dépouillé qui est conjugué à un quatre fluoré, comme l’avide dépouillé et le LOR trois 50.

Laisser reposer une heure dans une chambre humide. Retirez l’excès de streptocoque du timbre avec un mouchoir, du papier et de l’air. Séchez le tampon pendant environ une minute.

Appuyez légèrement le tampon sur la cheville PLL en verre revêtu de biotine. Si un streptocoque din fluorescent a été utilisé, examinez le motif au microscope à épifluorescence. Les motifs protéiques peuvent également être imprimés à l’aide de la lithographie à la plume.

Mélangez d’abord une partie d’un milligramme par millilitre, strippin ou avidan elif Fluor three 50 avec 10 parties de glycérol et chargez cinq microlitres du mélange sur le cantilever. Ajustez la vitesse d’impression. Temps de contact du porte-à-faux sur la surface ou une distance verticale du porte-à-faux par rapport à la surface pour réduire la taille du spot.

Environ cinq micromètres commencent le processus d’impression comme décrit dans le manuel d’utilisation du magasin d’instruments de lithographie à plume. Toutes les surfaces imprimées dans un dessiccation. Un dispositif microfluidique disponible dans le commerce est utilisé pour créer des gradients de surface.

Collez ce couvercle en verre enduit de tritine ou à motifs sur le côté collant de l’appareil pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite pendant plusieurs heures. Scellez les bords de l’appareil avec la fine couche de vaseline chauffée et avec une deuxième couche d’un mélange d’une partie de vaseline et d’une partie de cire de paraffine. Remplissez le canal de l’appareil avec six microlitres de PBS pour créer deux dégradés opposés.

Remplissez les deux réservoirs, l’un avec 70 microlitres de biotine, quatre fluorescéine et l’autre avec 70 microlitres de biotine conjuguée à l’acide spartique arginine glycine biotinylé ou RGD incubez les échantillons à température ambiante dans l’obscurité pendant une heure. Le rinçage de la biotine, du RGD et de la biotine du dispositif microfluidique est l’aspect le plus difficile de cette procédure car il y a un risque de piéger les bulles d’air et de perturber les pistes imprimées par micro-contact. Pour assurer le succès, la biotine et le PBS doivent être éliminés avec soin et lentement.

Retirez les solutions de biotine et rincez soigneusement la surface deux fois avec du PBS tout en restant attaché au dispositif microfluidique. Marquez la direction du gradient d’adhésif avant de charger les cellules marquées par fluorescence dans le dispositif microfluidique. Comptez les cellules et divisez-les en deux tubes de numéros de cellules égaux.

Laver et réuser. Suspendez un tube de cellules avec des milieux contenant l’attractif de chimiothérapie, tel que du DMEM à faible teneur en glucose avec lavage FBS à 10 % et l’autre tube de cellules dans des milieux. Sans l’attractif de chimiothérapie tel que le DMEM avec 0 % FBS, la concentration finale de cellules dans chaque tube devrait être de cinq fois 10 des cinquièmes cellules par millilitre.

Retirez toutes les solutions du dispositif microfluidique et placez-le sur le microscope de préchauffage. Charge étagée de 70 microlitres de cellules remises en suspension dans 0 %F-B-S-D-M-E-M dans un réservoir. Chargez 70 microlitres de cellules remises en suspension dans 10 % F-B-S-D-M-E-M dans un autre réservoir.

Placez du ruban adhésif sans serrer sur les réservoirs pour éviter l’évaporation. Assurez-vous que le canal du dispositif microfluidique est dans le champ de vision et que les cellules sont nettes. Sélectionnez les paramètres d’acquisition d’image tels que les temps d’exposition et les filtres fluorescents.

Séquence d’images en fond clair et en fluorescence que les cellules et les pistes ainsi que les points temporels et la durée d’enregistrement démarrent le programme d’acquisition d’images. Cette vidéo présente une méthode d’imagerie de cellules vivantes de cellules qui migrent dans un environnement avec des gradients adhésifs et solubles concurrents. Des pistes adhésives contenant une broche fluorescente et un RGD biotinylé ont été créées avec l’impression par micro-contact ou la lithographie à la plume.

Le profil de la ligne de l’intensité de fluorescence sur les pistes, où l’on distingue clairement les traces adhésives et les zones antifouling, indique la réussite de l’impression par microcontact. Les points imprimés avec la lithographie à la plume apparaissent arrondis et non en forme de déchirure, ce qui indique un processus d’impression réussi. Dans cet exemple, les points ont été imprimés sur une ligne avec une séparation des rangées et des colonnes définie sur 10 à 15 micromètres.

Cette distance est suffisante pour empêcher les points de se fondre les uns dans les autres, mais permet de visualiser plusieurs points dans un seul champ de vision. Avec la plupart des réglages de microscope, un Grady de repères adhésifs sur la piste imprimée a été créé avec le simple dispositif microfluidique. En chargeant de la biotine, de la quatre fluorescéine et de la biotine RGD dans les côtés opposés d’un panneau de chambre microfluidique.

A montre 60 images en mosaïque prises avec une longueur totale d’image de 3072 micromètres. Dans le panneau B, l’intensité de la fluorescence a été mesurée sur toute la longueur de la mosaïque. Des lignes de tendance linéaires ont été ajustées à l’intensité de fluorescence pour indiquer le gradient RGD dans le canal.

Après avoir retiré la solution de biotine, biotine RGD, la même chambre peut être utilisée pour introduire un gradient soluble. Le panneau A montre l’intensité fluorescente du colorant fluorescéine près des réservoirs remplis de PBS et de fluorescéine et à travers le canal à T égale zéro. Le panneau B montre l’intensité fluorescente des signaux solubles.

Après une incubation de 16 heures, les résultats comparables indiquent que le gradient était stable pendant au moins 16 heures. He, une migration cellulaire dans une chambre microfluidique avec des gradients opposés a été observée à l’aide de cette méthode et un film représentatif est montré ici. Le gradient d’adhésif a été immobilisé RGD sur des pistes de streptocoque avidan et le gradient soluble était de zéro à 10 % FBS.

Les images ont été prises toutes les 15 minutes pour un total de 20 heures. La transition d’image affichée est de huit images par seconde. Ce deuxième film est celui d’une seule cellule héliportée migrant vers la source FBS.

La transition d’image affichée est de huit images par seconde. La ligne bleue représentant la trajectoire de la cellule a été obtenue via un logiciel de suivi de cellule. Ce dernier graphique montre les trajectoires des cellules à partir des images du premier film.

Les trajectoires cellulaires qui ont migré vers la concentration plus élevée de FPS soluble sont représentées en noir. Ces trajectoires ont montré qu’un plus grand nombre de cellules hela migraient vers la source de l’attractif de chimiothérapie que vers des concentrations plus élevées de RGD adhérent. Bien qu’il soit important de se rappeler d’éviter l’évaporation du PBS ou des milieux dans le dispositif microfluidique pendant la préparation du gradient d’adhésif et l’imagerie du mode de vie, utilisez du ruban adhésif si nécessaire pour couvrir toutes les entrées du dispositif microfluidique Après cette procédure.

D’autres méthodes comme la transfection et la microscopie en solution hybride peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la biomécanique du cytosquelette agissant par les protéines, les protéines d’adhésion focale et les récepteurs lors de la migration cellulaire.