Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d'imagerie par microscopie à fluorescence

L'objectif général de cette procédure est de créer des gradients adhésifs et solubles afin d'étudier la migration cellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en passivant une surface pour empêcher l'adhésion cellulaire non spécifique. La deuxième étape consiste à fabriquer des matrices par impression en microcontact.

Ensuite, la surface traitée est dessinée avec des lignes de streptavidine par impression en microcontact. La streptavidine peut également être imprimée sous forme de points à l’aide d’une lithographie au stylo à pointe trempée, fixée à la face inférieure d’un dispositif microfluidique. La surface modifiée servira de base à un gradient d’adhésion de biotine RGD.

La dernière étape consiste à déposer des cellules sur la surface comportant le signal adhésif en présence d'un gradient soluble de chémotactisme. En fin de compte, une microscopie en temps réel sur cellules vivantes est utilisée pour montrer la migration cellulaire en réponse à des signaux adhésifs et solubles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les essais en transwell ou en chambre à vide, ou un dispositif microfluidique conventionnel, est que le système désintégré de motifs de surface d'un dispositif microfluidique permet d'observer simultanément les réponses cellulaires à des signaux adhésifs spatialement contrôlés, à un gradient adhésif et à un gradient soluble.

Eh bien, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la migration cellulaire, telles que l'importance de l'adhésion cellulaire et la cause de l'activation entre les récepteurs chimiotactiques, comme les récepteurs tyrosine kinase, les récepteurs couplés aux protéines G et les récepteurs d'adhésion tels que RIN. Pour commencer, nettoyez les lamelles en les plongeant dans un support rempli d'éthanol à 100 %, puis placez le support dans un bain ultrasonique d'eau pendant 30 minutes. Séchez les lamelles de verre à l'air.

Ensuite, soniquez les lamelles de verre pendant 30 minutes dans une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire. Par la suite, rincez les surfaces de verre en inclinant soigneusement le porte-lamelles dans un bécher rempli d'un litre et demi d'eau milli-Q. Répétez le rinçage trois fois en utilisant à chaque fois de l'eau milli-Q fraîche.

Après le troisième rinçage, sécher les lamelles de verre dans une étuve à 60 degrés Celsius pendant environ une demi-heure. Placer la moitié des lamelles de verre propres individuellement dans une chambre humide constituée d'une plaque de 24 puits partiellement remplie d'eau. Les puits sont remplis d'eau et les lamelles de verre sont posés au-dessus des puits pour l'immobilisation. Un copolymère de polylysine et de polyéthylène glycol est utilisé, dans lequel 20 % des molécules de PEG sont greffées à la biotine.

Abrégé en PLL Peg biotine : déposez 15 microlitres de PLL Peg biotine dans du PBS sur chaque lame de verre. Prenez l'autre moitié des lames de verre propres restantes et placez-les délicatement par-dessus la solution de PEG pour former un sandwich. Laissez les lames de verre pendant une heure dans la chambre humide.

Après une heure, faites glisser délicatement les lamelles l'une par rapport à l'autre sans rayer la surface revêtue de PEG, puis rincez-les avec de l'eau UE. L'eau doit s'écouler facilement du côté traité au PEG. Si nécessaire.

Laisser sécher à l'air les lamelles de verre sur une serviette en papier, la surface traitée étant orientée vers le haut. Conserver les lamelles de verre dans un dessiccateur sous vide jusqu'à utilisation ultérieure. Le moule en silicium nécessaire à cette procédure est fabriqué par photolithographie afin de mouler un tampon en A-P-D-M-S pour l'élastomère PDMS sur le moule en silicium à l'intérieur d'une boîte de Pétri sur une hauteur d'environ un centimètre, puis polymériser le moule et le mélange PDMS dans une étuve à 70 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, le tampon en PDMS est retiré du moule en silicium et découpé à la taille souhaitée pour imprimer des motifs de protéines. Utilisez d'abord la technique de micro-impression par contact pour nettoyer et rendre les tampons en PDMS plus hydrophiles, en traitant la face gravée dans un nettoyeur à UV et à ozone pendant une heure et demie. Immédiatement après le traitement à l'ozone, déposez et étalez 10 microlitres d'avidine dénudée sur les tampons en PDMS. Si les pistes doivent être visibles au microscope à fluorescence, utilisez de l'avidine dénudée conjuguée à un fluorophore, tel que l'avidine dénudée marquée par le colorant LOR trois 50.

Laisser une heure dans une chambre humide. Retirer l'excès de strep din du tampon avec un mouchoir en papier et de l'air. Sécher le tampon pendant environ une minute.

Appuyez légèrement le tampon sur la lamelle de verre revêtue de biotine et de PLL. Si de la streptavidine marquée au fluorochrome a été utilisée, examinez le motif au microscope à fluorescence épiscopique. Les motifs protéiques peuvent également être imprimés par lithographie à stylo-plume.

Mélangez d'abord une partie d'un milligramme par millilitre de streptavidine ou d'avidine dépourvue d'élifluor 350 avec 10 parties de glycérol, puis déposez cinq microlitres du mélange sur le levier. Ajustez la vitesse d'impression, le temps de contact du levier avec la surface ou la distance verticale du levier par rapport à la surface afin de réduire la taille du spot.

Environ cinq micromètres commencent le processus d'impression tel que décrit dans le manuel d'utilisation du magasin d'instruments de lithographie à stylo trempé. Toutes les surfaces imprimées sont placées dans un dessiccateur. Un dispositif microfluidique disponible dans le commerce est utilisé pour créer des gradients de surface.

Fixez ces lamelles en verre recouvertes ou imprimées de tritin sur le côté adhésif du dispositif afin de garantir l'absence de fuite pendant plusieurs heures. Scellez les bords du dispositif avec une fine couche de vaseline chauffée et avec une seconde couche composée d'un mélange d'une part de vaseline pour une part de cire de paraffine. Remplissez le canal du dispositif avec six microlitres de PBS afin de créer deux gradients opposés.

Remplissez les deux réservoirs, l'un avec 70 microlitres de biotine marquée à la fluorescéine et l'autre avec 70 microlitres de biotine conjuguée au peptide biotinylé arginine glycine acide aspartique ou RGD. Incubez les échantillons à température ambiante à l'abri de la lumière pendant une heure. Le rinçage de la biotine, du RGD et de la biotine marquée du dispositif microfluidique constitue l'aspect le plus délicat de cette procédure, car il existe un risque de piéger des bulles d'air et de perturber les pistes imprimées par microcontact. Pour garantir le succès, la biotine et le PBS doivent être éliminés soigneusement et lentement.

Retirez les solutions de biotine et rincez soigneusement la surface deux fois avec du PBS, tout en laissant celle-ci fixée au dispositif microfluidique. Marquez la direction du gradient d'adhésion avant de charger les cellules marquées par fluorescence dans le dispositif microfluidique. Comptez les cellules et répartissez-les en deux tubes contenant un nombre égal de cellules.

Lavez et resuspendez. Suspendez un tube de cellules dans un milieu contenant l'agent chimiotactique, comme le DMEM à faible teneur en glucose avec 10 % de FBS, puis lavez-le, et l'autre tube de cellules dans un milieu sans agent chimiotactique, tel que le DMEM avec 0 % de FBS. La concentration finale de cellules dans chaque tube doit être de cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre.

Retirer toutes les solutions du dispositif microfluidique et le placer sur le microscope préchauffé. Charger 70 microlitres de cellules resuspendues dans du DMEM contenant 0 % de FBS dans un réservoir. Charger 70 microlitres de cellules resuspendues dans du DMEM contenant 10 % de FBS dans un autre réservoir.

Placer une bande adhésive de manière lâche sur les réservoirs pour éviter l'évaporation. S'assurer que le canal du dispositif microfluidique est dans le champ de vision et que les cellules sont au point. Sélectionner les paramètres d'acquisition d'image tels que les temps d'exposition et les filtres fluorescents.

Séquence d'images en champ clair et en fluorescence permettant de suivre les cellules et leurs trajectoires, ainsi que les points temporels et la durée d'enregistrement au démarrage du programme d'acquisition d'images. Cette vidéo illustre une méthode d'imagerie de cellules vivantes migrantes dans un environnement présentant des gradients adhésifs et solubles concurrents. Des pistes adhésives contenant de la streptavidine fluorescente et du RGD biotinylé ont été créées par micro-impression ou lithographie au stylo-pointe.

Une impression par microcontact réussie est indiquée par le profil de l'intensité de fluorescence à travers les pistes, où les pistes adhésives et les régions antifouling peuvent être clairement distinguées. Les points imprimés par lithographie à stylo trempé apparaissent arrondis, non en forme de larme, ce qui indique un processus d'impression réussi. Dans cet exemple, les points ont été imprimés en ligne avec une séparation entre lignes et colonnes fixée à 10 à 15 micromètres.

Cette distance est suffisante pour empêcher les points de se fondre les uns dans les autres, tout en permettant l’observation de plusieurs points dans un même champ de vision. Avec la plupart des réglages du microscope, un gradient de signaux adhésifs sur la piste imprimée a été créé à l’aide d’un dispositif de microfluidique simple. En chargeant de la biotine marquée à la fluorescéine et du biotine-RGD dans les côtés opposés d’un panneau de chambre microfluidique.

Un affiche 60 images en mosaïque prises avec une longueur totale d'image de 3072 micromètres. Dans le panneau B, l'intensité de fluorescence a été mesurée sur toute la longueur de la mosaïque. Des droites de tendance linéaires ont été ajustées à l'intensité de fluorescence afin d'indiquer le gradient de RGD dans le canal.

Après avoir retiré la solution de biotine ou de biotine RGD, la même chambre peut être utilisée pour introduire un gradient soluble. Le panneau A montre l'intensité de fluorescence du colorant fluorescéine près des réservoirs remplis de PBS et de fluorescéine, ainsi que le long du canal à T égal à zéro. Le panneau B montre l'intensité de fluorescence des signaux solubles.

Après une incubation de 16 heures, les résultats comparables indiquent que le gradient était stable pendant au moins 16 heures. Une migration cellulaire dans une chambre microfluidique avec des gradients opposés a été observée grâce à cette méthode, et un film représentatif est montré ici. Le gradient d'adhésion était constitué de RGD immobilisé sur des pistes de streptavidine, et le gradient soluble allait de 0 à 10 % de FCS.

Les images ont été prises toutes les 15 minutes pendant une durée totale de 20 heures. La transition d'images présentée correspond à huit images par seconde. Ce second film montre une cellule heli unique en migration vers la source de FBS.

La transition d'images présentée se fait à huit images par seconde. La ligne bleue représentant la trajectoire de la cellule a été obtenue à l'aide d'un logiciel de suivi cellulaire. Ce dernier graphique montre les trajectoires des cellules issues des images de la première vidéo.

Les trajectoires cellulaires qui ont migré vers des concentrations plus élevées de FPS soluble sont indiquées en rouge, tandis que les trajectoires cellulaires ayant migré vers des concentrations plus élevées de RGD adhérent sont indiquées en noir. Ces trajectoires ont montré qu'un plus grand nombre de cellules HeLa ont migré vers la source du chémotactisme que vers des concentrations plus élevées de RGD adhérent. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à éviter l'évaporation du PBS ou du milieu dans le dispositif microfluidique pendant la préparation du gradient d'adhésion et l'imagerie en conditions de vie, utilisez du ruban adhésif si nécessaire pour couvrir toutes les entrées du dispositif microfluidique après cette procédure.

D'autres méthodes, telles que la transfection et la microscopie en solution hybride, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la biomécanique du cytosquelette agissant par l'intermédiaire de protéines, des protéines d'adhérence focale et des récepteurs durant la migration cellulaire.