Name: Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules dimagerie par microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Apprenez à créer des gradients adhésifs et solubles pour étudier la migration cellulaire en microscopie à fluorescence. Cette méthode combine l'ingénierie de surfaces antifouling et l'impression micro-contact pour analyser les signaux de guidage cellulaire.

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Les auteurs remercient le financement de l&#39;Australian Research Council et la Santé nationale et du Medical Research Council de l&#39;Australie et également à remercier l&#39; Facilité de fabrication australienne nationale pour la SU-8 maître pour l&#39;impression par microcontact. SHN est soutenu par le Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Malaisie Universiti Sains Malaysia.

1. Passivation de Lamelles de verre avec PLL-PEG-biotine Cette étape est destinée à passiver la surface de sorte que les cellules adhèrent et migrent vers des régions spécifiques sur la lamelle de verre qui sont créés avec l&#39;impression microcontract (Étape 2-3a) ou par immersion lithographie stylo (étape 3b). Pour la passivation, un copolymère de poly-L-lysine (PLL) et de polyéthylène glycol (PEG), qui est utilisé dans 20% des molécules de PEG sont greffés à la biotine (PLL-PEG-biotine). <ol><li> Pour nettoyer des lamelles de verre (18 mm x 18 mm), les plonger dans un rack dans l&#39;éthanol à 100% et placer le support dans un bain de sonication pendant 30 min. Sécher les lamelles de verre dans l&#39;air ou dans un courant d&#39;azote. </li><li> Ensuite, soniquer les lamelles de verre pendant 30 min dans 1 M NaOH. Ensuite rincer les surfaces en verre trempé avec soin par le rack dans un bécher rempli avec 1,5 L Milli-Q H 2 O. Répétez le processus de rinçage à trois reprises avec frais Milli-Q H 2 O à chaque fois. Sécher les lamelles de verre dansun four à 60 ° C. </li><li> Placer la moitié du verre propre des lamelles de individuellement dans une chambre humide, qui est constitué d&#39;une plaque de 24 puits partiellement rempli d&#39;H 2 O. Déposer 15 ul de PLL-PEG-biotine (1 mg / ml) dans du PBS sur chaque lamelle de verre. Prenez l&#39;autre moitié des lamelles de verre qui restent propres et soigneusement sandwich à la solution de PEG. Laissez les lamelles pendant 1 heure dans la chambre humide. Faites glisser les lamelles en sandwich doucement les uns des autres sans racler la surface PEG-couché et les rincer à l&#39;eau Milli-Q H 2 O. L&#39;eau devrait glisser facilement sur le côté PEG-traitée. Si nécessaire, sécher à l&#39;air les lamelles de verre sur une serviette en papier avec la surface traitée vers le haut. Rangez les lamelles dans un dessiccateur sous vide jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol> 2. Fabrication des timbres pour l&#39;impression par microcontact Nous décrivons deux processus aux pistes de streptavidine motif sur les lamelles de verre passivé. Le premier, d&#39;un microimpression rocontact, nécessite généralement la fabrication d &#39;un maître silicium à partir duquel un timbre PDMS est jeté. Dans notre cas, le motif du timbre de PDMS sont de 100 um à l&#39;échelle lignes qui sont espacés de 290 um de centre à centre avec une hauteur caractéristique de 25 microns. Ci-dessous, nous décrivons brièvement comment fabriquer un maître silicium approprié (étape 2.1-2.3) et le timbre de PDMS (étape 2.4). Toutefois, il existe de nombreux protocoles pour l&#39;impression par microcontact décrits dans la littérature 19-23, qui sont appropriées pour l&#39;impression de motifs protéiques sur des lamelles de verre. Masters peuvent également être faits sur mesure et achetés auprès de sources commerciales. <ol><li> Tout d&#39;abord, nettoyer la tranche de silicium (4 &quot;de diamètre) en le incubation dans une solution piranha (3:1 v: v d&#39;acide sulfurique et de peroxyde d&#39;hydrogène à 30%). Pendant 20 min Rincer à fond la plaquette 10 fois avec MilliQ H 2 O. Sécher la plaque dans un four à 150 ° CO / N. </li><li> Rincer la plaquette de silicium propre et sec avec de l&#39;acétone à 100%, suivie de l&#39;alcool isopropylique à 100%. Suivantspin-couche 2 ml de GM1070 SU-8 de photorésist (Gersteltec Sarl) sur la plaquette à 3.100 tours par minute pendant 40 secondes pour créer une couche de 25 microns d&#39;épaisseur. L&#39;échantillon est ensuite cuit sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 5 min, puis encore 5 min à 95 ° C. </li><li> Exposer la résine photosensible SU-8 à la lumière UV pendant 60 secondes sous un photomasque avec le motif désiré (par exemple en utilisant un masque Quintel Q6000 alignement) et répétez le processus de cuisson décrire en 2.2. Puis l&#39;échantillon est mis au point en immergeant la plaquette dans SU-8 de révélateur (Gersteltec Sarl) pendant 4 minutes, on rince à l&#39;alcool isopropylique 100% et séché sous courant d&#39;azote. La superficie de la résine photosensible SU-8 qui n&#39;a pas été exposée à la lumière UV est ainsi éliminé, en créant le modèle inverse du timbre en PDMS. </li><li> L&#39;étape suivante consiste à jeter un timbre de PDMS par le maître de silicium. Tout d&#39;abord, bien mélanger 1 partie (en poids / poids) de l&#39;agent de durcissement avec 10 parties de prépolymère élastomère (Sylgard 184). Pour enlever les bulles d&#39;air, dégazer le mélange dans un dessiccateur attaché à une ligne de vidependant 1 heure. Ensuite, versez l&#39;élastomère PDMS sur le maître silicium dans une boîte de Pétri à environ 1 cm de hauteur et de durcir le mélange maître et PDMS dans une étuve à 70 ° C pendant 1 heure. Enfin, le cachet de PDMS est retiré du maître de silicium et coupé à la taille. </li></ol> 3. Streptavidine ou de motifs Cues adhésives sur des lamelles de verre passivés Après passivation des lamelles de verre, des motifs protéiques sont imprimés avec l&#39;impression par microcontact (étape 3a) ou lithographie dip-pen (Step 3b). Dans notre cas, la streptavidine est imprimé sous forme de lignes, qui forment la base pour des gradients de RGD (étape 4). La même procédure peut également être utilisée pour l&#39;impression de protéines de la matrice pour créer des motifs d&#39;adhésif. Une méthode alternative pour l&#39;impression par microcontact pour la structuration de biomolécules sur des surfaces est creux lithographie stylo. En plongeon lithographie stylo, un porte à faux est utilisé pour transférer un petit volume de solution sur la surface. La taille des cantilevers, viscosity de la solution, le temps de contact de la poutre sur la surface, hydrophobicité de la surface et de l&#39;humidité dans la chambre de déterminer la taille d&#39;impression des éléments imprimés. L&#39;avantage de cette méthode est que différents modèles peuvent être imprimés pour chaque expérience, car il n&#39;est pas nécessaire de fabriquer des maîtres et des timbres. L&#39;inconvénient est que cela prend plus de temps pour imprimer un motif donné et qui ont un pendage lithographie stylo nécessite un instrument spécialisé qui peut ne pas être disponible dans de nombreux laboratoires. L&#39;instrument lithographie dip stylo que nous avons utilisé était le NanoeNabler de Bioforce Nanosciences. Ici, nous avons imprimé des petits points qui étaient &lt;10 um de diamètre, pour lequel nous avons utilisé SPT10 cantilevers. 3a. Impression par microcontact (μCP) Technique <ol><li> Pour nettoyer et faire le tampon de PDMS plus hydrophile, traiter le côté motifs des timbres de PDMS dans une UV et à l&#39;ozone (par exemple, Procleaner Ozone UV Bioforce Nanosciences) pendant 1,5 heure. Vous pouvez également utiliser un plasmapropre pour un temps plus court dans le même but. Ce processus crée une surface 24 PDMS oxydé, ce qui améliore le processus d&#39;impression. </li><li> Immédiatement après le traitement à l&#39;ozone ou le plasma, le lieu et la propagation 10 pi de streptavidine (1 mg / ml dans du PBS) sur les timbres PDMS et laisser reposer pendant 1 heure dans une chambre humide (comme un partiellement rempli à 6 puits plaque, voir étape 1.3) . Si les pistes doivent être visibles au microscope fluorescent, utilisez la streptavidine qui est conjugué à un fluorophore tel que la streptavidine-AlexaFluor350. </li><li> Enlever l&#39;excès de streptavidine le tampon de papier de soie et de l&#39;air sec du tampon pendant environ 1 min. Appuyez légèrement sur le timbre sur la lamelle de verre PLL-PEG-biotine-enduit. </li><li> Si fluorescente streptavidine a été utilisé dans 3.A2 étape, examiner le motif à l&#39;aide en vertu d&#39;un microscope à épifluorescence. Conservez les surfaces imprimées dans un dessiccateur. </li></ol> 3b. Dip Pen Lithographie <ol><li> Tout d&#39;abord, mélanger 1 partie de 1 mg / ml de streptavidine ou streptavidin-AlexaFluor350 avec 10 parties de glycérol (v / v) et de charger 5 ul du mélange sur la console. Ensuite, commencer le processus d&#39;impression comme décrit dans le manuel d&#39;utilisation de l&#39;instrument lithographie dip stylo. Pour réduire la taille du point à environ 5 um, régler la vitesse d&#39;impression, le temps de contact du levier sur la distance de la surface verticale ou de la porte à faux à la surface. Dans l&#39;exemple illustré à la figure 2c, des points ont été imprimés, en ligne avec la ligne et la colonne de séparation mis à 10-15 um. Cette distance est suffisante pour éviter les points de fusion dans l&#39;autre, mais permet la visualisation de points multiples dans un seul champ de vue avec la plupart des paramètres du microscope. </li><li> Conservez les surfaces imprimées dans un dessiccateur. </li></ol> 4. Création de dégradés adhésif sur la streptavidine-modèle Surfaces On crée des gradients d&#39;adhérence de la biotine-RGD sur des lamelles de verre qui sont revêtues de streptavidine (figure 3) ou de contain modèles streptavidine sur des lamelles de verre passivé (figure 5). Pour créer un gradient de surface, nous avons utilisé un dispositif microfluidique disponible dans le commerce (appelé sticky-Slide chimiotactisme 3D à partir de Ibidi) qui crée un gradient de solution stable par diffusion passive. Pour en compétition pour les sites de liaison streptavidine, nous avons utilisé deux gradients opposés de la biotine et la biotine-RGD qui n&#39;était pas conjugué à RGD (voir Figure 1). <ol><li> Respecter les lamelles de verre recouvertes de streptavidine ou à motifs sur le côté collant du dispositif chimiotactisme collant-Slide 3D. Faire en sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuite pendant plusieurs heures, les bords du dispositif sont fermées par une fine couche de vaseline chauffée et d&#39;une seconde couche d&#39;un mélange de 1 partie de la vaseline à 1 partie de cire de paraffine (p / p). </li><li> Remplissez le canal de l&#39;appareil avec 6 pi de PBS dans le canal. Ensuite, remplissez les deux réservoirs avec 70 ul de 0,03 pg / pl biotine-4-fluorescéine dans du PBS et 70 m &amp;u; l de 0,03 pg / pl biotine-RGD dans du PBS, respectivement. Incuber les échantillons à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 1 heure. </li><li> Retirer les solutions biotine et rincer soigneusement la surface tout en restant attaché au dispositif microfluidique deux fois avec du PBS. Repérer le sens de la pente adhésif et, si nécessaire, stockez pas l&#39;appareil rempli de PBS à 4 ° C pendant mais s&#39;assurer que l&#39;appareil ne se dessèche pas. Si nécessaire, d&#39;analyser le gradient de colle avec un microscope à fluorescence. </li></ol> 5. Étiquetage des cellules avec des fluorophores pour l&#39;imagerie des cellules vivantes Les cellules sont marquées avec des colorants fluorescents qui aident le suivi de cellules au microscope fluorescent. Sondes fluorescentes marqueurs communs sont des organelles, comme Syto 64 rouges, qui marque le noyau de la cellule. Pour ce faire, les cellules sont d&#39;abord lavées trois fois avec du PBS, puis incubées avec 1 uM Syto 64 Rouge dans un milieu de culture pendant 45 min et enfin lavé à trois reprises avec du PBS. S&#39;il vous plaît noter que les cellules ne doivent pas êtreconservés dans du PBS pendant de longues périodes de temps. Colorants alternatifs pour le suivi de la cellule sont des séries CellTracker cette tache le cytoplasme et sont conservés pendant la migration et la division cellulaire. La transfection de cellules avec la protéine de fusion fluorescente est particulièrement utile pour enregistrer les distributions subcellulaires d&#39;une protéine d&#39;intérêt lors de la migration. Cependant, les protéines fluorescentes photo-blanchiment généralement plus rapides que les colorants organiques de sorte que les observations à long terme peut ne pas être possible. 6. Chargement de cellules avec un dégradé Soluble dans le dispositif microfluidique <ol><li> Compter les cellules marquées par fluorescence et fendus en deux tubes du nombre de cellules égales. Lavez et remettre un tube de cellules avec un milieu contenant le facteur chimiotactique, comme moyen de modification de glucose bas Dulbecco Eagle (DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Lavez et remettre l&#39;autre tube de cellules dans un milieu sans chimiotactique, c&#39;est à dire DMEM avec 0% de FBS. La concentration finaledes cellules dans chaque tube doit être de 5 x 10 5 cellules / ml. </li><li> Retirez toutes les solutions du dispositif microfluidique (de l&#39;étape 4.3) et le placer sur la platine du microscope (voir l&#39;étape 7). Chargez 70 ul de cellules (5 x 10 5 cellules / ml dans du DMEM 0% FBS) dans un réservoir et 70 ul de cellules HeLa (5 x 10 5 cellules / ml dans 10% de FBS DMEM) dans un autre. Librement placer un ruban adhésif sur les réservoirs pour éviter l&#39;évaporation. Si les cellules à la surface sont pré-incubés avant l&#39;imagerie, il est souhaitable que les cellules sont chargées dans l&#39;appareil dans un milieu de croissance sans gradient. Le dispositif est ensuite placé sur la platine du microscope et les médias remplacée par gradient médias DMEM sans SVF soit dans un réservoir et du DMEM avec 10% de FBS dans l&#39;autre. </li></ol> 7. Vivez imagerie cellulaire et analyse des données <ol><li> Allumer le microscope (Nikon Ti-E) et faire chauffer le stade au moins 1 heure avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Assurez-vous que le canal de la microfluidic dispositif est dans le champ de vision et les cellules sont au point. Sélectionner le paramètre d&#39;acquisition d&#39;image tels que les temps d&#39;exposition et les filtres fluorescentes, séquence d&#39;images de fond clair et fluorescence qui capture les cellules et les pistes ainsi que des points de temps et durée d&#39;enregistrement (par exemple toutes les 15 minutes pendant 16 heures). </li><li> Analyser les données avec des logiciels appropriés tels que ImageJ Manuel de suivi ou Ibidi chimiotactisme et de l&#39;outil de migration. </li></ol>

<ol><li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+BioChem%22%5BJournal%5D)">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li>
<li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%3A+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li>
<li>Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sensing+through+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmental sensing through focal adhesions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li>
<li>Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+cells+make+decisions%3A+engineering+micro-+and+nanoenvironments+for+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration.</a> Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).</li>
<li>Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+fibronectin+matrix+mimetic+as+a+functional+growth-+and+migration-promoting+adhesive+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate.</a> Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li>
<li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G-protein+Coupled+Receptor+%28GPCR%29-mediated+Signaling+Events+that+Control+Chemotaxis+of+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum.</a> J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).</li>
<li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gradient-generating+Microfluidic+Device+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (7), e271(2007).</li>
<li>Rhoads, D. S., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+directional+cell+migration+on+defined+FN+gradients%3A+role+of+intracellular+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules.</a> Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+haptotactic+gradient+generation+within+a+triangular+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).</li>
<li>Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.ibidi.com/service/faq.html">http://www.ibidi.com/service/faq.html</a> (2010).</li>
<li>Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+eukaryotic+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Assays for eukaryotic cell chemotaxis.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).</li>
<li>Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+micropatterns+for+cells%3A+a+microcontact+printing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).</li>
<li>Hillborg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+polydimethylsiloxane+exposed+to+oxygen+plasma+studied+by+neutron+reflectometry+and+other+surface+specific+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques.</a> Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).</li>
<li>Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin%2C+VEGF%2C+or+Both+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li>
<li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leukocyte+response+to+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The leukocyte response to fluid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).</li>
<li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).</li>
<li>Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing%3A+Limitations+and+Achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing: Limitations and Achievements.</a> Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li>
<li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+dip-pen+nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li>
<li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithography+and+nanochemistry%3A+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li>
<li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li>
<li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts commerciaux à divulguer.

Dans ce protocole, nous avons utilisé un dispositif microfluidique disponible dans le commerce (sticky-Slide chimiotactisme 3D à partir de Ibidi) pour étudier les effets des surfaces chimiquement modifiées et les gradients chimiotactiques sur la migration des cellules. Cette configuration ne nécessite pas de microfluidique écoulement car le gradient est établi par diffusion le long de la longueur du canal. Ceci est important parce que la circulation pourrait affecter différemment les cellules migrent lentemen...

La migration cellulaire dirigée est une propriété fondamentale de nombreuses cellules et est un aspect clé de nombreux processus physiologiques normaux, y compris le développement embryonnaire, de la défense contre l&#39;infection et la cicatrisation. En outre, la migration cellulaire joue également un rôle important dans de nombreuses maladies telles que les maladies vasculaires, métastase des cellules tumorales et de 1,2 inflammation chronique. Alors que les états classiques de la migration cellulaire - polarisation, de vulgarisation, de formation saillie de l&#39;adhérence, la force et la rétraction arrière - sont généralement acceptés 3,4, l&#39;élucidation des mécanismes par lesquels l&#39;intégration spatio-temporelle du signal est coordonné a été plus difficile. La matrice extracellulaire (MEC) sert de substrat pour l&#39;adhésion cellulaire, et par l&#39;intermédiaire chimique et physique inhérente 5 6 diversité, fournit des signaux de direction pour la navigation cellule 7,8. En plus de ces indices adhésives 9, les facteurs solubles 10-12 &lt;/ Sup&gt; tels que les chimiokines et des facteurs de croissance peut induire la migration cellulaire dirigée par les récepteurs chimiotactiques et de leur signalisation en aval motogenic. À l&#39;heure actuelle, on ne sait pas si l&#39;engagement et de la signalisation par les récepteurs d&#39;adhésion (intégrines par exemple) ou des récepteurs chimiotactiques tels que récepteur tyrosine kinase (RTK), sont dominants. Il n&#39;est pas connu si les hiérarchies de systèmes de récepteurs sont spécifiques de type cellulaire. Microscopie de cellules vivantes donne une foule d&#39;informations qui n&#39;est pas accessible dans des essais en vrac et peuvent être combinés avec des dispositifs microfluidiques pour générer des gradients de 13,14 immobilisés indices et solubles 15 16. La méthode décrite ici utilise une série d&#39;étapes simples et établies pour la modification de surface en conjonction avec une chambre de disponible dans le commerce microfluidique pour créer un test d&#39;imagerie pour la migration des cellules qui peuvent être facilement mises en œuvre dans un laboratoire de biologie cellulaire (Figure 1). L&#39;assemblagedispositif microfluidique a des qualités optiques comparables à verre 17 et les gradients de molécules diffusibles sont stables pendant au moins 16 h. Le système peut être utilisé pour des techniques de microscopie à épifluorescence et avancé. Contrairement à d&#39;autres configurations de chimiotaxie 18, ce système est idéal pour enregistrer lentement migrateurs, les cellules adhérentes. Surtout, le système est modulaire et permet facilement la mise en place de l&#39;adhésif de remplacement ou des indices de migration solubles et l&#39;examen des différents types cellulaires.

<table><tbody><tr><td>Couvertures pour taches</td> Thomas <td>Scientific</td><td>8542 E40</td><td>Grille de lamelles</td></tr><tr><td>Four</td><td>Binder</td><td></td><td>ED 53 series</td></tr><tr><td>Plaquette de silicium</td><td>Silicon Quest</td><td>708-007</td><td>Bore dopé < 100> plaquette, 4" de diamètre, 500 &mu ; m, poli simple face</td></tr><tr><td>GM1070 SU-8 photorésine</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 développeur</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 agent de durcissement</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 prépolymère élastomère</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-biotine (20 %)</td><td>SuSos AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotine (20 %)</td><td>1 mg/ ml dans PBS</td></tr><tr><td>Fluorescéine</td><td>Sigma</td><td>46955</td><td>1 mM dans PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin-AlexaFluor350</td><td>Invitrogen</td><td>S-11249</td><td>1 mg/ml dans PBS</td></tr><tr><td>Biotine-4-fluorescéine</td><td>Invitrogen</td><td>B-1370</td><td>0,03 &mu ; g/&mu ; l dans PBS</td></tr><tr><td>Biotin-RGD</td><td>GenScript</td><td>SC1208</td><td>0,03 mg/ml dans PBS</td></tr><tr><td>Syto 64 Red</td><td>Invitrogen</td><td>S-11346</td><td>1 &mu ; M in PBS</td></tr><tr><td>Sticky slide chimiotaxie 3D</td><td>Ibidi</td><td>80328</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; l Greiner pointe biseautée jaune</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739261</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>Cire de paraffine, mp 55-57 &deg ; C</td><td>Sigma</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Nano eNabler 10 &mu ; m cantilever </td><td>BioForce</td><td>SPT-S-C-10s</td><td></td></tr><tr><td>Image J logiciel</td><td>Institut national de la santé</td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html » target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>Plugin de suivi manuel</td><td>Fabrice Cordeli&#232 ; res</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html » target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td></tr><tr><td>Outil de chimiotaxie et de migration</td><td>Ibidi GmbH</td><td></td><td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html » target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td></tr></tbody></table>

création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cellules peut détecter et à migrer vers des concentrations plus élevées de signaux adhésives telles que les glycoprotéines de la matrice extracellulaire et des signaux solubles tels que les facteurs de croissance. Ici, nous décrivons une méthode pour créer des gradients opposés de repères adhésifs et soluble dans une chambre microfluidique, qui est compatible avec l&#39;imagerie de cellules vivantes. Un copolymère de poly-L-lysine et de polyéthylène glycol (PEG-PLL) est employée pour passiver des lamelles de verre et empêcher l&#39;adsorption non spécifique de biomolécules et de cellules. Suivant l&#39;impression par microcontact, ou immersion lithographie stylo sont utilisés pour créer des voies de la streptavidine sur les surfaces passivées à servir de points d&#39;ancrage pour le peptide biotinylé arginine-glycine-acide aspartique (RGD) comme le repère adhésif. Un dispositif microfluidique est placé sur la surface modifiée et utilisée pour créer le gradient de signaux adhésives (100% RGD RGD à 0%) sur les pistes de streptavidine. Enfin, le dispositif microfluidique même est utilisé pour créer un dégradé de succès chimiotactiqueh comme sérum de veau foetal (FBS), que le signal soluble dans le sens inverse du gradient d&#39;indices adhésives.

Pour comprendre comment les cellules intègrent les signaux migratoires 25, nous avons développé une méthode pour imager des cellules par microscopie de fluorescence qui migrent dans un environnement avec des gradients concurrents adhésives et soluble (figure 1). Pistes adhésives qui contiennent streptavidine fluorescente et RGD biotinylé a été créé avec des pistes microcontacts imprimés et trempette lithographie stylo (figure 2). L&#39;impression par microcontact réussie est ...

Une méthode pour l&#39;assemblage des gradients adhésives et soluble dans une chambre microscopique direct des études sur la migration des cellules est décrite. L&#39;environnement technique combine des surfaces adhésives anti-salissures et les pistes de solutions avec des dégradés et permet donc de déterminer l&#39;importance relative des signaux de guidage.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

L'objectif général de cette procédure est de créer des gradients adhésifs et solubles afin d'étudier la migration cellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en passivant une surface pour empêcher l'adhésion cellulaire non spécifique. La deuxième étape consiste à fabriquer des matrices par impression en microcontact.Ensuite, la surface traitée est dessinée avec des lignes de streptavidine par impression en microcontact. La streptavidine peut également être imprimée sous forme de points à l’aide d’une lithographie au stylo à pointe trempée, fixée à la face inférieure d’un dispositif microfluidique. La surface modifiée servira de base à un gradient d’adhésion de biotine RGD.La dernière étape consiste à déposer des cellules sur la surface comportant le signal adhésif en présence d'un gradient soluble de chémotactisme. En fin de compte, une microscopie en temps réel sur cellules vivantes est utilisée pour montrer la migration cellulaire en réponse à des signaux adhésifs et solubles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les essais en transwell ou en chambre à vide, ou un dispositif microfluidique conventionnel, est que le système désintégré de motifs de surface d'un dispositif microfluidique permet d'observer simultanément les réponses cellulaires à des signaux adhésifs spatialement contrôlés, à un gradient adhésif et à un gradient soluble.Eh bien, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la migration cellulaire, telles que l'importance de l'adhésion cellulaire et la cause de l'activation entre les récepteurs chimiotactiques, comme les récepteurs tyrosine kinase, les récepteurs couplés aux protéines G et les récepteurs d'adhésion tels que RIN. Pour commencer, nettoyez les lamelles en les plongeant dans un support rempli d'éthanol à 100 %, puis placez le support dans un bain ultrasonique d'eau pendant 30 minutes. Séchez les lamelles de verre à l'air.Ensuite, soniquez les lamelles de verre pendant 30 minutes dans une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire. Par la suite, rincez les surfaces de verre en inclinant soigneusement le porte-lamelles dans un bécher rempli d'un litre et demi d'eau milli-Q. Répétez le rinçage trois fois en utilisant à chaque fois de l'eau milli-Q fraîche.Après le troisième rinçage, sécher les lamelles de verre dans une étuve à 60 degrés Celsius pendant environ une demi-heure. Placer la moitié des lamelles de verre propres individuellement dans une chambre humide constituée d'une plaque de 24 puits partiellement remplie d'eau. Les puits sont remplis d'eau et les lamelles de verre sont posés au-dessus des puits pour l'immobilisation. Un copolymère de polylysine et de polyéthylène glycol est utilisé, dans lequel 20 % des molécules de PEG sont greffées à la biotine.Abrégé en PLL Peg biotine : déposez 15 microlitres de PLL Peg biotine dans du PBS sur chaque lame de verre. Prenez l'autre moitié des lames de verre propres restantes et placez-les délicatement par-dessus la solution de PEG pour former un sandwich. Laissez les lames de verre pendant une heure dans la chambre humide.Après une heure, faites glisser délicatement les lamelles l'une par rapport à l'autre sans rayer la surface revêtue de PEG, puis rincez-les avec de l'eau UE. L'eau doit s'écouler facilement du côté traité au PEG. Si nécessaire.Laisser sécher à l'air les lamelles de verre sur une serviette en papier, la surface traitée étant orientée vers le haut. Conserver les lamelles de verre dans un dessiccateur sous vide jusqu'à utilisation ultérieure. Le moule en silicium nécessaire à cette procédure est fabriqué par photolithographie afin de mouler un tampon en A-P-D-M-S pour l'élastomère PDMS sur le moule en silicium à l'intérieur d'une boîte de Pétri sur une hauteur d'environ un centimètre, puis polymériser le moule et le mélange PDMS dans une étuve à 70 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, le tampon en PDMS est retiré du moule en silicium et découpé à la taille souhaitée pour imprimer des motifs de protéines. Utilisez d'abord la technique de micro-impression par contact pour nettoyer et rendre les tampons en PDMS plus hydrophiles, en traitant la face gravée dans un nettoyeur à UV et à ozone pendant une heure et demie. Immédiatement après le traitement à l'ozone, déposez et étalez 10 microlitres d'avidine dénudée sur les tampons en PDMS. Si les pistes doivent être visibles au microscope à fluorescence, utilisez de l'avidine dénudée conjuguée à un fluorophore, tel que l'avidine dénudée marquée par le colorant LOR trois 50.Laisser une heure dans une chambre humide. Retirer l'excès de strep din du tampon avec un mouchoir en papier et de l'air. Sécher le tampon pendant environ une minute.Appuyez légèrement le tampon sur la lamelle de verre revêtue de biotine et de PLL. Si de la streptavidine marquée au fluorochrome a été utilisée, examinez le motif au microscope à fluorescence épiscopique. Les motifs protéiques peuvent également être imprimés par lithographie à stylo-plume.Mélangez d'abord une partie d'un milligramme par millilitre de streptavidine ou d'avidine dépourvue d'élifluor 350 avec 10 parties de glycérol, puis déposez cinq microlitres du mélange sur le levier. Ajustez la vitesse d'impression, le temps de contact du levier avec la surface ou la distance verticale du levier par rapport à la surface afin de réduire la taille du spot.Environ cinq micromètres commencent le processus d'impression tel que décrit dans le manuel d'utilisation du magasin d'instruments de lithographie à stylo trempé. Toutes les surfaces imprimées sont placées dans un dessiccateur. Un dispositif microfluidique disponible dans le commerce est utilisé pour créer des gradients de surface.Fixez ces lamelles en verre recouvertes ou imprimées de tritin sur le côté adhésif du dispositif afin de garantir l'absence de fuite pendant plusieurs heures. Scellez les bords du dispositif avec une fine couche de vaseline chauffée et avec une seconde couche composée d'un mélange d'une part de vaseline pour une part de cire de paraffine. Remplissez le canal du dispositif avec six microlitres de PBS afin de créer deux gradients opposés.Remplissez les deux réservoirs, l'un avec 70 microlitres de biotine marquée à la fluorescéine et l'autre avec 70 microlitres de biotine conjuguée au peptide biotinylé arginine glycine acide aspartique ou RGD. Incubez les échantillons à température ambiante à l'abri de la lumière pendant une heure. Le rinçage de la biotine, du RGD et de la biotine marquée du dispositif microfluidique constitue l'aspect le plus délicat de cette procédure, car il existe un risque de piéger des bulles d'air et de perturber les pistes imprimées par microcontact. Pour garantir le succès, la biotine et le PBS doivent être éliminés soigneusement et lentement.Retirez les solutions de biotine et rincez soigneusement la surface deux fois avec du PBS, tout en laissant celle-ci fixée au dispositif microfluidique. Marquez la direction du gradient d'adhésion avant de charger les cellules marquées par fluorescence dans le dispositif microfluidique. Comptez les cellules et répartissez-les en deux tubes contenant un nombre égal de cellules.Lavez et resuspendez. Suspendez un tube de cellules dans un milieu contenant l'agent chimiotactique, comme le DMEM à faible teneur en glucose avec 10 % de FBS, puis lavez-le, et l'autre tube de cellules dans un milieu sans agent chimiotactique, tel que le DMEM avec 0 % de FBS. La concentration finale de cellules dans chaque tube doit être de cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre.Retirer toutes les solutions du dispositif microfluidique et le placer sur le microscope préchauffé. Charger 70 microlitres de cellules resuspendues dans du DMEM contenant 0 % de FBS dans un réservoir. Charger 70 microlitres de cellules resuspendues dans du DMEM contenant 10 % de FBS dans un autre réservoir.Placer une bande adhésive de manière lâche sur les réservoirs pour éviter l'évaporation. S'assurer que le canal du dispositif microfluidique est dans le champ de vision et que les cellules sont au point. Sélectionner les paramètres d'acquisition d'image tels que les temps d'exposition et les filtres fluorescents.Séquence d'images en champ clair et en fluorescence permettant de suivre les cellules et leurs trajectoires, ainsi que les points temporels et la durée d'enregistrement au démarrage du programme d'acquisition d'images. Cette vidéo illustre une méthode d'imagerie de cellules vivantes migrantes dans un environnement présentant des gradients adhésifs et solubles concurrents. Des pistes adhésives contenant de la streptavidine fluorescente et du RGD biotinylé ont été créées par micro-impression ou lithographie au stylo-pointe.Une impression par microcontact réussie est indiquée par le profil de l'intensité de fluorescence à travers les pistes, où les pistes adhésives et les régions antifouling peuvent être clairement distinguées. Les points imprimés par lithographie à stylo trempé apparaissent arrondis, non en forme de larme, ce qui indique un processus d'impression réussi. Dans cet exemple, les points ont été imprimés en ligne avec une séparation entre lignes et colonnes fixée à 10 à 15 micromètres.Cette distance est suffisante pour empêcher les points de se fondre les uns dans les autres, tout en permettant l’observation de plusieurs points dans un même champ de vision. Avec la plupart des réglages du microscope, un gradient de signaux adhésifs sur la piste imprimée a été créé à l’aide d’un dispositif de microfluidique simple. En chargeant de la biotine marquée à la fluorescéine et du biotine-RGD dans les côtés opposés d’un panneau de chambre microfluidique.Un affiche 60 images en mosaïque prises avec une longueur totale d'image de 3072 micromètres. Dans le panneau B, l'intensité de fluorescence a été mesurée sur toute la longueur de la mosaïque. Des droites de tendance linéaires ont été ajustées à l'intensité de fluorescence afin d'indiquer le gradient de RGD dans le canal.Après avoir retiré la solution de biotine ou de biotine RGD, la même chambre peut être utilisée pour introduire un gradient soluble. Le panneau A montre l'intensité de fluorescence du colorant fluorescéine près des réservoirs remplis de PBS et de fluorescéine, ainsi que le long du canal à T égal à zéro. Le panneau B montre l'intensité de fluorescence des signaux solubles.Après une incubation de 16 heures, les résultats comparables indiquent que le gradient était stable pendant au moins 16 heures. Une migration cellulaire dans une chambre microfluidique avec des gradients opposés a été observée grâce à cette méthode, et un film représentatif est montré ici. Le gradient d'adhésion était constitué de RGD immobilisé sur des pistes de streptavidine, et le gradient soluble allait de 0 à 10 % de FCS.Les images ont été prises toutes les 15 minutes pendant une durée totale de 20 heures. La transition d'images présentée correspond à huit images par seconde. Ce second film montre une cellule heli unique en migration vers la source de FBS.La transition d'images présentée se fait à huit images par seconde. La ligne bleue représentant la trajectoire de la cellule a été obtenue à l'aide d'un logiciel de suivi cellulaire. Ce dernier graphique montre les trajectoires des cellules issues des images de la première vidéo.Les trajectoires cellulaires qui ont migré vers des concentrations plus élevées de FPS soluble sont indiquées en rouge, tandis que les trajectoires cellulaires ayant migré vers des concentrations plus élevées de RGD adhérent sont indiquées en noir. Ces trajectoires ont montré qu'un plus grand nombre de cellules HeLa ont migré vers la source du chémotactisme que vers des concentrations plus élevées de RGD adhérent. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à éviter l'évaporation du PBS ou du milieu dans le dispositif microfluidique pendant la préparation du gradient d'adhésion et l'imagerie en conditions de vie, utilisez du ruban adhésif si nécessaire pour couvrir toutes les entrées du dispositif microfluidique après cette procédure.D'autres méthodes, telles que la transfection et la microscopie en solution hybride, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la biomécanique du cytosquelette agissant par l'intermédiaire de protéines, des protéines d'adhérence focale et des récepteurs durant la migration cellulaire.

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