Name: en cours danalyse In Vivo Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Découvrez l'analyse de la migration cellulaire in vivo par transplantation cellulaire et imagerie en temps réel chez l'embryon de zèbre Danio rerio. Cette méthode permet d'étudier le rôle des gènes candidats dans la biologie du développement.

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Nous remercions F. Bouallague et la animalerie IBENS pour l’excellence des soins prodigués aux poissons-zèbres. Les recherches dont il est question dans cette publication ont été soutenues par la Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, subventions N° SFI20111203770 et N° PJA 20131200143.

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<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).</li>
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<li>Zhang, T., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3-Efemp2a+modulates+the+fibrillar+matrix+for+cohesive+movement+of+prechordal+plate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors.</a> Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).</li>
<li>Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein%3A+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li>
<li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole présente un moyen facile d&#39;étudier le rôle d&#39;un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo, en combinant la création d&#39;embryons chimères en utilisant une transplantation de cellules avec l&#39; imagerie en direct. Création d&#39;embryons mosaïques Étude de la dynamique d&#39;une cellule nécessite la visualisation de son contour pour analyser les extensions cytoplasmiques. Ceci peut être réalisé par marquage des cellules i...

Dans les organismes multicellulaires, la migration cellulaire est essentielle à la fois pour le développement de l&#39;embryon où elle assure l&#39;organisation des cellules dans les tissus et organes, et la vie adulte, où elle participe à l&#39;homéostasie tissulaire (cicatrisation des plaies) et l&#39;immunité. En plus de ces fonctions physiologiques, la migration des cellules est également impliqué dans diverses situations pathologiques, y compris, en particulier, les métastases du cancer. La migration cellulaire a été analysée in vitro pendant des décennies, fournissant une compréhension globale des mécanismes moléculaires assurant les mouvements cellulaires sur des surfaces planes. In vivo cependant, les cellules sont confrontés à un environnement plus complexe. Il est apparu clairement au cours des dernières années que la migration au sein d&#39;un organisme peut être influencé par des signaux externes tels que la matrice extracellulaire, des cellules ou des chimiokines sécrétées guidage migration voisine, et que les mécanismes d&#39;entraînement la migration cellulaire peut varier de ce qui a été décrit &lt;em&gt; in vitro 1,2. Les mécanismes assurant la migration cellulaire in vivo ont reçu moins d&#39; attention jusqu&#39;à présent, principalement en raison de la difficulté technique accrue, par rapport à des études in vitro. In vivo analyse de la migration cellulaire , en particulier nécessite un accès optique directe aux cellules migrantes, techniques pour marquer les cellules uniques afin de voir leur dynamique et leur morphologie, ainsi que le gain ou la perte de fonction des approches pour tester le rôle des gènes candidats. Jusqu&#39;à présent, seuls quelques systèmes modèles hébergeant ces caractéristiques ont été utilisées pour disséquer vivo la migration cellulaire 3. Nous avons récemment utilisé la migration de la plaque préchordale prospective dans les embryons de poisson zèbre début comme un nouveau système de modèle pratique pour évaluer la fonction des gènes candidats dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo 4,5 dans. Plaque préchordale prospective (également connu sous mesendoderm antérieur) est un groupe de cellules formant au début de Gastrulation sur la face dorsale de l&#39;embryon. Au cours de la gastrulation ce groupe migre collectivement vers le pôle animal de l&#39;embryon 6-8, pour former la plaque préchordale, un épaississement de mesendodermal, antérieure à la notochorde, et qui sous - tend la plaque neurale. La partie antérieure de la plaque préchordale donnera lieu à l&#39; éclosion de la glande, tandis que sa partie postérieure contribue probablement à la tête mésoderme 9. Merci au développement externe et de la clarté optique de l&#39;embryon de poisson, la migration cellulaire peut être directement et facilement observée dans cette structure. La transplantation de cellules est une technique très puissante qui permet la création rapide et facile des embryons en mosaïque 10. Exprimer des marqueurs fluorescents cytosquelette dans les résultats des cellules transplantées dans l&#39;étiquetage des cellules isolées, la morphologie et la dynamique qui peuvent être facilement observés. La combinaison de cette perte ou gain de fonction des approches permet l&#39;analyse des fonctions des cellules autonomes d&#39;une boîtegène didat. Le protocole présenté décrit comment nous avons évalué la fonction de la composante sin1 de TORC2 dans le contrôle de la migration cellulaire et l&#39; actine dynamique in vivo 5. Mais, comme mentionné dans les résultats et discuté plus loin, il pourrait être utilisé pour analyser l&#39;implication potentielle d&#39;un gène candidat pour contrôler la migration des cellules in vivo.

<table><tbody><tr><td>Capillaires en verre (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,58 cm ; mm)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>300085</td> capillaires <td>en verre d’épaisseur standard</td></tr><tr><td>(diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,78 mm)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>300085</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline-streptomycine</td> à paroi mince <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&nbsp ; 000&nbsp ; unités de pénicilline et de 10 mg streptomycine par ml</td></tr><tr><td>pince fine</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>Plats à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Transjecteur d’air</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur (pour injection)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur (pour la transplantation cellulaire)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulateur</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton Seringue</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 720</td><td></td></tr><tr><td>Moule de transplantation</td><td>Outils scientifiques adapatifs</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Raccord de tube</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>Tube PTFE</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

en cours d&#39;analyse<em&gt; in vivo</em&gt; migration cellulaire en utilisant transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en zebrafish embryons

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

La migration cellulaire est la clé de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, y compris les métastases cancéreuses. Les bases cellulaires et moléculaires de la migration cellulaire ont été analysées de manière approfondie in vitro. Cependant, la migration cellulaire in vivo diffère d’une manière ou d’une autre de la migration in vitro et s’est avérée plus difficile à analyser, étant moins accessible à l’observation directe et à la manipulation. Ce protocole utilise la migration de la plaque préchordale prospective dans l’embryon précoce de poisson-zèbre comme système modèle pour étudier la fonction des gènes candidats dans la migration cellulaire. Les progéniteurs de la plaque préchordale forment un groupe de cellules qui, lors de la gastrulation, subit une migration dirigée de l’organisateur embryonnaire au pôle animal de l’embryon. Le protocole proposé utilise la transplantation cellulaire pour créer des embryons en mosaïque. Cela offre les avantages combinés du marquage des cellules isolées, qui est la clé d’une bonne imagerie, et de la limitation des effets de gain/perte de fonction aux cellules observées, assurant ainsi des effets autonomes des cellules. Nous décrivons ici comment nous avons évalué la fonction du composant TORC2 Sin1 dans la migration cellulaire, mais le protocole peut être utilisé pour analyser la fonction de tout gène candidat dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo.

La technique présentée a été utilisé pour analyser le rôle des sin1, l&#39; une des composantes essentielles de la Tor complexe 2 (TORC2), dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo. L&#39;utilisation de la transplantation de cellules permet de marquage des cellules et l&#39;analyse des effets sur les cellules autonomes isolées. Film S1 montre la migration des cellules progénitrices de la plaque préchordale transplantées. étiquetage actine avec ABP140 permet la...

Combinant des approches de transplantation cellulaire, de marquage cytosquelettique et de perte/gain de fonction, ce protocole décrit comment la plaque préchordale prospective du poisson-zèbre en migration peut être utilisée pour analyser la fonction d’un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la fonction d'un gène candidat dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo à l'aide d'une transplantation cellulaire combinée à un imagerie en direct dans l'embryon de poisson zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la migration cellulaire, telles que la détermination du rôle et de l'importance de nouveaux gènes candidats dans la migration cellulaire in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de créer des embryons en mosaïque, ce qui facilite une bonne imagerie et l'adénomyose cellulaire.Pour préparer les aiguilles de transplantation cellulaire, utilisez un tireur de micropipettes afin de tirer un capillaire en verre. Ensuite, à l’aide d’un micro-foreur, coupez l’extrémité de l’aiguille au point où le diamètre intérieur mesure 35 micromètres. À l’aide d’un microbroyeur, affûtez l’extrémité coupée du capillaire selon un angle de 45 degrés.Pour éliminer les résidus de verre, insérez l'aiguille dans un support d'aiguille monté sur une seringue, puis rincez l'intérieur de l'aiguille trois fois avec de l'acide fluorhydrique à 2 % en aspirant la solution entra

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Zebrafish transplantation de cellules permet la combinaison de la génétique et l'embryologie de générer des chimères tissulaires spécifiques. Cette vidéo montre gastrula scène transplantations de cellules qui ont permis à notre laboratoire pour étudier les rôles des populations astrogliales et les indices des directives précises lors de la formation commissure dans le prosencéphale.

Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Cette vidéo décrit une méthode de micro-injection pour l’administration de cellules cancéreuses du sein dans l’espace périvitellin d’embryons de poisson-zèbre transgénique. Après l’incubation, nous visualisons l’embryon au microscope fluorescent pour observer l’invasion, la dissémination et les métastases des cellules cancéreuses.

zPDX-Analyse de l’invasivité : étude du comportement invasif des cellules cancéreuses métastatiques dans les xénogreffes d’embryons de poisson-zèbre

Source : Williams, A. L., et al. Imagerie multi-photonique Time Lapse pour visualiser le développement en temps réel : visualisation des cellules de la crête neurale en migration dans les embryons de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo présente un protocole d’imagerie time-lapse multiphotonique permettant de visualiser la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre en temps réel avec une haute résolution.

Visualisation de la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre à l’aide de l’imagerie multiphotonique en accéléré

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Nous décrivons ici les modèles de xénogreffes de poisson zèbre en utilisant deux sites d'injection différents, à savoir, l' espace périvitelline et canal de Cuvier, pour étudier le comportement invasif et d'évaluer le potentiel de intravasculaire et extravasation des cellules cancéreuses du sein humain, respectivement.

Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

Suivi en direct des progéniteurs rétiniens WT individuels dans des contextes génétiques distincts permet l'évaluation de la contribution de la signalisation non-autonome cellule pendant la neurogenèse. Ici, une combinaison de knock - down de gènes, la génération par la transplantation d' embryons chimères et in vivo d' imagerie confocale time-lapse a été utilisé à cette fin.

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Nous décrivons un protocole de xénotransplantation dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre transparent qui est optimisé par une méthode de stadification simple et rapide. Les analyses post-injection comprennent la survie et l’évaluation de la charge de morbidité des cellules xénotransplantées par cytométrie en flux.

Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

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Découvrez l'analyse de la migration cellulaire in vivo par transplantation cellulaire et imagerie en temps réel chez l'embryon de zèbre Danio rerio. Cette méthode permet d'étudier le rôle des gènes candidats dans la biologie du développement.

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