en cours d'analyse In Vivo Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

L’objectif global de cette procédure est d’analyser la fonction d’un gène candidat dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo à l’aide d’une transplantation cellulaire combinée à l’imagerie en direct dans l’embryon de poisson zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la migration cellulaire, telles que la détermination du rôle et de l’importance de nouveaux gènes candidats dans la migration cellulaire in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle crée des embryons en mosaïque qui permet une bonne imagerie et une adénomyose cellulaire.

Pour préparer les aiguilles de transplantation cellulaire, utilisez un extracteur de micro-pipette pour tirer un capilaire en verre. Ensuite, à l’aide d’une microforge, coupez la pointe de l’aiguille à l’endroit où le diamètre intérieur est de 35 micromètres. À l’aide d’un microbroyeur, biseautez l’extrémité coupée du capillaire à un angle de 45 degrés.

Pour éliminer les résidus de verre, insérez l’aiguille dans un porte-aiguille monté sur une seringue, puis utilisez de l’acide fluorhydrique à 2 % pour rincer l’intérieur de l’aiguille trois fois en aspirant la solution vers l’intérieur et vers l’extérieur. Poursuivez en rinçant l’aiguille avec de l’acétone trois fois. Pour préparer des plats pour l’injection ou la greffe de cellules, préparez 1 % d’agarose en chauffant 50 millilitres de milieu embryonnaire contenant 0,5 gramme d’agarose au micro-ondes pendant une minute à pleine puissance.

Refroidissez le gel d’agarose à environ 60 degrés Celsius et versez tout le volume dans une boîte de Pétri de 90 millimètres. Insérez un moule pour créer des lignes d’injection ou pour créer des puits pour la transplantation cellulaire. Lorsque le gel d’agarose est pris, utilisez une pince pour retirer le moule.

Pour injecter des embryons de donneuse, à l’aide d’un stéréomicroscope, utilisez une pince pour presser doucement les embryons transgéniques collectés dans les lignes d’une boîte d’injection remplie de milieu embryonnaire. À l’aide d’une pince, orientez les embryons avec les cellules vers le haut, puis incubez la boîte à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que les embryons aient atteint le stade de quatre cellules. Ensuite, chargez une aiguille d’injection avec deux microlitres d’une solution d’injection préalablement préparée contenant le domaine de liaison à l’actine de la protéine de liaison à l’actine de levure 140 liée au cerisier.

Insérez ensuite l’aiguille dans un porte-aiguille fixé à un micromanipulateur et connecté à un transjecteur d’air. Ouvrez l’aiguille à l’aide d’une pince fine pour toucher doucement la pointe de l’aiguille ou en pinçant son extrémité. Insérez ensuite l’aiguille dans l’une des quatre cellules et injectez la solution pour remplir 70 % du volume cellulaire.

Injectez 30 embryons de la même manière. Lorsque les embryons ont atteint le stade de sphère, utilisez une pipette de pâturage en plastique pour transférer les embryons de coïde d’oie transgénique GFP de l’hôte et les embryons de donneurs précédemment injectés dans des boîtes de Pétri séparées de 35 millimètres recouvertes d’une agarose d’un millimètre dans un milieu embryonnaire et remplies d’un milieu embryonnaire Pen/Strep. À l’aide d’une pince à épiler fine, extrayez manuellement les embryons de leurs chorions.

Placez ensuite les embryons dans l’incubateur à 28 degrés Celsius. Lorsque les embryons ont atteint le stade du bouclier, au microscope fluorescent, sélectionnez les embryons de donneurs exprimant ABP140 mcherry à l’intérieur du bouclier vert. À l’aide d’une pipette de pâturage polie au feu, transférez les embryons hôtes dans une rangée de puits dans la boîte de transplantation cellulaire remplie de Pen/Strep EM. Placez ensuite les embryons de donneuses dans la rangée voisine.

Ensuite, avec un cil, orientez soigneusement les embryons avec le bouclier vers le haut. Ensuite, à l’aide d’un porte-aiguille attaché à une seringue, rincez la pointe de l’aiguille en aspirant et en expulsant 70 % d’éthanol. Séchez l’aiguille en aspirant de l’air à l’intérieur.

Lorsque l’aiguille est sèche, insérez-la dans le porte-aiguille relié à la seringue Hamilton, le biseau vers le haut. Pour effectuer une transplantation bouclier à bouclier, entrez dans le bouclier d’un embryon de donneur avec l’aiguille de transplantation et prélevez environ 10 à 20 cellules marquées avec ABP140 mcherry. Évitez soigneusement de dessiner le jaune.

Transplantez les cellules dans le bouclier de l’embryon hôte et répétez le transfert de cellules jusqu’à ce que tous les embryons hôtes aient été transplantés. Une fois la transplantation terminée, utilisez une pipette de pâturage polie au feu pour retirer tous les embryons endommagés. Incuber les embryons transplantés à 28 degrés Celsius pendant environ 30 minutes pour leur permettre de récupérer.

Pour transplanter des cellules prégénitrices à plaque préchordale unique après la déchorionation d’embryons, comme démontré précédemment, utilisez une pipette de pâturage polie au feu pour transférer trois embryons de donneurs dans une boîte de transplantation cellulaire remplie de bagues sans calcium Pen/Strep. À l’aide d’une pince à épiler fine, chaque embryon dissèque un explant contenant les cellules marquées ABP140 mcherry injectées et jette rapidement le reste des embryons. À l’aide d’un cil, remuez doucement les explants jusqu’à ce que les cellules se dissocient.

Ensuite, prélevez une seule cellule isolée dans l’aiguille de transplantation et transplantez-la dans le bouclier d’un embryon hôte, comme démontré plus tôt dans la vidéo. Pour un contrôle optimal de l’aspiration et de la transplantation, maintenez la séparation air/eau à environ 20 centimètres de l’extrémité de l’aiguille. Pour monter les embryons, remplissez un flacon à fond de verre avec un millimètre d’agarose chaud à 0,2 % dans EM. Placez le flacon à 42 degrés Celsius dans un bloc de chaleur.

Transférez un embryon sélectionné dans la solution d’agarose et jetez le milieu embryonnaire en excès de la pipette. Ensuite, aspirez l’embryon dans la pipette avec de l’agarose et transférez-le dans une chambre d’imagerie préalablement préparée avec une goutte d’agarose. Avant que l’agarose ne soit prise, utilisez un cil pour orienter l’embryon en plaçant la plaque préchordale de perspective vers le haut pour l’imagerie avec un microscope vertical, ou sur le fond de verre pour l’imagerie avec un microscope inversé.

Il y aura environ 40 secondes pour orienter l’embryon avant que le gel d’agarose ne durcisse en fonction de la température ambiante. Orientez rapidement l’embryon en manipulant le blastoderme plutôt que le jaune qui est très fragile. Une fois que tous les embryons sont montés et que l’agarose est fixée, utilisez Pen/Strep EM pour remplir la chambre afin d’éviter que les embryons ne se dessèchent.

Réalisez des expériences d’imagerie de cellules vivantes et de dynamique cellulaire selon le protocole de texte. La technique démontrée dans cette vidéo a été utilisée pour analyser le rôle de Sin1, l’un des composants clés du complexe TOR 2 dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo. Ce film montre la migration de cellules prégénitrices transplantées de la plaque préchordale.

Le marquage à l’actine permet de visualiser les protubérances cytoplasmiques riches en actine. L’analyse de la fréquence et de l’orientation a permis d’observer que les cellules de type sauvage produisent fréquemment de grandes protubérances cytoplasmiques, orientées dans la direction du pôle animal et de la migration. Comme le montre cette figure, la perte de fonction de Sin1 entraîne une réduction drastique du nombre de protubérances et une randomisation des protubérances restantes, démontrant l’importance de Sin1 dans le contrôle de la formation de protubérances riches en actine.

Il est intéressant de noter que le phénotype Sin1 peut être sauvé par l’expression d’une forme constitutivement active de Rac1, ce qui suggère fortement que TOR C2 contrôle la dynamique de l’actine et la formation de la protrusion cellulaire par Rac1. Cette technique a également été utilisée pour analyser le rôle de l’arpine, un inhibiteur du complexe ARP2/3 dans la migration cellulaire. Comme le montre ici, la perte de fonction de l’arpine entraîne une augmentation de la fréquence des saillies, due soit à une formation plus fréquente de protrusions, soit à une augmentation de la stabilité des saillies.

La mesure de la durée de vie des protubérances en l’absence d’arpin a révélé que la persistance temporelle des protubérances doublait, indiquant une augmentation de la stabilité. Une fois maîtrisée, la transplantation d’environ 30 embryons peut se faire en 45 minutes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder un œil sur le développement des embryons, car toutes les étapes sont chronométrées.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie confocale en direct peuvent être effectuées pour fournir une meilleure imagerie et répondre aux questions concernant l’organisation sous-cellulaire des éléments cytoscotiques, des marqueurs de polarité, des protéines d’addition ou de tout autre constituant cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les greffes de prégéniteurs de plaque préchordale pour analyser le rôle de tout gène candidat dans la migration cellulaire in vivo.